Antikörper

3.4.1. Bestimmung der Antikörperkonzentration mittels ELISA

Antikörperkonzentrationen in Zellkulturüberständen und in aufgereinigten Suspensionen wurden mittels isotypspezifischem Sandwich ELISA bestimmt.

96 well Mikrotiterplatten wurden mit dem jeweiligen Isotyp (5µg/ml PBS und 10 µl pro well) beschichtet und für mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.

Die Platten wurden anschließend ausgeschlagen und zweimal mit PBS gewaschen.

Eine Absättigung unspezifischer Proteinbindungsstellen erfolgte mit 125 µl/well 1%

bovinem Serum Albumin (BSA) in PBS für 30 min bei Raumtemperatur. Danach wurde das BSA abgeschlagen und wiederum zweimal mit PBS gewaschen.

Zur Konzentrationsbestimmung wurde ein entsprechender Isotyp-Standard mit einer Konzentration von 100 ng/ml ausgehend eingesetzt und in einer 1:2-Verdünnungs-reihe in BSA aufgetragen. Die zu bestimmende Suspension wurde nach entsprechender Vorverdünnung in BSA ebenfalls in einer 1:2-Verdünnungsreihe aufgetragen. Dabei wurden von Standard und Probe jeweils 20 µl/well eingesetzt und für mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden anschließend ausgeschlagen und zweimal mit PBS gewaschen.

Als Sekundärantikörper wurde ein an Biotin gekoppelter Antikörper mit Spezifität des jeweiligen Isotyps in einer Verdünnung von 1:1000 bis 1:2000 (je nach Antikörper) verwendet und mit 20 µl/well für mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.

Nach diesem Schritt wurde ebenfalls zweimal mit PBS gewaschen.

Zur Entwicklung des ELISA´s wurde mit Streptavidin β-Galactosidase 1:2400 in BSA

für 25–30 min inkubiert und nach nochmaligem Waschen mit PBS 50 µl/well 4-Methylumbelliferyl-β-Galactopyranosid (MUG) dazugegeben.

Die Messung der Fluoreszenz wurde im Titertec Fluoscan II bei einer Extinktion von 355 nm und einer Emission von 460 nm durchgeführt. Die Auswertung erfolgte mithilfe des Programms Mikrowin.

3.4.2. Bestimmung der Antikörperkonzentration mittels Proteinbestimmung nach Bradford

Gesamtproteinmengen wurden in aufgereinigten Antikörpersuspensionen mithilfe der Methode nach Bradford bestimmt. Dafür wurde ein bovines γ-Globulin als Standard in einer Konzentration von 200 µg/ml bis 25 µg/ml in PBS eingesetzt. Die Proben wurden nach entsprechender Vorverdünnung in PBS in einer 1:2-Reihe vorbereitet.

Jeweils 20 µl von Standard und Probe wurden in einer 96 well Mikrotiterplatte aufgetragen. Zu der Probe und dem Standard wurden anschließend 200 µl/well Bradford Reagenz gegeben und die Messung im Multiscan MCC/340 Messfilter 620 nm und Referenzfilter 492 nm durchgeführt und dem Programm Mikrowin ausgewertet.

3.5. Makrophagen Invasions- und Bakterizidie-Assays

3.5.1. Makrophagen Invasions-Assay: Antikörper-vermittelte Phagozytose

Zur Ermittlung der Steigerung der Phagozytosekapazität von primären Knochenmarkmakrophagen durch opsonisierende Antikörper wurden 8–10 Tage alte Knochenmarkmakrophagen in 48 well Platten für adhärente Zellen am Tag vor Versuchsbeginn ausgesät.

Dazu wurden die Zellen wie folgt geerntet: Nach Abnehmen des kompletten Mediums wurden die Zellen mit etwa 5 ml PBS pro Flasche zweimal gewaschen.

Anschließend wurden pro Flasche 2 ml Trypsin-EDTA zugegeben, die Flasche kurz geschwenkt und das Trypsin-EDTA bis auf einen Rest von 0,5 ml wieder abgenommen und für 10 Minuten bei 37 °C und 5% CO2 inkubiert. 5 ml Medium wurden pro Flasche auf die Zellen gegeben und diese mit einem Zellschaber vorsichtig gelöst. Die Zellen wurden mithilfe der Neubauer Zählkammer gezählt (siehe 3.3.3) und bei 4 °C und 150 g 10 min abzentrifugiert. Anschließend wurden die Zellen in RPMI Medium aufgenommen und mit 1,8x10⁵ Zellen/400 µl ausgesät und über Nacht bei 37 °C und 5% CO2 inkubiert.

Am Tag des Versuchs wurde das Medium aus den wells abgenommen und die Makrophagen zweimal mit je 500 µl PBS gewaschen. Die Infektion mit opsonisierten Bakterien bzw. Kontrolle erfolgte durch Exposition der Zellen mit infiziertem Medium.

Dazu wurden zunächst auf Columbia Platte angezogene Burkholderia pseudomallei WT E8 mit einem sterilen Wattestäbchen in PBS zu einer OD von 0,2–0,4 suspendiert und die Keimzahl dieser Suspension anhand einer Eichkurve nach photometrischer Messung bei 650 nm bestimmt. Die gewünschte Bakterienzahl wurden dann zum RPMI Medium gegeben. Zur Bestimmung Antikörper-vermittelter Phagozytose wurden die jeweiligen Antikörper sowie unspezifische Kontrollantikörper in einer Konzentration von 1 µg/ml zugegeben.

Die Infektion erfolgte durch Zugabe von 400 µl dieses Mediums pro well und Inkubation für 30 min bei 37 °C und 5% CO2. Im Anschluss an diese Infektionszeit wurde das Medium wieder abgenommen und die Zellen zweimal mit je 500 µl PBS gewaschen. Zur Abtötung verbliebener extrazellulärer Bakterien erfolgte eine einstündige Inkubation (37 °C und 5% CO2) mit 400 µl/well RPMI, das 250 µg/ml Kanamycin enthielt. Danach wurde das Medium abgenommen und wiederum zweimal mit 500 µl PBS gewaschen. Um eine Lyse der Zellen herbeizuführen und eine Freisetzung der nun ausschließlich intrazellulären Bakterien zu erreichen wurde, in jedes well 150 µl Tergitol 1% gegeben. Nach einer anschließenden Inkubation von 20 min bei 37 °C und 5% CO2 wurde das Tergitol nach kräftigem Mischen aus den wells in 1 ml Reagiergefäße überführt und die Keimzahl über Verdünnungsreihen und CFU Zählung auf Müller-Hinton Agar-Platten bestimmt (siehe 3.1.4). Die absolute intrazelluläre Keimzahl pro well wurde durch folgende Rechnung ermittelt:

gezählte Kolonien x Verdünnungsfaktor x 1,5

Die exakte Infektionsdosis wurde aus dem mit Bakterien eingestellten Medium ebenfalls durch CFU-Bestimmung ermittelt.

3.5.2. Makrophagen Bakterizidie-Assay IFNγ-stimulierter und unstimulierter Zellen

Zur Durchführung von Makrophagen Bakterizidie-Assays wurden die Zellen entsprechend 3.5.1. geerntet und ausgesät. Je nach Versuchsanforderungen wurde dem Medium beim Aussäen der Zellen 50 U/ml IFNγ zugegeben.

Die Infektion der Makrophagen erfolgte entsprechend dem Protokoll der Phagozytose-Assays (3.5.1.). Nach der Infektion wurde auch hier kanamycinhaltiges Medium auf die Zellen gegeben, um eine extrazelluläre Replikation der Bakterien und Reinfektion der Zellen auszuschließen. Zu den gewünschten Zeitpunkten nach der Infektion wurde das Medium abgenommen, die Zellen zweimal mit 500 µl PBS gewaschen, mit Tergitol lysiert und eine CFU-Bestimmung vorgenommen (siehe 3.5.1.) Als Nullstundenwert wurde dabei die intrazelluläre Keimzahl nach Infektion und einstündiger Inkubation mit kanamycinhaltigem Medium bezeichnet.

3.5.3. Makrophagen Bakterizidie-Assay: Hemmung der induzierbaren NO-Synthase (iNOS)

Um primär eine Induktion von iNOS zu erreichen, wurde dem Medium beim Aussäen der Zellen 50 U/ml INFγ zugesetzt. Zur Hemmung der induzierbaren NO-Synthase der Makrophagen wurde das Medium beim Aussäen und später bei der Inkubation unter Kanamycin zusätzlich mit 1mM Aminoguanidin versetzt, während den Kontrollen kein Aminoguanidin zugegeben wurde.

Das Protokoll der Keimzahlbestimmung entspricht der unter 3.5.1. und 3.5.2.

beschriebenen Methode.

3.6. Infektion und passive Immunisierung im Mausmodell

3.6.1. Infektions- und Immunisierungsrouten 3.6.1.1. Intranasale Infektion und Immunisierung

Für intranasale Infektionen und passive Immunisierungen wurden die Bakterien aus dem in der Keimzahl bestimmten Stock aufgetaut und in PBS bis zur gewünschten Infektionsdosis verdünnt. Dieser Bakteriensuspension wurde der jeweilige Antikörper in einer Konzentration, die in allen Versuchen 10 µg pro Maus entsprach, zugegeben. Die Tiere wurden narkotisiert und durch Nackengriff fixiert. Die Applikation von Bakterien und Antikörpern erfolgte in einem Gesamtvolumen von 20 µl, das von den Tieren gleichmäßig über beide Nasenlöcher aspiriert wurde.

3.6.1.2. Intratracheale Infektion und Immunisierung

Die Bakterien/Antikörper-Suspensionen wurden entsprechend den intranasalen Immunisierungsversuchen vorbereitet (siehe 3.6.1.1.). Die Tiere wurden narkotisiert und auf einer Styroporunterlage fixiert. Zunächst wurde ein kleiner Hautschnitt am Hals in Längsrichtung durchgeführt und die der Trachea anliegende Muskulatur mit einer Pinzette gespreizt, sodass die Trachea frei lag. Ein Venenverweilkatheter der Größe 22G/1 wurde in die Trachea eingeführt und nach Entfernen des Mandrins ein Volumen von 20 µl der Bakterien/Antikörper-Suspension verabreicht, die von den Mäusen aspiriert wurde. Um Reste der Suspension aus dem Katheter zu entfernen, wurden mit einer Pipette 100 µl Luft durch den Katheter appliziert. Nach Entfernen des Katheters wurde der Hautschnitt mit einem monofilen Polypropylenfaden der Stärke 6/0 verschlossen.

3.6.1.3. Intravenöse Immunisierung und Infektion

Bei der intravenösen Immunisierung wurden 200 µg Antikörper pro Tier in einem Volumen von jeweils 200 µl in die laterale Schwanzvene der Mäuse mit einer Kanüle (27G) injiziert. Eine Dilatation der Venen wurde dabei durch Wärmeapplikation induziert. Die Tiere wurden 8 Stunden nach der Immunisierung intranasal mit einem Volumen von 20 µl Bakteriensuspension infiziert.

3.6.2. Untersuchung der Mortalität

Die Untersuchungen der Mortalität wurden lediglich nach intranasaler Infektion und Immunisierung durchgeführt. Dabei wurden der Zeitpunkt und die Anzahl verstorbener Tiere nach Infektion protokolliert. Der Zeitraum der Untersuchung erstreckte sich dabei über 14 Tage post infectionem.

3.6.3. Keimzahlbestimmung in Organen infizierter Tiere

Keimzahlbestimmungen wurden in Lunge, Leber und Milz infizierter und immunisierter Tiere durchgeführt. Dazu wurden die Tiere 48 Stunden post infectionem durch Genickbruch getötet, auf einer Styroporunterlage fixiert und mit 70%igem Ethanol eingesprüht. Das Fell wurde zunächst im Bereich des Bauch- und Brustraums entfernt und das Tier nochmals mit Ethanol desinfiziert. Danach wurde das Peritoneum eröffnet, die Milz entfernt und in 500 µl Tergitol 1% überführt. Die Leber wurde entfernt und in 1 ml Tergitol 1% gelegt. Nach Eröffnung des Thorax wurde auch die Lunge entnommen und in 500 µl Tergitol 1% überführt. Anschließend wurden alle Organe im Tergitol mit einem Organhomogenisator (Ultra Turrax) zu einer homogenen Suspension zerkleinert. Im Anschluss wurden die Organgewichte durch Wiegen der Proben und Abzug des zuvor bestimmten Leerwertes ermittelt. Die Bestimmung der Keimzahl erfolgte mittels CFU-Bestimmung auf Ashdown Agar-Platten, die für ca. 48 Stunden bei 37 °C bebrütet wurden. Zur Berechnung der Keimzahl wurde die gezählte CFU mit dem Verdünnungsfaktor, dem Organgewicht in mg und der eingesetzten Menge Tergiol in ml multipliziert.

3.6.4. Neutralisation von IFNγ in vivo

Für diesen Versuchsansatz wurde IFNγ durch intraperitoneale Applikation von 300 µg des gegen murines IFNγ gerichteten Antikörpers R4-6A2 inhibiert. Als Kontrolle wurde ein gleiches Volumen PBS bzw. 300 µg γ-Globulin von Ratten intraperitoneal verabreicht. Die Infektion erfolgte 6 Stunden nach Applikation des Antikörpers durch intranasale Gabe der gewünschten Infektionsdosis.

Die Untersuchung der Mortalität und die Bestimmung der Keimzahl der inneren Organe erfolgte wie unter 3.6.3. und 3.6.4. beschrieben.

3.6.5. Statistische Auswertung der in vivo-Versuche

Die statistische Auswertung der Keimzahlbestimmungen der inneren Organe erfolgt mit dem Student t-Test, sofern eine Normalverteilung der Werte vorlag. Waren die Werte jedoch nicht normalverteilt, wurde der Mann-Whitney Rank Sum Test eingesetzt. Die Auswertung der Mortalitätsexperimente erfolgt mit dem Programm SPSS durch Anwendung der Statistik für Kaplan Meier Überlebenskurven.

3.6.6. Histopathologische Untersuchung von Organen infizierter Mäuse

Die Sektion der Tiere und Entnahme der Lungen erfolgte analog zu der Präparation der Organe für die Keimzahlbestimmung (siehe 3.6.3.). Die entnommenen Organe wurden in 4% Formalin gelegt und für mindestens 4 Stunden fixiert. Danach wurden die Lungenlappen getrennt (rechte Lunge 4 Lappen; linke Lunge ein Lappen) und in Einbettkapseln gegeben. Dabei wurde für rechte und linke Lunge jeweils eine Einbettkapsel verwendet. Die Einbettkapseln wurden in 60% Ethanol gelegt. Die Köpfe wurden im Bereich der ersten Halswirbel vom Rumpf getrennt, das Fell vollständig entfernt und dann ebenfalls in 4% Formalin gelegt und für mindestens vier Stunden fixiert. Danach wurden die Schädel zum Entkalken für mindestens fünf Stunden in Dekalzifizierer gelegt. Anschließend war es möglich, Querschnitte durch die Nase von 2 bis 3 mm Dicke durchzuführen. Pro Schädel wurden 4 Querschnitte

angelegt. Diese 4 Schnitte wurden in eine Einbettkapsel überführt und in 60% Ethanol gelegt. Die weitere Bearbeitung der Organe (Anfertigung der Schnitte

und HE-Färbung) erfolgte in Kooperation mit Prof. K. Kamino (Institut für Pathologie der Medizinischen Hochschule Hannover). Die gefärbten Präparate wurden mikroskopisch bei unterschiedlichen Vergrößerungen (x63 bis x630) beurteilt.