Bedeutung von ROI bei der Bekämpfung von Burkholderia pseudomallei

Da NO vor allem auf dem genetischen Hintergrund von C57Bl/6-Mäusen keine Rolle bei der Bekämpfung von intrazellulärem Burkholderia pseudomallei spielt, sollte die zweite bedeutende Komponente der intrazellulären Abtötung in Makrophagen, die Sauerstoffradikale, untersucht werden.

Sauerstoffradikale werden im angloamerikanischen Sprachgebrauch als Reactive Oxygen Intermediates (ROI) bezeichnet. Dieser Begriff bezieht sich auf die intermediären Reaktionsprodukte von Sauerstoff, nämlich Superoxide, Wasserstoffperoxid und Hydroxylradikale sowie Reaktionsprodukte dieser mit Aminen und Haliden. Generell können diese von allen aeroben Zellen produziert werden. Die Phagozyten von Säugetieren sind allerdings auf eine besonders hohe Produktion von ROI spezialisiert, wobei polymorphkernige Leukozyten die höchste und Makrophagen die zweithöchste Kapazität zur Produktion und Freisetzung von

ROI besitzen (Nathan & Shiloh 2000). Produziert werden ROI von der NADPH-Oxidase, welche in der Plasmamembran verankert ist und die aus sechs

verschiedenen katalytischen Untereinheiten besteht. Beim Defekt einer dieser Untereinheiten ist das Enzym funktionsunfähig, wie es zum Beispiel bei der Erkrankung der Chronischen Granulomatose der Fall ist (Vignais 2002). Ferner gibt es Hinweise, dass ROI neben der Funktion der intrazellulären Abtötung von Pathogenen auch an der Modulation der Entzündungsantwort durch eine Anlockung von Neutrophilen Granulozyten und Induktion der Zytokinproduktion beteiligt sind.

Diese widerum sind abhängig vom globalen Transkriptionsfaktor NF-κB (Forman &

Torres 2002).

Die Bedeutung von ROI in der Bekämpfung von Burkholderia pseudomallei ist bislang kaum untersucht. Lediglich in den Untersuchungen von Miyagi wurde ein geringer Einfluss auf die Bekämpfung von intrazellulären Burkholderia pseudomallei in J774.A1-Makrophagen nach einer Hemmung der Produkte der ROI durch Katalase und Superoxiddismutase beschrieben (Miyagi et al. 1997). Für Burkholderia cepacia, einem weniger pathogenen Verwandten von Burkholderia pseudomallei und einem

der Hauptpathogene der Chronischen Granulomatose, konnte eine Resistenz gegen extrazelluläre ROI, aber eine in Abhängigkeit vom Stamm hohe Variabilität in der Suszeptibilität gegenüber intrazellulären ROI festgestellt werden (Lefebre & Valvano 2001). Ferner spielen ROI die essenzielle Rolle bei der Bekämpfung von Burkholderia cepacia in vivo, wo gezeigt werden konnte, dass Mäuse mit einem Defekt in der Produktion von ROI (p47^phox-Knock-out) nach Infektion mit Burkholderia cepacia verstarben, während ein iNOS-Knock-out keinen Einfluss auf den Verlauf der Infektion hatte (Segal et al. 2003).

Auch bei anderen Infektionserregern spielen ROI eine wichtige Rolle bei der Wirtsabwehr. So konnte gezeigt werden, dass die Produktion von ROI essenziell für eine Bekämpfung von Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus und Aspergillus fumigatus ist und den Verlauf von Infektionen mit Listeria monozytogenes und Mycobacterium tuberculosis ungünstig beeinflusst (Nathan & Shiloh 2000).

Aus diesem Grund sollte in dieser Studie auch die Bedeutung von ROI für die Wirtsabwehr bei Infektionen mit Burkholderia pseudomallei untersucht werden. Dabei sollte zunächst geklärt werden, welchen Einfluss ROI auf die intrazelluläre Bekämpfung von Burkholderia pseudomallei besitzen. Zu diesem Zweck wurden Mäuse mit einem Knock-out für die katalytische Untereinheit p47^phox des NADPH-Oxidase Komplexes verwendet.

Es konnte gezeigt werden, dass auch das Fehlen von ROI die bakterizide Kapazität der Zellen nicht beeinflusst. Die Erklärung dafür liegt möglicherweise darin, dass vitale Burkholderia pseudomallei in der Lage, sind eine Freisetzung der ROI zu verhindern oder durch die bakterielle Katalase die Reaktionsprodukte der Radikale wie Wasserstoffperoxid abzubauen. Kürzlich konnte die durch oxidativen Stress induzierte Hochregulation des Gens katG durch den funktionellen Regulator Oxy A in Burkholderia pseudomallei nachgewiesen werden. KatG ist ein bifunktionales Enzym, das als Katalase und Peroxidase fungiert, und eine wichtige Rolle beim Schutz des Keims vor ROI spielt (Loprasert et al. 2003b). Einen Hinweis darauf liefern auch die nicht nachweisbaren Wasserstoffperoxide nach Infektion mit vitalen Burkholderia

pseudomallei, während inaktivierte Bakterien sehr wohl zu messbaren

H2O2-Konzentrationen führen. Es ist also möglich, dass ROI unter Infektionsbedingungen nur in geringem Maße in die intrazelluläre Abtötung eingreifen können.

Überraschender Weise zeigten Untersuchungen in vivo, bei denen die Mortalität von Mäusen mit einem Knock-out für p47^phox mit C57Bl/6-Wildtyptieren nach einer Infektion mit Burkholderia pseudomallei verglichen wurde, einen bedeutenden Einfluss der ROI. Ein Fehlen von ROI resultierte dabei in einer dramatisch beschleunigten und erhöhten Mortalität der p47^phox-Knock-out Tiere. Dieses gibt einen Hinweis auf eine Rolle von ROI in vivo, die unabhängig von der direkten Funktion der intrazellulären Abtötung ist und womöglich eher die oben genannten regulatorischen Aufgaben beinhaltet.

5.5. NO und ROI; redundante Mechanismen bei der Bekämpfung von Burkholderia pseudomallei?

Da es sich bei der Freisetzung von NO und ROI um redundante Systeme handelt, von denen angenommen wird, dass beim Fehlen des einen Effektors der andere einspringt, kann nicht ausgeschlossen werden, dass dieser Mechanismus auch in diesem Fall greift. Diese These wird vor allem dadurch gestützt, dass Mäuse mit einem Knock-out beider Komponenten mit großer Inzidenz an spontan erworbenen Infektionen mit kommensalen Organismen versterben, während dieses bei Tieren mit nur einem Knock-out kaum vorkommt (Shiloh et al. 1999). In der gleichen Studie wurde der Einfluss von Infektionen mit Salmonellen und Listerien auf Tiere mit diesem Doppel-Knock-out im Vergleich zu den jeweiligen Einzel-Knock-outs und dem Wildtyp in vivo und an Knochenmarkmakrophagen untersucht. Dabei konnte festgestellt werden, dass ROI vor allem für die Bekämpfung der Infektion mit Salmonella in vivo und in vitro von Bedeutung sind. Mäuse sowie Zellen mit einem Doppel-Knock-out konnten eine Infektion aber am schlechtesten abwehren. Bei Infektionen mit Listerien dagegen übernahm NO die Hauptaufgabe in der Bekämpfung der Infektion während, zwischen gp91^phox-Knock-out und Wildtyp kein Unterschied bestand. Hier war die Infektionsabwehr in der Gruppe der infizierten

Doppel-Knock-out-Tiere nicht eindeutig. Während die eine Hälfte Keimzahlen entsprechend denen des Wildtyps besaß, zeigten die anderen Tiere signifikant höhere Keimzahlen. Im Gegensatz dazu war auf Ebene der Knochenmarkmakrophagen die intrazelluläre bakterizide Aktivität bei gp91^phox -Knock-out und dem Doppel-Knock--Knock-out schlechter als beim iNOS Knock--Knock-out allein. Diese Studie zeigt, dass die Bedeutung von NO und ROI in vivo mit ihrer Bedeutung für die Makrophagenfunktion übereinstimmen kann, wie bei Salmonella, aber nicht muss, wie es bei Listeria der Fall ist.

Ausreichende Klarheit über die Rolle von NO und ROI bei der Bekämpfung von Burkholderia pseudomallei-Infektionen können also nur in Versuchen in vivo und in vitro vergleichend mit iNOS-Knock-out, funktionellem NADPH-Oxidase Knock-out und einem Doppel-Knock-out von iNOS und NADPH-Oxidase erzielt werden.

Die bisherigen Ergebnisse können aber auch durchaus so gedeutet werden, dass beide Komponenten bei C57Bl/6-Mäusen eine untergeordnete Rolle spielen, beziehungsweise in ihrer Abwesenheit andere Mechanismen die Steuerung der intrazellulären Abtötung von Burkholderia pseudomallei übernehmen. Andererseits ist es möglich, dass NO und ROI generell nur einen geringen Einfluss auf Burkholderia pseudomallei besitzen, zumal auch Burkholderia pseudomallei seine Resistenzmechanismen der jeweiligen intrazellulären Situation anpassen kann.

Beispielsweise führt ein Knock-out des Gens für Katalase/Peroxidase katG in Burkholderia pseudomallei zu einer OxyA induzierten kompensatorisch erhöhten Expression des Alkyl-Hydroperoxidase-Reduktase-Gens ahpA, was eine Protektion gegenüber NO induziert (Loprasert et al. 2003a).

Jedoch können so nicht die Unterschiede auf der Wirtsseite erklärt werden. Alternativ zu NO und ROI kommen hier zum Beispiel auch lysosomale Proteine, hydrolytische Enzyme, Cathepsin B sowie Proteine und Peptide, die in der Lage sind Mikroorganismen zu binden und bakterielle Prozesse und Strukturen zu stören, wie etwa das bakterizide Permeabilität-erhöhende-Protein, in Frage (Thomas et al.

1988b).

5.6. Rolle von IFNγ bei Burkholderia pseudomallei Infektionen von