Food Choice – Futterwahl von C. elegans

Ein großer Vorteil des Nematoden-Infektionsmodells im Vergleich zum Zellkulturmodell besteht darin, mit C. elegans einen lebenden Organismus zur Verfügung zu haben, der in der Lage ist, Stimuli der Umwelt zu empfangen und darauf mit observierbarem Verhalten zu reagieren. (DUSENBERY et al., 1975;

HEDGECOCK u. RUSSELL, 1975; WOLINSKY u. WAY, 1990). Um festzustellen, ob C. elegans in der Lage ist, für ihn pathogene Futterquellen zu vermeiden, wurde das Food-Choice-Experiment durchgeführt.

Bei vorgegebener Wahlmöglichkeit zwischen der üblichen Futterquelle E. coli OP50 und den für den Nematoden pathogenen Stämmen B. thailandensis und B. pseudomallei konnten O´QUINN et al. (2001) kein Vermeidungsverhalten bezüglich der beiden Stämme erkennen; C. elegans schien sie E. coli OP50 sogar leicht vorzuziehen.

In dieser Studie konnte für die im Slow-Killing-Assay deutlich virulenten Stämme B. gladioli 28496 SCV und B. stabilis 196, sowie ebenso für den apathogenen Stamm B. gladioli 60732 ein deutliches Vermeidungsverhalten von C. elegans beobachtet werden. Dies wirft wiederum die Frage auf, inwiefern rein olfaktorische und gustatorische Komponenten am Vermeidungsverhalten beteiligt sind. Fraglich ist auch, welche Rolle das Vermeidungsverhalten beim Slow Killing spielt, d. h. inwiefern eventuell auch eine reduzierte Futteraufnahme zur Absterbekinetik beiträgt. Von Interesse dürften Vergleichsexperimente mit C. elegans-Mutanten mit herabgesetzter „Grinder“-Aktivität sein. Stellvertretend für die apathogenen

Stämme des Genomovars II konnte keine Präferenz für einen der angebotenen Stämme E. coli OP50 und B. multivorans 5441 festgestellt werden.

5.4. Schlussfolgerungen

Die große Mehrheit der P.-aeruginosa-Stämme erwies sich im C.-elegans-Modell als attenuiert; nur wenige Stämme führten zu einem Absterben des Nematodenwie der in der Literatur beschriebene Stamm P. aeruginosa PA 14. Es konnten Unterschiede zwischen den klonalen Morphotypen eines Stammes festgestellt werden, wobei die Virulenz je nach Kulturbedingungen variierte.

Im In-vivo-Biofilm-Modell konnte eine Untergruppe von sechs SCVs identifiziert werden, die sich vom zugehörigen klonalen Wildtypen neben autoaggregativem Wachstum in Vogel-Bonner-Medium durch verstärkte Biofilmbildung im Mikrotiterassay unterschieden. Eine Einflussnahme auf die Biofilmbildung aller drei Morphotypen war durch Variation des Nährstoffangebotes generell möglich.

Bei Untersuchung der Burkholderia-Stämme konnten wie bei P. aeruginosa Pathogenitätsunterschiede zwischen den klonalen Morphotypen eines Stammes aufgezeigt werden (vgl. B. gladioli 28496 SCV bzw.

60732 WT). Unter Slow-Killing-Bedingungen war es mit Hilfe des Reproduktionsassays möglich, die Genomovare des B. cepacia Komplexes zu unterscheiden. Die Reproduktionsfähigkeit von C. elegans auf Vertretern des Genomovars II und V ähnelten der der Nematoden auf E. coli OP50; die Genomovare I und III schränkten dagegen die Reproduktionsfähigkeit von C. elegans deutlich ein oder führten sogar zu einem Absterben des Nematoden. Weiteren Untersuchungen muss es überlassen bleiben, die erwähnte Korrelation zum Mausmodell weiter zu verfolgen .

6. ZUSAMMENFASSUNG

Isabel Ziegler (2003): Virulenzanalyse unterschiedlicher Morphotypen von Pseudomonas aeruginosa und Spezies der Gattung Burkholderia

Chronische Infektionen der Lunge mit P. aeruginosa und Burkholderia spp., insbesondere mit Stämmen des B.-cepacia-Komplexes, werden als Hauptursache für Morbidität und Mortalität von Patienten mit Zystischer Fibrose angesehen. Langsam wachsende Subpopulationen, sog. „small colony variants“

(SCVs), sind von beiden Erregern bekannt und aus der Lunge von CF-Patienten isoliert worden. Die Bedeutung dieser SCVs ist unklar; Pathogenitätsunterschiede zwischen SCV und klonalem Wildtyp sind bisher kaum untersucht worden.

Ziel dieser Arbeit war es, mit Hilfe eines C.-elegans-Pathogenitätsmodells die Pathogenität unterschiedlicher Morphotypen von Pseudomonas aeruginosa und verschiedenen Spezies der Gattung Burkholderia, die aus CF-Patienten isoliert wurden, zu untersuchen. Bei Vertretern des B. cepacia Komplexes lag der Interessensschwerpunkt auf Pathogenitätsunterschieden zwischen den einzelnen Genomovaren. Die P. aeruginosa-Morphotypen wurden außerdem mit Hilfe eines Mikrotiterassays auf Unterschiede in der Biofilmbildungskapazität untersucht.

Überraschenderweise führten nur wenige der untersuchten CF-Isolate zu einem Slow- oder Fast Killing von C. elegans wie in der Literatur am Beispiel des Stammes P. aeruginosa PA14 beschriebenen. Die meisten der P. aeruginosa-Stämme, unabhängig vom Morphotyp, schienen ebenso avirulent zu sein wie die von C. elegans bevorzugte Futterquelle, E. coli OP50. Um Virulenzunterschiede zwischen diesen Stämmen dennoch detektieren zu können, wurde als Virulenzscreening ein 96-Stunden-Reproduktionsassay durchgeführt. Es zeigte sich, dass in diesem Assay bei einem Großteil der P.

aeruginosa-Wildtypen die Reproduktionsfähigkeit der Nematoden deutlich herabgesetzt war. In Einzelassays wurden einige Stämme genauer untersucht, um Absterbekinetiken zu erhalten. P.

aeruginosa 55 WT führte beispielsweise zu einem PA14 vergleichbaren Slow- und Fast Killing; die klonale SCV (17997) erwies sich auf beiden Agarplatten als nahezu avirulent. Virulenzunterschiede zwischen den klonalen Morphotypen waren sehr von den Versuchsbedingungen abhängig. Morphotypen eines Stammes, die sich im Slow- und Fast Killing-Assay als nahezu avirulent erwiesen hatten (bspw. P.

aeruginosa 20265 SCV) töteten C. elegans im Paralytic-Killing-Assay, einem Assay, bei dem die Zyanidproduktion mitverantwortlich für das Absterben von C. elegans ist. Bei der Zyanidproduktion zeigten sich deutliche Unterschiede zwischen den Morphotypen eines Stammes. Die Ergebnisse zeigten, dass eine Modifizierung der Versuchsbedingungen offenbar zur Expression unterschiedlicher Virulenzfaktoren führt.

Im Mikrotiterassay zur Bestimmung der Biofilmbildungskapazität konnte bei sieben von zwölf P.

aeruginosa-Stämmen mit jeweils drei Morphotypen eine erhöhte Biofilmbildung der SCVs im Vergleich zum Wildtyp beobachtet werden. Sechs dieser sieben biofilmbildenden SCVs zeigten zudem ein verstärkt autoaggregatives Wachstum in Vogel-Bonner-Medium und erwiesen sich als ausgesprochen beweglich

auf Twitching-Agarplatten. Dies korrelierte mit einer Hyperpilierung der betreffenden SCVs, was mit Hilfe der Elektronenmikroskopie bestätigt werden konnte.

Bei den zugehörigen klonalen Wildtypen war die Biofilmbildung deutlich reduziert; die Revertanten nahmen eine Mittelstellung ein. Außerhalb der autoaggregativen Subgruppe wiesen vier P. aeruginosa -Wildtyp-Stämme eine bessere Biofilmbildung auf; bei einem Stamm konnte bei keinem der drei Morphotypen eine nennenswerte Biofilmbildung festgestellt werden. Am Beispiel des Stammes P.

aeruginosa 20265 konnte durch Modifizierung des Mediums Einfluss auf die Biofilmbildung genommen werden; unabhängig vom Morphotyp konnte je nach Nährstoffangebot eine Zu- bzw. Abnahme der Biofilmbildung bei allen drei Morphotypen beobachtet werden.

Bei Burkholderia spp. konnte unter Slow-Killing-Bedingungen Pathogenitätsunterschiede zwischen den einzelnen Spezies bzw. zwischen den Genomovaren beobachtet werden. Im Reproduktionsassay zeigte C. elegans auf B. cepacia Genomovar IIund V eine normale Entwicklung und Reproduktion; Genomovar I und III sowie B. gladioli als Futterquelle führten zu reduzierten Reproduktionsraten oder sogar zum Tod von C. elegans. Wie bei P. aeruginosa schien die Virulenz stark von den Versuchsbedingungen abzuhängen. Stämme, die sich unter Slow-Killing-Bedingungen als virulent erwiesen, konnten auf PGS-Agar kein Fast Killing von C. elegans auslösen und umgekehrt (vgl. B. stabilis 196). Unterschiede zwischen den klonalen Morphotypen gab es auch hier. Bei B. gladioli 28496 SCV konnte beispielsweise nicht nur ein Slow Killing, sondern auch ein exotoxinvermitteltes Fast Killing von C. elegans auf mit der SCV bewachsenem Agar festgestellt werden; der klonale Wildtyp 60732 erwies sich als weitgehend avirulent.

Diese Arbeit zeigt, dass das C.-elegans-Modell geeignet ist, Virulenzunterschiede nicht nur zwischen verschiedenen Stämmen, sondern auch zwischen klonalen Varianten (Morphotypen) von P. aeruginosa und Burkholderia spp zu identifizieren. Durch eine weitere Modifizierung der Versuchsbedingungen sollte es zukünftig gelingen, Pathogenitätsmechanismen bei Stämmen zu identifizieren, die unter den bisherigen Bedingungen avirulent sind. Diese Arbeiten können eine Grundlage für z. B. ein Mutantenscreening darstellen, um auf diesem Wege neue Virulenzfaktoren mit potentieller Bedeutung für Mensch und Tier zu identifizieren.

SUMMARY

Isabel Ziegler (2003): Virulence analysis of different morphotypes of Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia spp.

Lung infections due to P. aeruginosa and Burkholderia spp., especially strains of the B. cepacia complex, are regarded as one of the major causes of morbidity and mortality in patients with cystic fibrosis. Slow-growing subpopulations termed small-colony variants (SCVs) are known from both of these bacterial pathogens and have been isolated from the lungs of CF-patients. Even though the role the SCVs play during infection is still not quite clear; there has hardly been any research regarding the differences in pathogenicity of SCV and clonal wild type.

The aim of this study was to investigate the pathogenicity of different morphotypes of P. aeruginosa and Burkholderia spp. cystic fibrosis isolates using a C. elegans pathogenesis model. Regarding Burkholderia spp., the main interest was focussed on differences in pathogenicity between the genomovars.

Concerning P. aeruginosa, the biofilm forming capacity of the Pseudomonas morphotypes was determined using a microtiter assay.

Surprisingly, only a few of the CF isolates analysed led to a slow or fast killing of C. elegans similar to the one described in the literature for P. aeruginosa PA14. Most of the P. aeruginosa strains, regardless of their morphotype, seemed to be as harmless as the nematode´s preferred food source E. coli OP50.

Nevertheless, to be able to detect differences in virulence between these strains, they were screened for virulence in a 96 hours reproduction assay. In this assay, many of the P. aeruginosa wild types clearly restrained the nematodes´ ability of reproduction. Several strains were analysed in separate assays to receive detailed killing kinetics. For example, the wild type of P. aeruginosa 55 led to a slow and fast killing of C. elegans comparable to PA14; the clonal SCV proved to be almost non-virulent on both slow and fast killing agar plates. Differences in virulence between the clonal morphotypes were clearly culture condition-dependent. Morphotypes of a strain, that proved to be non-virulent in slow and fast killing assays (e. g. P.

aeruginosa 20265 SCV) killed C. elegans in a paralytic killing assay where production of cyanide is responsible for C. elegans killing. Regarding cyanide production there were distinct differences between the single morphotypes of a strain. These results reveal that modification of the culture conditions induces the expression of different virulence factors.

In a microtiter assay researching the biofilm forming capacity, in seven out of twelve P. aeruginosa strains with three morphotypes an increased biofilm formation of the SCVs compared to the wild type could be observed. Six of these seven biofilm forming SCVs showed autoaggregative growth behaviour in Vogel-Bonner media and revealed an increased motility on twitching agar plates. This was correlating with hyperpilation of these SCVs which was confirmed by electron microscopy.

In comparison, biofilm formation of the wild type strains was clearly reduced; the revertants showed an intermediate behaviour. Apart from the subgroup of these autoaggregative strains there were four P.

aeruginosa wild type strains that formed a better biofilm than the clonal SCV; the morphotypes of one

strain formed no biofilm at all. By modification of the media influence was taken on the biofilm formation of strain P. aeruginosa 20265; depending on the availability of nutrients an increase resp. decrease of biofilm formation of all three morphotypes was observed.

Regarding Burkholderia spp., differences in pathogenicity between the species resp. genomovars could be observed under slow killing conditions. In the reproduction assay, C. elegans feeding on B. cepacia genomovar II and V showed normal development and reproduction, while feeding on genomovar I and III as well as feeding on B. gladioli led to reduced reproduction rates or even death of C. elegans. As in P.

aeruginosa, virulence was strongly culture-dependent. Strains that proved to be virulent under slow killing conditions, were unable to kill C. elegans on fast killing agar and vice versa (e. g. B. stabilis 196). In addition, there were differences between clonal morphotypes. For example, on agar plates with B. gladioli 28496 SCV not only a slow killing of C. elegans but also an exotoxin-mediated fast killing could be observed; the clonal wild type proved to be nearly non-virulent.

This study shows that the C. elegans model is a useful model to detect differences in virulence not only between different strains, but also between different clonal variants (morphotypes) of P. aeruginosa and Burkholderia spp. By further modifying the culture conditions there should be a possibility to identify mechanisms of pathogenicity in the strains that have been non-virulent so far. This could be a basic principle for a mutant screening approach with the aim to identify new virulence factors potentially important for man and animal.

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