Bedeutung von NO bei der Bekämpfung einer Infektion mit Burkholderia pseudomallei in

Bevor die Funktion von NO bei der intrazellulären Bekämpfung untersucht wurde, wurde zunächst die Fähigkeit von Burkholderia pseudomallei zu NO-Stimulation bestimmt. In der Literatur ist Burkholderia pseudomallei im Vergleich zu anderen Erregern als schlechter NO-Stimulator bekannt. Es wird beschrieben, dass NO-vermittelte Bakterizidie in RAW 264.7 Makrophagen nur nach vorheriger Stimulation der Zellen mit IFNγ oder einer Costimulation mit IFNβ stattfand (Utaisincharoen et al. 2003; Utaisincharoen et al. 2004).

In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass die NO-Freisetzung in mit IFNγ vorstimulierten Knochenmarkmakrophagen mit zunehmender Infektionsdosis ansteigt. Weiterhin war die NO-Freisetzung bei vitalen Bakterien im Vergleich zu hitzeinaktivierten Burkholderia pseudomallei deutlich höher. Dieses Ergebnis unterstützt die These, dass LPS von Burkholderia pseudomallei ein schlechter NO-Stimulator ist. Bei inaktiven Bakterien steht die NO-Stimulation über den LPS/Toll-like-Rezeptor 4 Weg wohl im Vordergrund, während vitale Bakterien durch ihre Fähigkeit zur Invasion und Replikation in Zellen offensichtlich NO noch auf eine andere, bislang unbekannte, Weise stimulieren. Dass es sich hierbei um einen möglicherweise spezifischen Mechanismus handelt, legen die vergleichenden Experimente mit Salmonella Typhimurium nahe, wo der Unterschied in der Induktion hitzeinaktivierter und vitaler Bakterien geringer ausgeprägt war.

Des Weiteren bietet die Fähigkeit zur Induktion der NO-Produktion auch einen möglichen Schlüssel zur Erklärung der unterschiedlichen Resistenzlage bei den Mausstämmen C57Bl/6 und BALB/c.

Obwohl bei Infektion von Knochenmarkmakrophagen mit Burkholderia pseudomallei die NO-Produktion sowohl in C57Bl/6- als auch in BALB/c-Makrophagen erhöht wird, zeigte sich ein deutlicher quantitativer Unterschied zwischen beiden Stämmen.

Makrophagen von BALB/c-Mäusen produzierten generell weniger NO als Makrophagen von C57Bl/6-Mäusen. Die gleiche Beobachtung wurde auch in Versuchen zur NO-Stimulation mit Trypanosoma concolense gemacht (Kaushik et al.

1999). Auffallend ist dabei, dass bei Infektionen mit Trypanosomen, genau wie bei Burkholderia pseudomallei, C57Bl/6 der resistentere und BALB/c der empfänglichere Mausstamm ist. Im Vergleich dazu wurde in dieser Studie gezeigt, dass bei gleichartigen Versuchen mit Salmonella Typhimurium, gegen die C57Bl/6- und BALB/c-Mäuse etwa die gleiche Resistenz aufweisen, der Unterschied in der NO-Freisetzung geringer ausgeprägt war.

Die bis zu diesem Zeitpunkt gewonnenen Erkenntnisse ließen vermuten, dass NO ein Faktor für die höhere Resistenz von C57Bl/6-Mäusen gegenüber Burkholderia pseudomallei im Vergleich zu BALB/c-Mäusen ist, da in allen Versuchen C57Bl/6-Makrophagen zur Freisetzung größerer Mengen NO in der Lage waren, als BALB/c-Makrophagen. Zur Stützung diese These trägt weiterhin bei, dass Knochenmarkmakrophagen von BALB/c-Mäusen eine schlechtere Fähigkeit zur intrazellulären Abtötung von Burkholderia pseudomallei besitzen als Makrophagen von C57Bl/6-Mäusen (Breitbach 2004).

Zur Untersuchung des Einflusses von NO auf die intrazelluläre bakterizide Aktivität wurde iNOS mit Aminoguanidin, einem kompetitiven Hemmer, in mit IFNγ vorstimulierten Knochenmarkmakrophagen inhibiert. Anschließend wurde die NO-abhängige intrazelluläre Abtötung von Burkholderia pseudomallei auf den verschiedenen genetischen Hintergründen von C57Bl/6 und BALB/c bestimmt.

Überraschenderweise stellte sich heraus, dass eine Hemmung von NO nur in BALB/c-Knochenmarkmakrophagen zu einer Erhöhung der intrazellulären Keimzahl führte, während C57Bl/6-Makrophagen ohne NO bezüglich der intrazellulären Abtötung des Erregers nicht beeinträchtigt waren. Dieses ließ sich auch durch die Untersuchung der intrazellulären Abtötung von Burkholderia pseudomallei in Makrophagen von iNOS-Knock-out-Mäusen mit dem genetischen Hintergrund von C57Bl/6 bestätigen.

Das hier vorliegende Ergebnis widerspricht einerseits den Untersuchungen von Miyagi et al. (1997) und Utaisinchanroen et al. (2000), die NO eine wichtige Rolle in der intrazellulären Abtötung von Burkholderia pseudomallei zugesprochen hatten,

andererseits jedoch nicht, insofern auch die Makrophagenzelllinen J774.A1 und RAW 264.7 ursprünglich aus BALB/c-Mäusen isoliert wurden. Vergleicht man die Untersuchungen von Miaygi et al. (1997) mit der Vorliegenden, fällt auf, dass J774.A1 Zellen noch in viel größerem Maße von NO als Effektormolekül abhängig sind, als die primären Zellen von BALB/c-Mäusen, was auch durch eigene präliminare Versuche mit der Zelllinie J774.A1 bestätigt werden konnte. Selbst eine aus C57Bl/6-Mäusen isolierte Makrophagenzelllinie zeigte eine durch NO-Hemmung geringgradig verschlechterte intrazelluläre Abtötung von Burkholderia pseudomallei (Bruns 2004). Deshalb kann darauf geschlossen werden, dass primäre Zellen noch andere redundante Mechanismen besitzen, die eine wichtige Rolle für die intrazelluläre Abtötung spielen. Diese scheinen in Makrophagen von C57Bl/6-Mäusen noch effektiver oder zahlreicher zu sein als in BALB/c-Makrophagen.

Nun spielt NO nicht nur für die intrazelluläre Bekämpfung von Erregern eine Rolle, sondern auch für die parakine Kommunikation (Schmidt & Walter 1994). Wie bereits erwähnt wird iNOS, unter anderem über den globalen Transkriptionfaktor NF-κB reguliert, der auch mit der Expression vieler in der Immun- und Entzündungsantwort assozierter Gene in Verbindung steht (Kim et al. 1997; Xie et al. 1994). NO ist hier in der Lage, abhängig von seiner Konzentration ein positives oder negatives Feedback auf NF-κB auszuüben und so in das Entzündungsgeschehen einzugreifen (Connelly et al. 2001). In vivo beeinflusst eine Inhibition von NO-Synthasen bei Infektionen mit Bakterien, Viren, Pilzen und Protozoen den Verlauf einer Infektion negativ. Dieses konnte unter anderem für Leishmania major, Cryptococcus neoformans, Trypanosoma crucei, Coxsackievirus und auch für Mycobacterium tuberkulosis gezeigt werden. Im Gegensatz dazu sind einige Fälle beschrieben, in denen die Hemmung von NO einen positiven Einfluss auf den Verlauf der Infektion nahm. Dazu zählen Trypanosoma brucei sowie das Frühsommer-Menigitis-Encephalitis-Virus (FMSE-V). Bei dem ebenfalls fakultativ intrazellulären Erreger Listeria monozytogenes dagegen gibt es sowohl Berichte über einen positiven als auch negativen Einfluss von NO auf den Verlauf der Infektion (MacMicking et al. 1997).

Die Frage für diese Studie war nun, ob NO in vivo einen Einfluss auf den Verlauf einer Burkholderia pseudomallei-Infektion nimmt, obwohl in vitro kein Einfluss auf die

intrazelluläre bakterizide Aktivität festgestellt werden konnte. Zu diesem Zweck wurden Mäuse auf dem genetischen Hintergrund von C57Bl/6 eingesetzt, die einen Knockout der induzierbare NO-Synthase besaßen.

Eine Infektion mit Burkholderia pseudomallei überlebten diese Knock-out-Tiere im Vergleich zur Wildtypgruppe länger, was einen Vorteil vermuten ließ. Dennoch wiesen die Keimzahlen der Lungen beider Gruppen 48 Stunden nach der Infektion keinen Unterschied auf. Nach passiver Immunisierung war eine Protektion durch IgG2a unabhängig von NO vorhanden, was sowohl durch verringerte Mortalität als auch signifikant geringere Keimzahlen der Lunge bestätigt werden konnte. Einen Hinweis auf Antikörper-vermittelte NO-unabhängige Mechanismen der intrazellulären Abtötung in Makrophagen lieferten auch Untersuchungen mit Cryptoccus neoformans, wo ebenfalls eine Protektion in vivo durch passive Immunisierung gezeigt werden konnte (Feldmesser & Casadevall 1997). In den vorangegangenen in vitro-Experimenten war zwar ein direkter Zusammenhang zwischen Antikörper-vermittelter Phagozytose mit mAk IgG1 und verbesserter intrazellulärer bakterizider Aktivität in J774.16-Zellen gezeigt worden, dieser war aber unabhängig von der Anwesenheit von NO sowie ROI (Mukherjee et al. 1996).

Die Rolle von iNOS auf dem genetischen Hintergrund von BALB/c-Mäusen bleibt weiterhin unklar, da in vitro der Einfluss einer Hemmung von iNOS auf die intrazelluläre Keimzahl nachgewiesen werden konnte. Eine Bestätigung in vivo ist jedoch schwierig, da Tiere mit einem entsprechenden iNOS-Knock-out zurzeit kommerziell nicht erhältlich sind. Lediglich eine pharmakologische Inhibition von iNOS in vivo wäre vorstellbar, wobei die Gefahr einer unvollständigen Hemmung besteht und somit die in den in vitro-Versuchen angedeuteten geringen Effekte möglicherweise nicht detektierbar wären.

5.4. Bedeutung von ROI bei der Bekämpfung von Burkholderia