Verhalten von C. elegans bei Wahlmöglichkeit der Futterquelle

Um festzustellen, ob C. elegans für ihn gefährliche, d. h. evtl. toxische oder krankmachende Futterquellen meidet, wurde ein Experiment durchgeführt, bei dem C. elegans die Wahl zwischen E. coli OP50 und einem Stamm der Genomovare II, V, III sowie B. gladioli als Futterquelle ermöglicht wurde. Die Versuche wurden unter Standard-Slow-Killing-Bedingungen durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tab. 9 zusammengefasst. Die Daten in Klammern stellen die erwarteten Werte dar.

Tab. 9. Futterpräferenz von C. elegans unter Standard-Slow-Killing-Bedingungen bei Wahlmöglichkeit zwischen E. coli OP50 und B. gladioli 28496 SCV, B. gladioli 60732 WT, B. stabilis 196 bzw. B. multivorans 5441. Nach 5 Stunden Futteraufnahme wurde die Lokalisation der Würmer bestimmt. Die Daten sind Mittelwerte (Anzahl/Gesamtanzahl der Würmer) mit Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten mit jeweils Doppelwerten. Pro Platte wurden 20 bis 30 4. Larven eingesetzt. „E“ gibt den erwartungsgemäßen Anteil an der Gesamtzahl der Würmer im jeweiligen Bereich an.

Startposition zum Häufigkeit in E. coli OP50 Häufigkeit in B. gladioli

Zeitpunkt t0 = 0 nach 5 h 28496 SCV nach 5 h

Start hinter OP50 0,89 + 0,13 (E = 1,0) 0,05 + 0,06 (E = 0)

Start dazwischen 0,89 + 0,14 (E = 0,5) 0,06 + 0,09 (E = 0,5)

Start hinter 28496 SCV 0,71 + 0,16 (E = 0) 0,22 + 0,13 (E = 1,0)

Startposition zum Häufigkeit in E. coli OP50 Häufigkeit in B. gladioli

Zeitpunkt t0 = 0 nach 5 h 60732 WT nach 5 h

Start hinter OP50 0,92 + 0,12 (E = 1,0) 0,04 + 0,06 (E = 0)

Start dazwischen 0,84 + 0,12 (E = 0,5) 0,13 + 0,10 (E = 0,5)

Start hinter 60732 WT 0,23 + 0,26 (E = 0) 0,67 + 0,33 (E = 1,0)

Startposition zum Häufigkeit in E. coli OP50 Häufigkeit in B. stabilis

Zeitpunkt t0 = 0 nach 5 h 196 nach 5 h

Start hinter OP50 0,76 + 0,22 (E = 1,0) 0,20 + 0,19 (E = 0)

Start dazwischen 0,64 + 0,27 (E = 0,5) 0,20 + 0,13 (E = 0,5)

Start hinter 196 0,40 + 0,13 (E = 0) 0,53 + 0,09 (E = 1,0)

Startposition zum Häufigkeit in E. coli OP50 Häufigkeit in B.

multi-Zeitpunkt t0 = 0 nach 5 h vorans 5441 nach 5 h

Start hinter OP50 0,76 + 0,29 (E = 1,0) 0,24 + 0,29 (E = 0)

Start dazwischen 0,66 + 0,24 (E = 0,5) 0,32 + 0,20 (E = 0,5)

Start hinter 5441 0,07 + 0,10 (E = 0) 0,93 + 0,13 (E = 1,0)

Bei der Wahl zwischen E. coli OP50 und B. gladioli 28496 SCV wurde eine eindeutige Präferenz für E. coli deutlich; sogar bei Start hinter 28496 befanden sich nach fünf Stunden 71,0 % der Würmer in E. coli. Teilweise waren die im Impfstrich von B. gladioli 28496 SCV gefundenen Würmer tot. Die Präferenz für E.

coli zeigte sich aber auch bei Vergleich mit dem vergleichsweise avirulentem Stamm B. gladioli 60732 WT. Auch hier wurde OP50 eindeutig vorgezogen.

Auch B. stabilis 196, ein Stamm, der auf NGM I-Agarplatten ein Slow Killing von C. elegans auslösen kann, wurde von dem Nematoden bei Angebot von E. coli OP50 gemieden, obwohl sich bei Start hinter dem Impfstrich von B. stabilis 196 immerhin knapp die Hälfte der Würmer in B. stabilis fanden.

Bei Wahl zwischen B. multivorans 5441 und E. coli ergab sich ein ausgewogenes Bild. Bei Start hinter den jeweiligen Stämmen blieben die Nematoden in den betreffenden Kompartimenten der Platte und fraßen den „nächstgelegenen“ Stamm; bei Start in der Mitte der Platte wurde kein Stamm sonderlich bevorzugt.

5. DISKUSSION

5.1. Charakterisierung unterschiedlicher P. aeruginosa-Morphotypen im C.-elegans-Modell

Vor drei Jahren wurden erstmals Ergebnisse von Studien veröffentlicht, die ein C. elegans -Infektionsmodell zum Erkennen virulenzattenuierter P.-aeruginosa-Mutanten nutzten (MAHAJAN MIKLOS et al., 1999; TAN et al., 1999a). Die große Mehrheit der so identifizierten Bakterienmutanten erwies sich auch von reduzierter Virulenz im Mausmodell (MAHAJAN MIKLOS et al., 1999; TAN et al., 1999b).

Interessanterweise schien das Tötungspotential von P. aeruginosa stark von den äußeren Rahmenbedingungen abzuhängen. Beschrieben wurde ein Wurmsterben auf mit dem Stamm P.

aeruginosa PA14 bewachsenen Agarplatten von geringem Salzgehalt innerhalb von wenigen Tagen (TAN et al., 1999a), von TAN et al. (1999a) auch als Slow Killing bezeichnet. Bei Durchführung des identischen Experiments auf Agarplatten mit hohem Salzgehalt konnte hingegen ein deutlich schnelleres Wurmsterben innerhalb von 24 Stunden beobachtet werden (TAN et al., 1999a). DARBY et al. (1999) identifizierten zudem eine dritte Art des Wurmsterbens auf BHI-Agar; hierbei wurde bei Kultivierung auf mit P. aeruginosa PAO1 bewachsenen Agarplatten innerhalb weniger Stunden eine tödliche Paralyse von C. elegans herbeigeführt (DARBY et al., 1999). Verantwortlich für diese unterschiedlichen Tötungsarten schien eine Reihe von Virulenzfaktoren, die abhängig von den äußeren Rahmenbedingungen von P.

aeruginosa exprimiert wurden.

Aufgrund dieser Ergebnisse sollten aus dem Patientengut der Medizinischen Hochschule Hannover isolierte P. aeruginosa–Stämme und Stämme des B.-cepacia-Komplexes, sowohl Wildtypen als auch klonale SCVs, systematisch auf ihre Virulenz im C.-elegans-Infektionsmodell analysiert werden und das Verhalten der unterschiedlichen Morphotypen verglichen werden.

Analog zu den von O´QUINN et al. (2001) beschriebenen Versuchen zur Untersuchung unterschiedlicher Burkholderia spp. wurde ein sog. Reproduktionsassay etabliert, anhand dessen eine Abschätzung der unterschiedlichen Virulenz der einzelnen Stämme möglich schien. In diesem Assay lieferten nur wenige P.

aeruginosa-Stämme ähnliche Ergebnisse wie der als Vergleichsstamm herangezogene P. aeruginosa PA14; die große Mehrheit erwies sich als weitgehend apathogen, was sich in weitgehend uneingeschränkter Kondition oder Reproduktion der eingesetzten Würmer äußerte. Immerhin konnte beispielsweise bei Kultivierung des Wildtypen von P. aeruginosa 55 sowohl auf Slow- als auch auf Fast-Killing-Agar eine Absterbekinetik dokumentiert werden, die dem Absterbeverhalten von C. elegans auf P.

aeruginosa PA14 ähnelte. Die zugehörige klonale SCV erwies sich dagegen als avirulent.

Die Virulenz der untersuchten Stämme hängt im C.-elegans-Modell sehr von den experimentellen Umständen ab. So konnten beispielsweise die im normalen Slow- oder Fast Killing-Assay unauffälligen Morphotypen des Stammes P. aeruginosa 20265 unter den Versuchsbedingungen, unter denen DARBY et al. (1999) eine letale Paralyse von C. elegans auf dem Stamm P. aeruginosa PAO1 beobachtet hatten,

eine ähnliches Phänomen bei C. elegans auslösen. Auch hier verstarb bei Wildtyp und Revertante ein Großteil der Würmer in relativ kurzer Zeit. (vgl. Tab. 4). Da GALLAGHER u. MANOIL (2001) dieses Wurmsterben eindeutig der Zyanidproduktion von PAO1 zuordnen konnten, wurde exemplarisch die Zyanidproduktion einiger auffälliger Stämme mit drei Morphotypen bestimmt. Die klonalen Morphotypen SCV, Revertante und Wildtyp eines Stammes wiesen interessanterweise sehr unterschiedliche Werte auf;

teilweise sogar höhere Werte als der als Vergleichsstamm parallel untersuchte Stamm P. aeruginosa PAO1. Dennoch wurde im Paralytic-Killing-Assay ein im Vergleich zu PAO1 reduziertes Killing-Potential festgestellt. Ein hoher Wert in der Zyanidproduktion korrelierte in dieser Studie also nicht zwingenderweise mit einer hohen Sterberate der Nematoden im Paralytic-Killing-Assay. Die Ergebnisse des Paralytic-Killing-Assays bei Stämmen mit nachgewiesener Zyanidproduktion variierten sehr stark;

Stämme, die nachweislich kein Zyanid produzierten, waren im Paralytic-Killing-Assay allerdings auch immer avirulent. Es bleibt also zu untersuchen, ob eventuell weitere Virulenzfaktoren der untersuchten CF-Isolate bei der Zyanidproduktion unter den Bedingungen der letalen Paralyse beteiligt sind, die für PAO1 nicht massgeblich sind.

TAN et al. (1999a) konnten bei ihren Untersuchungen zum Slow Killing feststellen, dass P. aeruginosa PA14 nach 36 Stunden im Wurmintestinum zu akkumulieren beginnt. Nach 48 Stunden auf Slow-Killing-Agar ist im Wurmdarm eine intensive grüne Fluoreszenz von P. aeruginosa PA14/GFP feststellbar.

LABROUSSE et al. (2000) kamen bei ihren Untersuchungen mit Salmonella enterica enterica Serovar typhimurium zu ähnlichen Ergebnissen: Zunächst passierten nur wenige Bakterien den im Pharynx lokalisierten “Grinder“, der normalerweise zur Zerkleinerung der aufgenommenen Bakterien dient. Im weiteren Verlauf kam es nach Schädigung des Grinders nach fünf Tagen zu einer hochgradigen Akkumulation im restlichen Verdauungstrakt. Die dadurch bedingte Erweiterung des Darmlumens ging mit einer merklichen Abnahme an Intestinalzellen einher. Gleichzeitig wurden die Zellen innerhalb des Pharynx zerstört und durch pathogene Bakterien ersetzt, deren weitere Ausbreitung jedoch durch die den gesamten Pharynx umgebende Basalmembran verhindert wurde. Bei Kontrollversuchen mit E. coli OP50 behielten die Intestinalzellen ihre ursprüngliche Morphologie bei und der Pharynx blieb intakt.

Um herauszufinden, welche Auswirkungen die vom Wurm aufgenommenen Bakterien auf dessen Verdauungstrakt haben, wurden die Würmer nach 24-stündiger Futteraufnahme unter Slow-Killing-Bedingungen auf dem gfp-getaggten virulentem P. aeruginosa-Stamm 55 (pUT-gfp) WT, sowie auf der dazugehörigen apathogenen SCV im Fluoreszenzmikroskop untersucht. Zu beobachten war bei beiden Stämmen eine deutliche Fluoreszenz im Pharynx und im Grinder, im unteren Verdauungstrakt waren nur wenige Bakterien nachweisbar. Interessanterweise wiesen weder die auf dem Wildtyp, noch die auf der SCV kultivierten Würmer eine übermäßige Fluoreszenz im Darmlumen auf; zu einer Akkumulation schien es zu diesem Zeitpunkt in beiden Fällen nicht zu kommen. Ein sehr ähnliches Bild zeigte sich bei Untersuchung des gfp-markierten E. coli-Kontrollstammes (E. coli P Sunny 1); auch hier konnte nach 24 Stunden wohl eine Akkumulation bis zum Grinder, aber nur eine geringe Fluoreszenz einzelner Bakterien in den übrigen Darmabschnitten festgestellt werden (Abb. 6 A, B). Im Hinblick auf die Pathogenitätsmechanismen wirft dies natürlich weitere Fragen bezüglich des Tötungsmodus bei P.

aeruginosa 55 WT auf; fraglich ist, inwiefern Akkumulation des untersuchten Stammes im Nematodendarm zum Slow Killing beiträgt. Interessant wären Untersuchungen zu späteren Zeitpunkten und kurz vor Exitus der Würmer. Dahingehende Versuche wurden allerdings durch die Tatsache erschwert, dass die Würmer, im Gegensatz zu denjenigen auf den E. coli-Kontrollplatten, auf den Agarplatten des Wildtyps klein blieben und mit fortschreitender Versuchsdauer abstarben und zerfielen, was die Präparation für Fluoreszenzbilder erschwerte oder unmöglich machte.