des Zentrums Innere Medizin der Medizinischen Hochschule Hannover
Regulation des pro-apoptotischen Gens Caspase 8 in hepatozellulären Karzinomen der Maus
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades doctor medicinae
in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von:
Anne Cohrs aus Braunschweig
Hannover 2007
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 08.05.2008
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover Präsident: Prof. Dr. med. Dieter Bitter-Suermann Betreuer der Arbeit: Prof. Dr. med. Christian Trautwein Referent: PD Dr. med. Christoph Reuter
Koreferent: Prof. Dr. Dr. med. Burkhard Tümmler Tag der mündlichen Prüfung: 08.05.2008
Promotionsausschussmitglieder: Prof. Dr. Reinhold Ernst Schmidt
Prof. Dr. Anke Schwarz
Prof. Bettina Wedi
Meinen Eltern
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG 1
1.1 Die Leber 1
1.1.1 Aufbau und Funktion 1
1.2 Hepatokarzinogenese 2
1.2.1 Allgemeine Mechanismen der Tumorgenese 2
1.2.2 Das Hepatozelluläre Karzinom (HCC) 3
1.2.3 Tumorsuppressorgene 6
1.2.4 Funktion des Proteins Caspase 8 in der Apoptose und der Tumorgenese 7 1.2.5 Epigenetische Veränderungen und Methylierungstheorie 8 1.2.6 Hepatokarzinogenese in transgenen Tieren 10
1.3 Zielsetzung der Arbeit 11
2 MATERIAL UND METHODEN 12
2.1 Material 12
2.1.1 Sonstige Materialien und Geräte 12
2.1.2 Verwendete eukaryontische Zelllinien 14
2.1.3 Bakterienstämme 14
2.1.4 Verwendete Plasmide 15
2.1.5 Oligonukleotide 15
2.1.6 Enzyme 18
2.1.7 Antikörper 18
2.1.8 Molekulargewichtsstandards 18
2.1.9 Kits 19
2.1.10 Chemikalien 19
2.1.11 Radiochemikalien 21
2.1.12 Puffer, Lösungen, Medien 22
2.1.13 Mausstämme und transgene Mauslinien 23
2.2 Methoden 23
2.2.1 Allgemeine Arbeitsmethoden zur Untersuchung von Nukleinsäuren 23 2.2.2 Methoden zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen 32 2.2.3 Methoden zur Untersuchung der Methylierungsmuster im murinen
Caspase 8 Promoter 42
2.2.4 RNA-Arbeitstechniken 46
2.2.5 Zellbiologische Methoden 47
2.2.6 Histologische Methoden 52
2.2.7 Proteinbiochemische Methoden 53
2.2.8 Tierexperimentelle Methoden 59
3 ERGEBNISSE 62
3.1 Morphologie der Tumoren 62
3.2 Expressionsmuster von Caspase 8 und cFLIP in hepatozelulären
Karzinomenc-myc und IgEGF transgener Mäuse 65
3.2.1 Expressionsmuster von Caspase 8 65
3.2.2 Expressionsmuster von cFLIP 67
3.3 Untersuchung der Silencing-Mechanismen von Caspase 8 68
3.3.1 Untersuchung des genomischen Lokus 68
3.4 Analyse des murinen Caspase 8 Promoters 69 3.4.1 Identifizierung und Klonierung des potentiellen, murinen Caspase 8
Promoters 69 3.4.2 Charakterisierung des murinen Caspase 8 Promoters 71
3.4.3 Etablierung von Methoden zur Untersuchung des Methylierungsstatus
des Caspase 8 Promoters 73
3.5 Die Bindung von SP1 an Caspase 8 Promoter wird durch Methylierung an
Erkennungssequenzen inhibiert 78
3.6 Vollständige in vitro CpG Methylierung des Caspase 8 Promoters
reprimiert die basale Promoteraktivität 81
3.7 Untersuchung der Apoptoseresistenz in murinen HCCs 82
3.7.1 Untersuchung der Transaminasen 83
3.7.2 Untersuchung der Apoptose in Leber- und Tumorgewebe durch TUNEL
Assays 85
3.7.3 Untersuchung der Caspase 8 Expression 87
4 DISKUSSION 89
4.1 Probleme der Arbeit 96
4.2 Ausblick 97
5 ZUSAMMENFASSUNG 99
6 LITERATUR 100
7 VERZEICHNISSE 110
7.1 Abkürzungsverzeichnis 110
7.2 Abbildungsverzeichnis 113
7.3 Tabellenverzeichnis 114
8 ANHANG 115
8.1 Lebenslauf 115
8.2 Publikationen und Präsentationen 117
9 DANKSAGUNG 118
10 EIDESSTATTLICHE VERSICHERUNG 119
1 Einleitung
1.1 Die Leber
1.1.1 Aufbau und Funktion
Die Leber (Hepar) ist das größte Stoffwechselorgan des menschlichen Körpers und erreicht eine Größe von etwa 1500-2000 g. Sie liegt, geschützt vom rechten Rippenbogen, im rechten Oberbauch. Umschlossen wird die Leber von der Tunica fibrosa (Glisson Kapsel), der bindegewebigen Leberkapsel. Die Capsula fibrosa perivascularis dringt gemeinsam mit den Blutgefäßen ins Organinnere ein. Die Vena (V.) portae hepatis (Pfortader) fungiert als Vas publicum, und transportiert nährstoffreiches Blut in die Leber. Als Vas privata der Leber transportiert die Arteria (A.) hepatica propria sauerstoffreiches Blut. Der venöse Abfluß wird über die Venae (Vv.) hepaticae in die untere Hohlvene gewährleistet.
Die Hepatozyten mit ihrer differenzierten Struktur gehören zu den funktionell vielseitigsten Zellen des Organismus. Die wichtigsten von ihnen gebildeten Substanzen sind Galle und Plasmaproteine. Die Galle besteht aus Gallensäuren und Bilirubin und wird zur Fettverdauung benötigt. Hierfür wird sie über ein Gangsystem ins Duodenum abgeleitet. Bei den Plasmaproteinen handelt es sich insbesondere um Plasmaalbumine, Enzyme und Globuline sowie Proteine für die Blutgerinnung. Außerdem fungiert die Leber als Speicherorgan für Glykogen und Lipide. Über die Verarbeitung, Speicherung und Wiederabgabe der Stoffwechselprodukte erfolgt eine chemische Entgiftung des Blutes.
Über die Desaminierung von Aminosäuren wird Harnstoff gebildet. In der Fetalzeit ist die Leber sogar für die Blutbildung zuständig (1).
Darüber hinaus hat die Leber die einzigartige Fähigkeit, sich nach Substanzverlust wieder zu regenerieren. Dieses Phänomen bildet die Grundlage der Prometheuslegende. Um es den Menschen zu geben, stahl Prometheus den Göttern das Feuer. Hierfür wurde er von Zeus bestraft: er wurde an einen Felsen gekettet und täglich erschien ein Adler, der einen Teil der Leber des Prometheus verzehrte. Die Leber regenerierte über Nacht, so dass die Qualen für Prometheus Tag für Tag erneut beginnen konnten. Das hiernach benannte Prometheusverfahren ist ein extrakorporales Leberersatzverfahren, welches bei schwerem Leberversagen supportiv überbrückend eingesetzt werden kann.
1.2 Hepatokarzinogenese
1.2.1 Allgemeine Mechanismen der Tumorgenese
Heute ist allgemein anerkannt, dass es eine genetische Basis für die Entstehung von Tumoren gibt. Die Tumorgenese wird als ein schrittweiser Prozess verstanden, bei dem Initiation, Promotion und Progression unterschieden werden (2). Bisher sind nur wenige genetische Faktoren identifiziert worden, die bei der Tumorgenese eine Rolle spielen. Der Tumorbildung gehen eine Reihe von genetischen Veränderungen im Normalgewebe voraus. Diese Veränderungen können der betroffenen Zelle einen Wachstumsvorteil gegenüber den unveränderten Zellen verschaffen. Eine erhöhte Proliferation von Zellen erhöht wiederum die Wahrscheinlichkeit für die Akkumulation weiterer Mutationen im Rahmen der DNA Replikation. Auf dieser Grundlage kann es nun zur Entstehung eines malignen Tumors kommen. Die genetischen Veränderungen können die unterschiedlichsten zellulären Prozesse wie z. B. die Zellzyklusregulation, DNA- Reparatur, Chromosomenstabilität, Zell-Zell-/Zell-Matrix-Interaktionen, Angiogenese oder Apoptose betreffen. Die Fehlregulation von tumor-relevanten Genen kann entweder über ihre Aktivierung oder auch Inaktivierung die Tumorbildung begünstigen. Die bei der Tumorgenese beteiligten Gene werden in drei Hauptgruppen unterteilt:
Onkogene, Tumorsuppressorgene (s. u. Kapitel 2.2.3.) und DNA-Reparaturgene (3).
Onkogene gehen definitionsgemäß aus Proto-Onkogenen hervor. Dies sind z. B.
Proteinkinasen, Wachstumsfaktoren und auch Transkriptionsfaktoren (z. B. c-myc), die z.
B. im Rahmen der normalen Entwicklung für Proliferationsvorgänge essentiell sind. Der Übergang vom Proto-Onkogen zum Onkogen erfolgt durch Punktmutation, Translokation oder auch Genamplifikation und bewirkt eine Fehlregulation der entsprechenden Faktoren, der den Übergang vom normalen Zellwachstum zum ungebremsten Tumorwachstum begünstigt.
DNA-Reparaturgene sind tumorrelevante Gene, die die korrekte Vervielfältigung der genetischen Information bei der Zellteilung kontrollieren. Beim Menschen liegen die durchschnittlichen Mutationsraten zwischen 10-5 und 10-7 pro Gen und Generation (3). Ein fehlendes oder ineffizientes DNA-Reparatursystem bewirkt eine Erhöhung der Mutationsrate und ist damit cancerogen. Durch Beeinträchtigung der Genomstabilität wird
die Zelle anfällig für weitere Veränderungen wie z. B. DNA-Doppelstrangbrüche und daraus resultierende chromosomale Veränderungen.
1.2.2 Das Hepatozelluläre Karzinom (HCC)
Beim hepatozellulärem Karzinon (HCC) handelt es sich um ein vom Leberparenchym ausgehendes primäres Leberzellkarzinom. Das HCC ist weltweit mit etwas 350.000 Neuerkrankungen jährlich der 8-häufigste maligne Tumor (der 6-häufigste bei Männern, der 11-häufigste bei Frauen) (4). Dabei unterliegt die Epidemiologie starken geographischen Schwankungen. In den westlichen Industrienationen ist die Inzidenz des HCCs mit 5 pro 100.000 Einwohner relativ gering. Im Vergleich dazu stellt es in Afrika und Südostasien die häufigste maligne Erkrankung überhaupt dar (bis zu 150 pro 100.000 Einwohner jährlich) (5). Das weltweit sehr unterschiedliche Vorkommen des HCCs spiegelt die Verteilung seiner Risikofaktoren wider. Der bedeutendste Risikofaktor für die Entwicklung eines hepatozellulären Karzinoms ist die Leberzirrhose. Unabhängig von der Ursache des zirrhotischen Umbaus ist die Leberzirrhose als präkanzeröse Läsion zu werten. 80% der weltweit untersuchten HCCs werden in zirrhotisch umgebauten Lebern gefunden (6). Häufig liegt eine gemischte Ätiologie der Zirrhose (z. B. kombinierte Hepatitis B und Hepatitis C Infektion, Alkohol-Abusus u. a.) vor (7). Dies kann sich auf die Tumorentstehung auswirken: In Europa entwickeln sich bei virusbedingter Zirrhose häufiger HCCs als bei nicht-virusbedingter Zirrhose (8). Weitere Risikofaktoren sind hauptsächlich virale Hepatitiden (Hepatitis B (HBV) und C Virus (HCV)), Aflatoxin B (9), Hämochromatose (10), α-1-Antitrypsinmangel (11), Tyrosinämie, Alkohol (12) und andere Faktoren von geringerer Relevanz. Besonders im afroasiatischen Raum wird der Stellenwert der Hepatitis-B-Infektion als Risikofaktor deutlich: 80% der HCCs sind mit einer chronischen oder abgeheilten Hepatitis-B-Infektion assoziiert (13). Eine Studie in Taiwan zeigte, dass in diesem Fall die Inzidenz des HCCs über 100-fach erhöht ist (14).
Europa scheint bezüglich der relativ geringen HCC-Inzidenz insbesondere von hohen hygienischen Standards, vorhandenen Impfmöglichkeiten gegen das HBV sowie der Kontrolle von Blutkonserven zu profitieren. Andererseits scheinen sich die Risikofaktoren der westlichen Industrienationen zukünftig auf den Alkoholabusus sowie die Infektion mit HCV zu fokussieren, wogegen es bisher keine Impfmöglichkeit gibt (15; 16).
Morphologisch wächst der Tumor großknotig, multizentrisch oder diffus; die Schnittflächen imponieren weißlich bis bräunlich. Mikroskopisch zeichnet sich das HCC durch ein trabekuläres, pseudoglanduläres, zirrhöses oder solides Wachstum aus. In der Zytologie zeigen sich große bis mittelgroße Zellen, mit meist polygonaler Zellform und scholligem Plasma. Vorhandene hyaline Einschlüsse können α1-Proteinaseinhibitor, α- Fetoprotein (Tumormarker) oder Fibrinogen enthalten (17).
Klinisch imponiert dieser hochmaligne Tumor meist durch Gewichtsverlust, diffuse Oberbauchbeschwerden und einen evt. tastbaren Tumor im rechten Oberbauch (18). Die mittlere Überlebenszeit nach Erstdiagnose beträgt 4 bis 6 Monate, der Tod des Patienten tritt meist auf Grund eines Leberversagens und/oder Tumorkachexie ein (19; 20).
Therapeutisch stellt das HCC immer noch eine schwierige Aufgabe dar. Die einzig kurative Maßnahme ist auch heute noch die Resektion. Diese verspricht allerdings nur bei solitärem Primärherd, günstiger anatomischer Lage und einer nur gering ausgeprägten Zirrhose Erfolg.
Sind diese Faktoren nicht erfüllt, liegt also ein diffuses oder multilokuläres Wachstum vor und fehlen Fernmetastasen, kann eine Lebertransplantation in Betracht gezogen werden.
Der Vorteil dieser Methode ist, dass auch makroskopisch nicht sichtbare, intrahepatische Herde mit entfernt werden. Umstritten ist die Transplantation dennoch, da es frühzeitig zu hohen Rezidivraten kommt.
Folgende nicht-chirurgische Methoden finden Anwendung: Zur palliativen Behandlung inoperabler HCC-Patienten kann auf die TransArterielle ChemoEmbolisation (TACE) zurückgegriffen werden. Diese Methode ist ein radiologisch-interventionelles Verfahren.
Grundlegend hierfür ist die Blutversorgung des Tumors, die zu knapp 80% über die A.
hepatica erfolgt. Das gesunde Lebergewebe hingegen wird nur zu 25% über die A.
hepatica versorgt, die Hauptversorgung übernimmt die Pfortader. Als Embolisat dient Lipoidol (als Trägersubstanz, um die Verweildauer des Chemotherapeutikums zu erhöhen) in Kombination mit einem Zytostatikum. Diese Kombination einer öligen Emulsion wird in die A. hepatica injiziert. Im Anschluß erfolgt eine passagere Embolisation der Tumorgefäße z. B. mit Gelatinepartikeln. Insbesondere die Schmerzsymptomatik kann so verbessert werden. Die portal-venöse Leberperfusion wird durch TACE nicht negativ beeinflusst (21).
Alternativ kann eine Perkutane EthanolInjektion (PEI) durchgeführt werden. Dieses Verfahren hat einen rein palliativen Charakter. Ultraschallgesteuert und in Lokalanästhesie werden die Tumorherde punktiert und Alkohol eingebracht. Es kommt zur Tumornekrose sowie zum Untergang der Gefäßversorgung durch Thrombose. Als Resultat kommt es zu einer Tumorverkleinerung (21).
Ein weiteres lokales Verfahren ist die Radiofrequenz-Thermoablation. Hierbei wird über eine spezielle Sonde im Tumorherd eine Hyperthermie von ca. 95°C erzeugt. Dies führt zu einer Koagulationsnekrose des Tumors (22).
Besonders bei inoperablen Tumoren kann eine systemische Chemotherapie in Erwägung gezogen werden. Leider konnten weder mit Einzelsubstanzen noch in Kombinationstherapien mit Interferon-alpha Ansprechraten über 25% erzielt werden, es erfolgt keine signifikante Verbesserung der Überlebenszeit. Ursächlich hierfür scheint eine ausgeprägte Chemoresistenz der primären hepatocellulären Karzinome zu sein. Oft wird dies durch eine erheblich reduzierte Apoptosekapazität verstärkt: 50% der Tumoren zeigen p53-Mutationen (23-25). Darüber hinaus kommt es insbesondere bei der Kombination verschiedener Präparate zu erheblichen toxischen Nebenwirkungen. Eine Standard- Chemotherapie existiert derzeit nicht. Kontroverse Beurteilungen gibt es auch für die Therapie mit dem Antiöstrogen Tamoxifen sowie dem Somatostatinanalogon Octreotid.
Beide werden bei ausgedehntem Tumorbefall zur Verbesserung der Überlebenszeit erprobt (26). Erste Ergebnisse mit HMG-CoA-Reduktaseinhibitoren scheinen vielversprechend (27).
Die externe Strahlentherapie hat sich zur Therapie des HCCs nicht etabliert. Gaben über 35 Gy werden nicht toleriert, es kommt häufig nur zur teilweisen Zerstörung des Tumorgewebes bei erheblicher Atrophie des nichttumorösen Gewebes. In den letzten Jahren wurde eine „interne“ Radiotherapie entwickelt. Hierbei wird 131I-Lipoidol intraarteriell injiziert und eine selektive Tumordosis erzielt. Das Verhältnis der Zerstörung von gesundem zu nicht-gesunden Gewebe konnte stark verbessert und ein therapeutischer Einsatz ermöglicht werden (28).
Die Behandlungsmöglichkeiten des HCCs bleiben weiterhin unbefriedigend. Auch die genannten Fortschritte konnten daran nichts Grundsätzliches ändern. Umso wichtiger erscheint die Etablierung innovativer Strategien zur Therapie des hepatozellulären Karzinoms, auch in Bezug auf die Verträglichkeit für den Patienten (29).
1.2.3 Tumorsuppressorgene
Tumorsuppressorgene (TSG) sind Gene, die in ihrer physiologischen Funktion Zellwachstum, Zellproliferation und Zelltod regulieren. Im Falle ihrer Inaktivierung durch Deletion oder Mutation kommt es zu einer Deregulierung ihrer Funktionen, wodurch Tumorentstehung und Tumorproliferation begünstigt werden können. Dies sind im allgemeinen rezessive Gene, bei denen erst der Funktionsverlust beider Allele zu unkontrollierten Zellteilungen und Tumorwachstum führt. Tumorsuppressorgene sind Antagonisten der dominanten Onkogene, deren Genprodukte Zellteilung und -wachstum fördern.
Bekannteste Beispiele für Tumorsuppressorgene und damit verbundene Tumorvarianten sind: RB-1 (Retinoblastome u. a.), p53 (Karzinome des Dickdarms, der Lunge, der Brust), WT1 (Wilms Tumor), VHL (von Hippel-Lindau) sowie BRCA1 und BRCA2 (Mamma- Karzinom).
Zur Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen werden verschiedene Mechanismen auf genomischer Ebene diskutiert (30). Dazu gehört die mitotische Non-Disjunction (Fehlverteilung von Chromosomen während der Mitose) mit oder ohne endomitotischer Reduplikation oder mitotischer Rekombination. Auch chromosomale Aberrationen wie Deletionen, Genkonversionen oder Punktmutationen kommen in Frage. Bei bereits vorliegender somatischer Mutation des zweiten Allels führen die beschriebenen Ereignisse zum vollständigen Verlust der Genfunktion.
In ca. 50% der humanen HCCs sowie in vielen weiteren humanen Tumorenarten ist das Tumorsuppressorgen p53 mutiert (31; 32). Das p53 Gen befindet sich auf dem kurzen Arm des Chromosoms 17. Diese Mutation ist bei HCCs allerdings häufig erst in fortgeschrittenen – nicht aber in frühen Tumorstadien zu finden. Eine p53-Mutation scheint daher nicht am Anfang der HCC-Entwicklung zu stehen (33-38). Allerdings wurden in Gegenden mit hohen Aflatoxin-Belastungen besonders häufig p53-Mutationen in HCCs gefunden. Die G zu T Mutation im Codon 249 scheint hierbei spezifisch für die Aflatoxin-Belastung zu sein (39; 40). Die Funktion von p53 im Zellzyklus ist noch nicht endgültig geklärt. Bei DNA-Schäden bedeutet dies bei einer Zellteilung eine erhöhte Mutationsfrequenz. Die p53-Konzentration steigt bei Schädigung des Genoms an, um
einen Übergang in die S-Phase zu verhindern. Bei Mutation des p53 Gens ist dies nicht mehr möglich. Darüber hinaus initiiert p53 Apoptose, so dass auch auf diesem Weg der Tumorentstehung entgegengewirkt wird.
1.2.4 Funktion des Proteins Caspase 8 in der Apoptose und der Tumorgenese Apoptose ist essentiell für die normale Entwicklung und die Homeostase in Säugern. Unter Apoptose versteht man einen physiologischen Vorgang, der zum Untergang der betroffenen Zelle führt. Dieser wird von der Zelle aktiv durchgeführt und steht so im Gegensatz zur Nekrose. Dieses „Selbstmordprogramm“ der Zelle wird eingesetzt, um einzelne Zellen zu entfernen, deren Funktion überflüssig geworden ist, deren Gene verändert sind und potentiell die Gefahr eine tumorösen Entartung besteht oder die z. B.
durch eine Virusinfektion betroffen sind. Grundsätzlich kann die Apoptose von zellextern, z. B. durch immunaktive Zellen, oder von zellintern durch verschiedene Gen-Aktivität oder -Inaktivität induziert werden. Ein weiterer Unterschied zur Nekrose besteht darin, dass das umliegende Gewebe von apoptotischen Vorgängen unbeeinflußt bleibt. Eine zentrale Rolle bei der Apoptose spielen die sogenannten Caspasen, Enzyme, die proteolytische Aktivität aufweisen (41).
Eine erhöhte Apoptoserate kann zur Entwicklung von Krankheiten wie dem akuten Leberversagen oder auch neurodegenerativen Erkrankungen beitragen (42). Im Hinblick auf die Tumorgenese deuten die derzeit vorhandenen Daten darauf hin, dass apoptotische Mechanismen eine wichtige Rolle bei der Eliminierung transformierter Zellen spielen. Es ist sehr wahrscheinlich, dass die Inaktivierung von Apoptose z. B. durch Silencing oder Deletion pro-apoptotischer Gene sowie die Überexpression von anti-apoptotischen Faktoren die Tumorentstehung begünstigen oder beschleunigen (43).
Die pro-apoptotische Cystein-Aspartat Protease, Caspase 8, ist die am weitesten apikal gelegene Caspase, die in Apoptose vermittelt durch Fas, TNF und verwandten Todesrezeptoren der TNF-Superfamilie involviert ist (44-46). Die Aktivierung von Caspase 8 nach Stimulation des Todes-Rezeptors und die darauf folgende Formation eines todesinduzierenden Signalkomplexes (DISC) wurde detailliert beschrieben (45). Die aktivierte Caspase 8 ist in der Lage nachgeschaltete Faktoren wie z. B. die Effektor- Caspasen, Caspase 3, Caspase 6 und Caspase 7 zu aktivieren, was eine Signalverstärkung
des apoptotischen Stimulus bewirkt. Caspase 8 vermittelte Apoptose kann durch die Expression des Antagonisten cFLIP gehemmt werden. cFLIP weist eine starke Homologie zu Caspase 8 auf, wobei ihr jedoch die funktionelle Protease-Region fehlt (47; 48).
Eine konstitutive Inaktivierung der Caspase 8 im Mausmodell ist embryonal letal aufgrund schwerer Defekte während der Herzmuskelentwicklung (49), was den hohen Einfluss der Apoptose auf Entwicklungsprozesse deutlich herausstellt. In einer kürzlich durchgeführten Studie konnte Caspase 8 in der murinen Leber erfolgreich durch den Einsatz von siRNA inhibiert werden, wodurch sich ein protektiver Effekt vor verschiedenen Formen des akuten Leberversagens in den entsprechenden Tieren zeigte. Analysen des humanen Caspase 8 Promoters zeigten, dass Caspase 8 nicht ausschließlich durch proteolytische Aktivierung sondern auch transkriptional reguliert wird. Die basale Aktivität der Caspase 8 wird durch SP1 vermittelt und ist durch die Aktivierung von p53 noch weiter induzierbar.
In Bezug auf Karzinom- und Tumorentstehung zeigten verschiedene Studien ein Fehlen der Caspase 8 Expression in juvenilen Neuroblastomen (50), sowie in einigen Formen des kleinzelligen Lungen-Karzinoms (51). Überraschenderweise war dies mit einem modifizierten CpG-Methylierungsmuster des Caspase 8 Gens außerhalb der Promoterregion verbunden, die mit Exon 3 in Zusammenhang steht. Die Mechanismen, die zum Silencing der humanen Caspase 8 führen, sind bis heute nicht vollständig verstanden und werden kontrovers diskutiert (52). Im Hinblick auf die Entstehung des HCCs, welches einer der häufigsten Karzinom-Typen weltweit darstellt (53), ist die Rolle von Caspase 8 nur unzureichend bekannt. Kürzlich wurde beschrieben, dass in humanen HCCs eine inaktivierende Punktmutation des Caspase 8 Gens auftreten kann (54). Das Caspase 8 Silencing in humanen HCCs wurde bis heute nicht untersucht.
1.2.5 Epigenetische Veränderungen und Methylierungstheorie
Unter epigenetischer Inaktivierung versteht man eine Änderung der Funktionalität eines Gens, ohne dass dessen genetische Sequenz verändert ist. Durch diese Regulation entsteht repressives Chromatin an einer aktiven Promoterregion. Die Methylierung des Cytosins in einer CpG-reichen Sequenz ist für die Inaktivierung des Chromatins mitverantwortlich.
Diese transkriptionelle Inaktivierung wird durch Hypermethylierung von CpG Sites in Promotoren verursacht, die gehäuft CpG-Inseln enthalten.
Verschiedene Arbeiten haben gezeigt, dass die Promotoren von verschiedenen Tumorsuppressorgenen oft in einer Vielzahl von humanen Tumoren methyliert, aber im entsprechenden gesunden Gewebe frei von Methylierung sind. Epigenetische Veränderungen, die wie die Hypermethylierung regulatorischer Sequenzen zur Inaktivierung der Genexpression führen, werden für einen wichtigen Mechansimus des Gen-Silencings von Tumorsuppressorgenen gehalten. Es wird davon ausgegangen, dass der epigenetischen Modifikation nicht nur in der Karzinogenese, sondern auch in der zellulären Entwicklung und Alterung eine schwerwiegende Rolle zukommt.
Schon 1986 beschrieben BAYLIN ET AL. eine Hypermethylierung in kleinzelligen Lungentumoren und in Lymphomen, die sich deutlich vom Normalgewebe unterschied.
Die Methylierungen betrafen in diesem Fall insbesondere CCGG-Motive (55).
Am Beispiel des kolorektalen Karzinoms zeigten MITTAG ET AL., dass in diesem Fall die Hypermethylierung des DAPK-Promoters ein frühes Ereignis der Tumorgenese zu sein scheint (56). Außerdem konnte gezeigt werden, dass insbesondere die Methylierung an CpG-Motiven in der Promoterregion entscheidend für das Silencing von Genen ist. Die Methylierung des Cytosins führt so zur verminderten Transkription. Dies betrifft auch humane Tumorsuppressorgene und ist somit ein wesentlicher Faktor für das Verständnis der Tumorentstehung. In diesem Falle wurden sporadische Retinoblastome untersucht (57).
In einer anderen Studie konnte durch den Einsatz von 5-Aza-2'-Deoxycytidinen, welche demethylierende Argenzien darstellen, eine Induktion von vorher reprimierten Genen hervorgerufen werden (58). Auch dort konnte eine inverse Korrelation zwischen Methylierungsstatus und Genexpression festgestellt werden.
Speziell für das HCC konnte gezeigt werden, dass die Hypermethylierung verschiedener Promoterabschnitte wahrscheinlich ein frühes Ereignis in der Tumorgenese darstellt. Der LOH scheint erst in nachfolgenden Schritten aufzutreten bzw. die Hypermethylierung agiert letztendlich als Wegbereiter für den LOH (59).
Da in kindlichen Neuroblastomen Caspase 8 in vielen Fällen nicht exprimiert wird, wurde auch hier das Methylierungmuster untersucht (60) und eine Hypermethylierung im Caspase 8 Gen nachgewiesen. Nicht nur in diesen Tumoren, sondern auch in Medulloblastomen (61) sowie in ependymalen Tumoren (62) konnte eine Hypermethylierung des Caspase 8 Promoters gezeigt werden.
In HCCs wurde ebenfalls die Hypermethylierung verschiedener Promotoren untersucht. In einer vorliegenden Studie wurden 20 unterschiedliche Gene auf Hypermethylierung an CpG-Motiven untersucht. 16 von 20 untersuchten Genabschnitten lagen unmethyliert vor, so dass davon ausgegangen wird, dass eine Kombination aus unmethylierten und methylierten Abschnitten in der Hepatokarzinogenese eine Rolle spielen könnte. Auch hier gab es erste Hinweise auf eine Hypermethylierung des Caspase 8 Promoters (63).
1.2.6 Hepatokarzinogenese in transgenen Tieren
Eine anerkannte Alternative zur Untersuchung der Tumorentwicklung mit modifizierter Genregulation in der Leber sind etablierte transgene Mausmodelle mit leberspezifischen, konstitutiv exprimierten Protoonkogenen wie dem Epidermal Growth Factor (EGF) oder c-myc unter der Kontrolle eines leberspezifischen Promoters (64-68). Es ist beschrieben, dass diese Tiere Lebertumoren mit der Histologie eines typischen HCCs entwickeln und somit ein angemessenes Modellsystem zur Untersuchung der HCC-Entwicklung darstellen.
Die kausale Beteiligung von c-myc an der Hepatokarzinogenese wurde in Studien mit transgenen Mäusen gezeigt (66; 68). Das c-myc Gen wurde leberspezifisch unter der Kontrolle des Albuminpromoters exprimiert. In den transgenen Mäusen bewirkte dies über hyperplastische Leberveränderungen binnen 12 Monaten Leberneoplasien, aus denen sich bis zum 18. Lebensmonat hepatozelluläre Adenome entwickelten (66). Innerhalb von 12 bis 15 Monaten entwickelten sich, unter der Kontrolle des α1-Antitrypsinpromoters, HCCs in Abhängigkeit des genetischen Hintergrundes der Mauslinien (67; 68).
Auch die leberspezifische Expression durch den Albumin-Promoter/Enhancer eines EGF- Analogons (sekretierbare Form des humanen Epidermal Growth Factors (IgEGF)) führte in 100% der Fälle zur Entwicklung eines HCCs (67). IgEGF bindet an denselben Rezeptor wie TNF-α, welches überexprimiert zur Bildung von Leberneoplasien binnen 10 bis 15 Monaten führt. IgEGF stellt ein Fusionprotein dar, welches ein EGF-Analogon mit der sekretorischen Signalfrequenz des Immunglobulin verbindet (69).
In der hier vorliegenden Arbeit wurde das Expressionsprofil von Caspase 8 in HCCs in transgenen Tumor-Mausmodellen untersucht, um die potentielle Rolle von Caspase 8 als Tumorsuppressor-Gen zu studieren.
1.3 Zielsetzung der Arbeit
Das hepatozelluläre Karzinom ist einer der häufigsten malignen Tumoren weltweit. Die Therapiemöglichkeiten sind beschränkt und die Rate der Therapieversager ist hoch. Die Diagnose des HCC erfolgt meist erst sehr spät und die Patienten versterben durchschnittlich 6 Monate nach Diagnosestellung (im Okuda-Stadium I, II und III beträgt die mediane Überlebenszeit elf, drei und einen Monat).
Um Therapieoptionen zu optimieren, müssen zunächst die Mechanismen der speziellen Tumorgenese verstanden werden. Weiterhin ist es von großem Interesse, zusätzliche molekulare Tumormarker zu definieren, mit deren Hilfe sich HCCs frühzeitig prognostizieren lassen.
Aus vorliegenden Studien ist bekannt, dass in einigen Tumoren wie z. B. dem Medulloblastom, Lungentumoren und kindlichen Tumoren wie dem Neuroblastom eine Fehlregulation bzw. ein kompletter Verlust der Caspase 8 Expression vorliegt. Im hepatozellulären Karzinom ist allerdings bis heute das Caspase 8 Expressionsprofil nicht untersucht worden.
Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit sollte daher zunächst das Caspase 8 Expressionsprofil in HCCs aus murinen Tumormausmodellen analysiert werden. Da sich in einer frühen Phase der Analyse bereits zeigte, dass die Inaktivierung von Caspase 8 in HCCs eine signifikante Rolle spielt, sollte im weiteren Verlauf der Arbeit der molekulare Mechanismus der Caspase 8 Inaktivierung in HCCs aufgeklärt werden. Ein Ziel war dabei die Etablierung von Methoden zur Untersuchung von Methylierungsmustern am Caspase 8 Gen als potentielles diagnostisches Werkzeug. Übergeordnetes Ziel der Arbeit war, zu untersuchen, ob Caspase 8 ein potentielles Tumorsuppressorgen darstellt, welches ein mögliches Zielgen für zukünftige HCC Diagnose – und/oder mögliche Gentherapie dienen könnte.
2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Sonstige Materialien und Geräte
Gerät Hersteller
Agarosegelelektrophorese System BM 200/2 und System BM100
Serva
Bakterieninkubator BE 600 Memmert β-Counter Radicont Herfurth β-Szintillationszähler LB124 Berthold
3 MM Filterpapier Whatman
96-Well-Platten steril (β-Gal) Greiner
Brutschrank für Zellkultur Typ B3 6220 Heraeus Instruments Cryostat Microm HM 500 OM Microm
Einmalpipetten 2ml, 5ml, 10ml, 25ml (steril) Sarstedt
Einmalskalpell Feather Eppendorfgefäße 1,5 und 0,5 ml Eppendorf
Expositionskassetten mit Verstärkerfolie Hypercassette 18 x 24 cm
Amersham Life Science
Flachbettscanner CanoScan 9900F Canon Fluoreszenzmikroskop BX60 Olympus
Feinwaage Sartorius Gel-Dokumentation Gel Doc 100 mit Software, Fa. Bio-RAD
Molecular Analyst Version 2.1.2, Fa. Bio-RAD
P91 Thermoprinter, Fa. Mitsubishi Geltrockner Slab Gel Dryer Modell SE 1160
mit Refrigated Vapor Trap, Fa. Savant und Vakuumpumpe Duo 5
Pfeiffer
Heizblock Thermomixer comfort Eppendorf Hybridisierungsofen Typ 400 Hy-E Bachofer
Hybridisierungsflasche Amersham Pharmacia Biotech Kapillarsequenzierer ABI Prism 310
Software: Data Collection Version 1.04 Sequence Analysis Version 2.2.1
Applied Biosystems
Kryoröhrchen, CryoTube Nunc
Kühlzentrifugen 2K15 mit Rotor Nr. 12128, Fa. Sigma
5417R mit Rotor FA45-24-11, Fa. Eppendorf
Kühlwasserbad Julabo Laborwaage Sartorius
Sarstedt Tubes, 5ml Sarstedt
Luminometer „Lumat“ LB 9501 Berthold
Magnetrührer MR 3001 K Omnilab
Mehrkanalpipetten Transferpette-8, 30-300µl Brandt
Nylonmemebran Hybond-N+ Amersham Bioscience Petrischalen 10cm Durchmesser Sarstedt
Photometer Lambda Scan 200e
Software Lambda KC4 Version #2.7 Rev#9
MWG Biotech
Photometerplatten Costar Pipetten Reference 0,1-10µl, 10-100µl,
50-200µl, 100-1000µl
Eppendorf
Röntgenfilme Amersham Spannungsquellen: Electrophoresis Power
Supply PS3002 und Electrophoresis Power Supply EPS 200
Gibco und Pharmacia Biotech
Thermocycler Tpersonal und T3 Thermocycler Biometra Tischzentrifugen 5415 D und 5415 C Eppendorf
Tissue Tek Miles
Ultraschallstab Sonoplus Bandelin
UV-Crosslinker UV Stratalinker 1800 Stratagene
Vortexer Reax 2000 Omnilab
Wasserbäder GFL und Julabo
Zellkulturschalen und -flaschen Greiner
Zellschaber Sarstedt Zellzählkammer Neubauer Brandt
Zentrifugen J2-21 mit Rotoren JA-10 und JA-20, Fa.
Beckman; GS-6R, FA. Beckman
2.1.2 Verwendete eukaryontische Zelllinien
Zur transienten Transfektion von Luciferase-Reporterplasmiden sowie zur Isolierung nukleärer Zellextrakte wurden die nachfolgend aufgelisteten Hepatomzelllinien eingesetzt.
Hepa 1-6 Murine Hepatomzelllinie (ATCC CRL-
1548)
Huh7 Humane Hepatomzelllinie (NAKABAJASHI
ET AL., 1984)
2.1.3 Bakterienstämme
Zur Transformation von Ligationsansätzen dienten chemisch-kompetente Zellen des Escherichia coli-Stammes TOP10F‘ (One Shot® TOP 10F‘, Fa. Invitrogen), die eine Transformationseffizienz von mehr als 1 x 109 Transformanden pro µg pUC19-DNA aufwiesen. TOP10F‘ Zellen enthalten ein F‘ Episome, daß ein Tetracyclinresistenzgen, einen laclq-Repressor und einen f1 Replikationsstart umfaßt.
One Shot ® TOP10 F’Competent Cells;
Fa. Invitrogen
Genotyp: F‘{laclq, Tn10(TetR)} mcrA ∆(mrr- hsdRMS-mcrBC) ø80lacZ∆M15 ∆lac X74 recA1 araD139 ∆(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG
2.1.4 Verwendete Plasmide
pGL2-Basic Dieses Plasmid wurde von der Firma Promega bezogen und für die Herstellung von Promoter-Luciferase Fusionskonstrukten verwendet.
Es enthält ein Luciferase-Reportergen sowie eine 5’ davor lokalisierte multiple cloning site zur Klonierung von Promoterfragmenten.
pCR®2.1-TOPO®
Vector;
Fa. Invitrogen
Dieser Vektor wurde zur Klonierung von PCR-Fragmenten gemäß den Angaben des Herstellers eingesetzt und erlaubt die schnelle Identifizierung rekombinanter Klone mittels Farbselektion (Blau- Weiss).
pCMV-β-gal Dieser Expressionsvektor wurde zur Kontrolle der Transfektionseffizienz eingesetzt. Er enthält das ß-Galactosidase- Gen unter Kontrolle eines CMV-Promoters. Als Selektionsmarker besitzt es das ß-Lactamasegen für Ampicillin-Resistenz.
2.1.5 Oligonukleotide
Alle hier beschriebenen Oligonukleotide wurden entweder von der Firma MWG (Ebersberg) oder Qiagen bezogen. Die Sequenz ist jeweils in 5’-3’-Richtung angegeben.
Oligonukleotide für Gelshift-Analysen (EMSA) der SP1 Sites
C8SP1sense (sense) 5’-CCA GAA CTG GCG GGA GCT CTT AAG GCG GGC AGA AAG CG-3’
C8SP1antisense (antisense) 5’-CGC TTT CTG CCC GCC TTA AGA GCT CCC GCC AGT TCT GG-3’
C8SP1METHYLsense (sense)
5’-CCA GAA CTG G[5Me∼dC]1G GGA GCT CTT AAG G[5Me∼dC]1G GGC AGA AAG CG-3’
C8SP1METHYLantisense (antisense)
5’-CGC TTT CTG CC[5Me∼dC]1 GCC TTA AGA GCT CC[5Me∼dC]1 GCC AGT TCT GG-3’
SP1 consensus 5’-ATT GGA TCG GGG CGG GGC GAG C-3’
1 = 5-Methyl-Cytosin
Oligonukleotide für den Nachweis von Caspase 8, Exon 7
(sense) 5’-CCT ACA GGC TGT GTT CT GGG-3’
(antisense) 5’-CC TT ACT CAT TTC TGT GGTT-3’
Oligonukleotide für den Nachweis des murinen Caspase 8 Promoters
MMCasp8Prom1 (sense) 5’-GCC GGT CAC AAC TCC AGC TC-3’
MMCasp8Prom4 (antisense) 5’-GTA GGA ATC AGA GCT CAA GG-3’
Oligonukleotide für PCR-Amplifizierung des Caspase 8 Promoters nach Bisulfit- Behandlung
MMC8Methyl1 (sense) 5’-AAA CTA AAC CAA TCA ACA ATC C-3’
MMC8Methyl2 (antisense) 5’-CAC CAA TCA CAA CTC CTT CTC AAA-3’
Oligonukleotide für PCR-Analyse der Caspase 8 cDNA Expression
Casp8RTMM1 (sense) 5’-GGA TGC TAA GAA TGT CAT CTC C-3’
Casp8RTMM2 (antisense) 5’-GTG ACA AGG GTG TCG TCT ATG G-3’
Oligonukleotide für PCR-Analyse der cFLIP cDNA Expression
MMcFLIPsense1 (sense) 5’-GTT CAC TCA GGG TTC TCC TTG G-3’
MMcFLIPantisense1 (antisense) 5’-CAG GCT GAG GCT GTA TTT CTC C-3’
Oligonukleotide für PCR-Analyse der GAPDH cDNA Expression
G1-S (sense) 5’-TGA TGA CAT CAA GAA GGT GAA G-3’
G2-AS (antisense) 5’-TCC TTG GAG GCC ATG TAG GCC AT- 3’
Oligonukleotide zur Generierung muriner Caspase 8 Promoterkonstrukte:
Die gesetzten Mutationen sind unterstrichen, die Schnittstelle für EcoRV ist blau dargestellt.
MMCasp8 Prom1 (antisense) 5’-GCC GGT CAC AAC TCC AGC TC-3’
MMCasp8 Prom1b (antisense) 5’-AAG CTT GCC GGT CAC AAC TCC AGC TC-3’
MMCasp8 Prom6 (sense) 5’-AAC TGG CGG GAG CTC TTA AGG C-3’
MMCasp8 Prom10 (sense) 5’-GCT GAC ATT TCT AGA GCA GAG G-3’
MMCasp8 Prom11 (sense) 5’-GAT ATC ATT CGG AGC CAT TTC TGT CC-3’
MMCasp8 Prom12 (sense) 5’-GAT ATC GGT AGC AAA CCT CTG TGA GC-3’
MMCasp8 Prom13 (sense) 5’-GAT ATC AGC AGC CTA TGG CCT CTA GG-3’
MMCasp8 Prom14 (sense) 5’-GAT ATC CCA GGA TGC CAC CTC TAA TG-3’
MMCasp8 li SP1 mut (sense) 5’-GAT ATC CAG AAC TGG ATT GAG CTC TTA AGG- 3’
MMCasp8 re SP1 mut (sense) 5’-GAT ATC CAG AAC TGG CGG GAG CTC TTA AGG TTA GCA GAA AGC G-3’
MMCasp8 2 X SP1 mut (sense) 5’-GAT ATC CAG AAC TGG ATT GAG CTC TTA AGG TTA GCA GAA AGC G-3’
Generierte murine Caspase 8 Deletionskonstrukte:
Konstrukt Sense-Primer Antisense-Primer Länge (bp)
–114/+285 MMCasp8 Prom 10 MMCasp8Prom1 399
–36/+285 MMCasp8 Prom 6 MMCasp8Prom1 321
–39/+285mut I MMCasp8 li SP1 mut MMCasp8Prom1b 324 –39/+285mut II MMCasp8 re SP1 mut MMCasp8Prom1b 324 –39/+285mut I+II MMCasp8 2 X SP1 mut MMCasp8Prom1b 324
–1/+285 MMCasp8 Prom 13 MMCasp8Prom1b 286
+26/+285 MMCasp8 Prom 14 MMCasp8Prom1b 259
+68/+285 MMCasp8 Prom 11 MMCasp8Prom1b 217
+158/+285 MMCasp8 Prom 12 MMCasp8Prom1b 127
Oligonukleotide für standardisierte Sequenzierreaktionen
M13forward (sense) 5’-GAA TTG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’
M13 revers (antisense) 5’-GGA AAC AGC TAT GAC CAT GAT TAC G-3’
2.1.6 Enzyme
Enzym Hersteller
Restriktionsendonukleasen: EcoR I, Eco R V, Bam H I, Hind III; Pvu I, Sac I, Aci I, Sma I
New England Biolabs
T4-DNA-Ligase New England Biolabs
RNase A Sigma
Trypsin Seromed
Proteinase K Roche
CpG Methylase New England Biolabs
Taq DNA Polymerase Invitrogen
Hotstar Taq Polymerase Qiagen
2.1.7 Antikörper
Der SP1 Antikörper wurde für EMSA Supershift Untersuchungen eingesetzt. Der JO2- Antikörper diente zur Induktion von Apoptose in der Leber in vivo.
SP 1-Ak Santa Cruz
JO 2-Ak Pharmingen
2.1.8 Molekulargewichtsstandards
1 kb DNA-Leiter New England Biolabs/Invitrogen
1 kb + DNA-Leiter Invitrogen
100 bp DNA-Leiter New England Biolabs/Invitrogen
2.1.9 Kits
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen QIAquick PCR Purification Kit Qiagen
QIAEX II Kit Qiagen
Qiagen Endofree Maxi Kit Qiagen Omniscript® Reverse Transcription Kit Qiagen
RNeasy Mini Kit Qiagen
DyeEx 2.0 Spin Kit Qiagen
TOPO®-TA-Cloning Kit Invitrogen In Situ Cell Detection Kit, Fluorescein Roche
Nick translation kit Amersham phamacia biotech
2.1.10 Chemikalien
β-Mercaptoethanol Sigma
Acrylamid/Bisacrylamid Gibco/Sigma Agarose (Elektrophoresis grade) Gibco BRL
Ammonium Acetat (NH4CH3COO) Merck Ampicillin-Natrium Salz Roth
Aprotinin-Lösung Sigma APS (Ammoniumperoxodisulfat) Merck
ATP Sigma
Borsäure (H3BO3) Roth
Bromphenolblau Serva BSA (Rinder Serumalbumin) Serva
Cacodylsäure Natriumsalz Trihydrat Fluka
Carbenicellin-Natrium Serva
Dimethylformamid ICN Biomedicals
Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma di-Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) Merck
Dithiothreitol (DTT) Sigma DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)
mit Glutamax
Gibco BRL
DNTPs Invitrogen EDTA(N,N;N’,N’-Ethylendiamintetraacetat) Calbiochem
Eisessig (Acetic Acid; CH3COOH) J.T.Baker
Eosin Y Solution Sigma
Essigsäure J.T.Baker Ethanol JTB Ethidiumbromid Sigma
FCS (fetal calf serum) Gibco
Glycerol Serva Glycylglycin Serva Hefeextrakt Roth
HEPES ICN Biomedicals
HPLC-Wasser J.T. Baker
Hydroquinone Sigma IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosid) Promega
Isopropanol Riedel de Häen
Isotone Kochsalzlösung Braun
KCl Merck
Luciferin-Natriumsalz AppliChem
Magnesiumchlorid (MgCl2) Merck
Magnesiumsulfat (MgSO4) Merck
Mayers Hämalaunlösung Merck
Methanol J.T. Baker
NaH2PO4 Merck
Natriumacetat Merck
Natriumchlorid (NaCl) Merck
Natriumcitrat J.T. Baker
Natriumcitrat-2-hydrat J.T. Baker
Natriumdodecylsulfat (SDS) Serva Natriumkarbonat (Na2CO3) wasserfrei J.T. Baker
Natronlauge (NaOH) Merck
ONPG (o-Nitrophenyl β-D- Galactopyranoside)
Sigma
Paraformaldehyd Merck PBS (Phosphate Buffered Saline) Gibco BRL
Pefabloc Boehringer Penicillin/Streptomycin PAA
Phosphorsäure (H3PO4) Roth
PolyFect Transfection Reagent Qiagen
Salzsäure Merck
Select Agar Gibco
Select Peptone 140 Gibco
SOC-Medium Invitrogen
Sodium bisulfite Sigma
Szintillationsflüssigkeit (OptiPhase HiSafe 3) Wallac TEMED (N,N,N’,N’-
Tetramethylethylendiamin)
Sigma
Tris (Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan) Pharmacia Biotech
Tris-base Sigma
Triton X-100 Sigma
X-gal (5-Bromo 4-chloro 3-indolyl- Galactosid)
Sigma
Xylencyanol Merck
Xylol J.T. Baker
2.1.11 Radiochemikalien
Alle Radiochemikalien wurden von der Firma Amersham bezogen.
32P-γ-ATP Zur Endmarkierung von doppelsträngigen Oligonukleotiden in EMSA-Analysen
32P-α-dCTP Zur Markierung von DNA Sonden in
Southern Blot-Analysen
2.1.12 Puffer, Lösungen, Medien Nährmedien für Zellkultur:
Zellkulturmedium für eukaryontische Zelllinien Endkonzentration 500 ml Dulbecco’s MEM mit Glutamax-I
50 ml FCS 10% (v/v)
10 ml 100x Penicillin/Streptomycin 0,1 mg/ml
Einfriermedium für Zellen:
Die benötigte Menge an Dulbecco’s MEM mit Glutamax-I wurde mit 20% FCS und 10%
DMSO versetzt.
Nährmedien für Bakterienkultur:
LB-Flüssigmedium:
10 g Select Peptone 140, 5 g Hefeextrakt und 10 g NaCl wurden auf 1000 ml mit dest. H2O aufgefüllt und autoklaviert. Unmittelbar vor Inkulturnahme der Bakterien erfolgte die Zugabe 2 µl Carbenicillin-Lösung pro ml Medium (100 mg Carbenicellin-Natrium/ml) zu einer Endkonzentration von 0,2 µg/ml.
LB-Festmedium:
1 Liter LB-Medium wurde mit 15 g Select Agar versetzt und autoklaviert. Zur Selektion plasmidpositiver Klone wurde 1 ml Ampicillin-Lösung (100 mg/ml Ampicillin-Natrium) nach Abkühlung auf unter 60°C zugefügt, so dass eine Endkonzentration von 0,1 mg/ml Antibiotikum entstand. Nach dem Ausgiessen in Petrischalen (10 cm Durchmesser) und dem Aushärten wurden die Platten bis zur Verwendung bei 4°C gelagert.
2.1.13 Mausstämme und transgene Mauslinien
Das in dieser Arbeit verwendete Lebermaterial wurde freundlicherweise von Herrn Dr.
Nils-Holger Zschemisch zur Verfügung gestellt. Alle invasiven Methoden (Injektion von Antikörpern, Tötung der Tiere, Entnahme von Blut und der Leber sowie die Präparation der Tumoren), die an den Mäusen durchgeführt werden mußten, wurden von ihm vorgenommen. Die verwendeten transgenen Mausstämme wurden vom Fraunhofer Institut für Toxikologie und experimentelle Medizin in Hannover zur Verfügung gestellt.
Alle hier beschriebenen Mauslinien leiten sich von der Hausmaus ab. Durch die leberspezifische Expression von Onkogenen wurde in zwei Mauslinien im genetischen Hintergrund CD2-F1 (BALB/c x DBA/2) die Bildung von Lebertumoren induziert. Der Mausstamm EGF-2B erzeugt eine sekretierbare Form des humanen Epidermal Growth Factors (IgEGF) unter Kontrolle des Albuminpromoters (108; 23; 162). Im AAT/c-myc Mausstamm steuert der α1-Antitrypsinpromoter die Transkription des murinen c-myc Gens (64; 68). Alle Versuche basieren auf Lebermaterial aus den hier beschriebenen transgenen Mäusen.
2.2 Methoden
2.2.1 Allgemeine Arbeitsmethoden zur Untersuchung von Nukleinsäuren 2.2.1.1 Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
Zur photometrischen Konzentrationsbestimmung von DNA wurde die optische Dichte (OD) der gelösten DNA bei 260 nm gemessen. Eine OD von 1,0 entspricht hierbei 50 μg/ml doppelsträngiger DNA (spezifischer Multiplikationsfaktor für doppelsträngige DNA). Unter Einbeziehung des Verdünnungsfaktors ergibt sich:
l pez g
faktor erdünnungs
OD nm DNA-Konzentration in μ /μ
1000
(50) Faktor -
DNA . s
260 ×V × =
Durch zusätzliche Messung der OD bei 280 nm konnte eine Aussage über die Reinheit der DNA getroffen werden. Eine reine Nukleinsäurelösung weist im Verhältnis OD260nm/OD280nm einen Wert zwischen 1,8 und 2,0 auf.
Bei der photometrischen Konzentrationsbestimmung von RNA wurde analog zur DNA- Konzentrationsbestimmung verfahren. Allerdings entspricht eine OD von 1,0 hierbei 40 μg/ml RNA (spezifischer Multiplikationsfaktor für RNA) und ist beim Einsetzen in die Formel zu berücksichtigen.
2.2.1.2 Agarosegelelektrophorese
Zur Auftrennung und Visualisierung von DNA-Fragmenten und genomischer DNA wurde eine Agarosegelelektrophorese durchgeführt. Je nach der erwarteten Fragmentlänge wurden 0,5 bis 1,5% Agarosegele eingesetzt. Da Nukleinsäuren eine negative Ladung aufweisen, bewegen sie sich im elektrischen Feld gerichtet und lassen sich somit ihrer Größe entsprechend auftrennen. Durch die Färbung mit Ethidiumbromid konnten die Nukleinsäurefragmente unter UV-Licht (254 nm oder 366 nm) sichtbar gemacht werden, da Ethidiumbromid die DNA interkaliert.
Die Agarose (0,5-1,5%) wurde in TAE-Puffer gelöst und mit 0,0001 Vol.
Ethidiumbromidlösung (10 mg/ml) versetzt. Vor dem Auftragen wurden die DNA-Proben mit 0.2 Vol. 5 X Ladepuffer gemischt. Zur Charakterisierung der Banden wurde zusätzlich ein Größenstandard aufgetragen. Danach erfolgte die Auftrennung bei einer konstanten Spannung von 5 V/cm mit TAE als Laufpuffer.
50x TAE-Stammlösung: (add 1Liter) Endkonzentration
242 g Tris 2M Tris
57,1 ml Essigsäure 5,7% (v/v) Essigsäure
100ml 0,5M EDTA, pH 8,0 50 mM EDTA
Aus dieser Stammlösung wurde eine 1x Gebrauchslösung hergestellt.
5x DNA-Ladepuffer: (add 100 ml) Endkonzentration
50 mg Bromphenolblau-Natrium 0,05% (w/v) Bromphenolblau
50 mg Xylencyanol 0,05% (w/v) Xylencyanol
34 ml 100% Glycerol 30% Glycerol
20 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0 0,1 M EDTA
2.2.1.3 Transformation von E. coli
Für die Transformation (Aufnahme von Fremd-DNA in Bakterien) wurden chemisch kompetente One Shot ® TOP10 F’ E.coli Bakterien der Firma Invitrogen verwendet.
Pro Reaktion wurde ein 50 μl-Aliquot kompetenter Zellen vorsichtig auf Eis aufgetaut. Bei Verwendung des TOPO®-TA Cloning Kits der Firma Invitrogen wurden 2 μl Ligationsansatz, bei Klonierung in den pGL2-Vector 10 μl Ligationsansatz hinzugegeben und vorsichtig gemischt. Nach 30-minütiger Inkubation auf Eis wurden die Bakterien einem Hitzeschock (42°C/30 sec im Wasserbad) ausgesetzt und anschließend sofort wieder auf Eis überführt. Der Ansatz wurde mit 250 μl SOC-Medium versetzt und eine Stunde bei 200 rpm im Heizblock gerüttelt. Pro Reaktion wurden derweil 2 mit Ampicillin versetzte LB-Agarplatten im Brutschrank vorgewärmt. Nach abgelaufener Inkubationszeit wurden auf der einen Platte 50 μl Bakteriensuspension und auf der anderen Platte der Rest der Suspension ausplattiert. Die Agarplatten wurden umgedreht über Nacht bei 37°C im Brutschrank inkubiert.
Um nach T/A-Ligationsreaktion und Transformation in TOP10F‘-Zellen Bakterienkolonien mit religierten Plasmiden von Bakterienkolonien mit rekombinantem Plasmid zu unterscheiden, wurde das Verfahren der Blau-Weiß-Selektion angewandt.
Hierzu wurden zusätzlich folgende Lösungen benötigt:
40mg/ml X-Gal-Lösung:
400 mg 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid (X-Gal) wurden in 10 ml Dimethylformamid gelöst und bei –20°C gelagert.
100 mM IPTG-Lösung:
238 mg Isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosid (IPTG) wurden in 10 ml dest. H20 gelöst, zu je 1 ml aliquottiert und bei –20°C gelagert
Da TOP10F‘ Zellen einen Lac-Repressor überexprimieren, mussten die Agarplatten zur Blau-Weiß-Selektion mit 40 μl X-Gal-Lösung sowie mit 40 μl IPTG vorbehandelt werden.
IPTG verdrängt als allosterischer Inhibitor den Lac-Repressor vom Lac-Promoter des Plasmids, der das β-Galaktosidase-Gen steuert. Unter Anwesenheit von IPTG konnte die vom Plasmid kodierte β-Galaktosidase erzeugt werden, die dann X-Gal in eine blaues
Indigoderivat umsetzte. Es blieben nur die Bakterienkolonien weiß, in deren Plasmid eine Insertion die Transkription des β-Galaktosidase-Gen unterbunden hatte (lacZ-Mutanten).
2.2.1.4 Vermehrung transformierter Bakterienstämme
Zur Vermehrung plasmidtragender Bakterienklone wurde eine Vorkultur (2 ml LB- Medium mit Antibiotika versetzt) angesetzt und diese über Nacht bei 37°C im Bakterienschüttler bei 220 rpm inkubiert. Zur Mini-Plasmidpräparation wurden 1,5 ml Bakteriensuspension eingesetzt. Um DNA mit höherem Reinheitsgrad zu isolieren, wurde aus den Überständen der positiven Klone erneut eine Übernachtkultur in 5 ml LB-Medium angesetzt. Daraus wurde eine DNA-Präparation mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit der Firma Qiagen durchgeführt (siehe 2.2.1.6).
Zur Isolierung großer DNA-Mengen (Maxi Plasmidpräparation) wurde eine Übernachtkultur in 400 ml LB-Medium angesetzt und bei 37°C im Bakterienschüttler inkubiert.
2.2.1.5 Mini-Plasmidpräparation
Mit dieser Methode wurde DNA aus kleinen Bakterienkulturen (2 ml) isoliert. Sie wurde eingesetzt, um eine große Anzahl transformierter Bakterienklone im Restriktionsverdau schnell überprüfen zu können.
1,5 ml der Übernachtkultur wurden in ein Eppendorfgefäß überführt und 1 min bei 10000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde fast vollständig verworfen und das Pellet durch Vortexen resuspendiert. Zu dieser Suspension wurden 300 μl TENS-Puffer gegeben, durch ca. 5 sec vortexen gemischt und 2 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 150 μl 3 M NaAcetat-Lösung (pH 5.2) hinzugegeben, 5 sec gevortext und 5 min auf Eis inkubiert. Durch 5 min Zentrifugieren bei 10000 x g wurden Zellfragmente und chromosomale DNA pelletiert. Der Überstand wurde in ein neues Eppendorfgefäß überführt und mit 900 μl, bei –20°C vorgekühltem 95%-igem Ethanol versetzt. Durch 10 minütige Zentrifugation bei 10000 x g (4°C) wurde die Plasmid-DNA pelletiert und anschließend zweifach mit 70%-igem Ethanol gewaschen. Die DNA wurde 20 min an der
Luft getrocknet und anschließend in 50 μl TE-Puffer pH 8.0 aufgenommen. Die erhaltene DNA wurde bei –20°C gelagert.
TENS-Puffer: (add 0,5 Liter) Endkonzentration
5 ml 1 M Tris-HCl, pH 8,0 10mM Tris-HCl, pH 8,0
1 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0 1mM EDTA, pH 8,0
5ml 10N NaOH 0,1N NaOH
12,5 ml 20% SDS 0,5% SDS
TE-Lösung: (add 0,5 Liter) Endkonzentration
5 ml 1M Tris-HCl, pH 8,0 10mM Tris, pH 8,0
1 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0 1mM EDTA, pH 8,0
2.2.1.6 Mini-Plasmidpäparation mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit
Um für einige Untersuchungen, wie z. B. Sequenzierungen, besonders reine DNA zu isolieren, wurde ein QIAprep Spin Miniprep Kit verwendet. Von den im Restriktionsverdau positiven Klonen wurde zunächst eine Übernachtkultur in 5 ml LB- Medium angesetzt und bei 37°C im Bakterienschüttler inkubiert. Die Übernachtkultur wurde in ein Eppendorfgefäß überführt und 1 min bei 10000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde bis auf ca. 50 μl vollständig verworfen und das Pellet durch Vortexen resuspendiert. Die weitere Aufarbeitung der DNA erfolgte nach den Angaben des Herstellers (Qiagen). Zunächst wurde die Bakteriensuspension in 250 μl Puffer P1 aufgenommen und anschließend mit 250 μl Puffer P2 versetzt und durch 4-6 maliges Schwenken des Eppendorfgefäßes vermischt. Nachdem 350 μl Buffer N3 in das Eppendorfgefäß gegeben wurden und es vorsichtig gewendet wurde, wurde 10 min bei 10000 x g und Raumtemperatur zentrifugiert. Der dabei entstandene Überstand wurde auf eine QIAprep Säule pipettiert, 60 sec zentrifugiert (10000 x g; RT) und die dabei aufgefangene Flüssigkeit verworfen. Die DNA wurde an die Membran der QIAprep Säule gebunden. Zum Waschen wurden 750 μl Puffer PE auf die Säule gegeben und wie eben beschrieben zentrifugiert und verworfen. Die Säule wurde nun auf ein frisches Eppendorfgefäß gesetzt und 50 μl Puffer EB auf die Membran der Säule pipettiert. Nach
1 min Inkubationszeit wurde 1 min bei 10000 x g und Raumtemperatur zentrifugiert. Das 50 μl Eluat wurde bei –20°C gelagert.
2.2.1.7 Maxi Plasmidpräparation
Diese Plasmidpräparation wurde mit dem QIAGEN Endofree Maxi Kit der Firma Qiagen durchgeführt. Das Protokoll des Herstellers wurde ohne Abweichungen befolgt.
Die Verwendung endotoxinfreier DNA erhöht bei Transfektionsexperimenten die Effizienz des Transfers erheblich.
Eine Übernachtkultur von 400 ml wurde bei 3800 X g für 15 min bei 4 °C zentrifugiert und das Pellet in 10 ml P1 Puffer resuspendiert. Anschließend wurden 10 ml P2 Puffer dazugegeben, es wurde durch mehrmaliges Kippen des Zentrifungenröhrchens gemischt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zugabe von 10 ml gekühltem P3 Puffer wurde, wie oben beschrieben, gemischt und das Lysat in ein QIAfilter Cartridge gegeben.
Es folgte eine Inkubation von 10 min bei Raumtemperatur. Daraufhin wurde der Ansatz gefiltert und in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen aufgefangen. Nachdem 2,5 ml ER Puffer hinzugegeben wurden, erfolgte eine 30-minütige Inkubation auf Eis. Bevor das gefilterte Lysat auf ein QIAGEN-tip überführt wurde, wurde dieser mit 10 ml QBT Puffer äquilibriert. Nachdem das Lysat die Säule passiert hatte, wurde zweimal mit 30 ml QC Puffer gewaschen. Die Elution erfolgte mit 15 ml QN Puffer. Das Eluat wurde mit 10,5 ml Isopropanol versetzt, sofort gemischt und bei 13000 X g bei 4 °C für 30 min zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde mehrfach mit 70%-igem Ethanol gewaschen und anschließend erneut zentrifugiert (13000 X g/10 min). Nachdem der Überstand vorsichtig dekantiert wurde, wurde das Pellet 10 min an der Luft getrocknet und in 100 μl TE aufgenommen. Bei diesem Verfahren konnte bis zu 500 μg DNA isoliert werden.
2.2.1.8 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen
Die gewonnene Plasmid-DNA wurde mit Restriktionsenzymen gespalten. Es wurden Enzyme und dazugehörige Puffer von der Firma NEB eingesetzt. Es wurden jeweils 1-2 U Enzym/μg DNA eingesetzt. Nach Angaben des Herstellers wurde bei Bedarf BSA eingesetzt.
Nach 1 Stunde Inkubation bei 37°C wurde das Restriktionsenzym, falls notwendig, nach Herstellerangaben hitzeinaktiviert. Danach wurden 5 x DNA-Ladepuffer hinzugegeben und in einem 1%-igem Agarosegel (in TAE) aufgetrennt. Die DNA wurde durch EtBr gefärbt und unter UV-Licht (254 nm oder 366 nm) dargestellt. Die Identifizierung der Banden erfolgte durch Vergleich mit einem 1 kb + -DNA-Größenstandard der Firma Invitrogen.
2.2.1.9 Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
Zur Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen wurde das Qiaquick Gel Extraction Kit der Firma Qiagen verwendet, wobei das Herstellerprotokoll ohne Abweichungen befolgt wurde. Nach der Restriktionsspaltung wurde die gewünschte Bande nach elektrophoretischer Auftrennung mit einem Skalpell auf einem UV-Licht-Tisch ausgeschnitten. Um die DNA nicht zu zerstören, wurde 70%-iges UV-Licht zur Präparation eingesetzt.
Das Gel-Stück wurde mit dem 3-fachen Volumen an QG Puffer versetzt (100mg ∼ 100μl) und für 10 min im Heizblock bei 50°C inkubiert. Nachdem das Gel-Stück vollständig aufgelöst war, wurde ein einfaches Gelvolumen (100mg ∼ 100μl) Isopropanol hinzugegeben, gemischt und der komplette Ansatz auf eine QIAquick spin Säule überführt.
Um die DNA an die Säule zu binden, wurde nun 1 min bei 10000 x g in der Tischzentrifuge zentrifugiert. Zum Waschen wurden 750μl PE Puffer auf die Säule gegeben und erneut 1 min zentrifugiert. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt zur Trocknung der Membran wurden nun 30 bzw. 50 μl EB Puffer auf die Membran pipettiert, 1 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend durch 1 min Zentrifugation bei 10000 x g in der Tischzentrifuge eluiert. Die Kontrolle erfolgte mit einem Minigel.
2.2.1.10 Präzipitation von Nukleinsäuren
Zur Aufreinigung oder Konzentrierung wässriger DNA-Lösungen wurde diese durch Zugabe von 2 Volumina Ethanol (100%) und 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat pH 5.2 ausgefällt. Die Präzipitation erfolgte eine Stunde oder über Nacht bei –20°C. Nach einer Zentrifugation bei 4°C (15000 x g, 10 min) wurde der Überstand abgenommen, das Pellet
20 min an der Luft getrocknet und die DNA in einem geeigneten Volumen H2O wieder aufgenommen.
2.2.1.11 Aufreinigung von DNA-Fragmenten
Die Aufreinigung von DNA erfolgte mit dem QIAquick PCR Purification Kit der Firma Qiagen, das Herstellerprotokoll wurde ohne Abweichungen befolgt. Diese Methode wurde eingesetzt, um einzel- oder doppelsträngige DNA zwischen 100 bp und 10 kb Größe von Verunreinigungen zu befreien (Salze, Primer, Nukleotide, Polymerasen).
Nachdem zu der DNA-Lösung eine 3-faches Volumen an PB Puffer gegeben wurde, konnte der Ansatz auf ein QIAquick-Säulen pipettiert werden. Durch Zentrifugieren (10000 x g/30-60 sec) in einer Tischzentrifuge konnte die DNA an die Membran gebunden werden. Der Durchlauf wurde verworfen und die Membran durch Zugabe von 750 μl PE Puffer mit nachfolgender Zentrifugation (wie oben beschrieben) gewaschen. Die DNA wurde anschließend mit 30 μl EB Puffer eluiert.
Im Rahmen des Bisulfite genomic Sequencing wurde die DNA mit dem QIAEX II Kit der Firma Qiagen aufgereinigt (siehe 2.2.3.3).
2.2.1.12 Klonierung von PCR-Produkten (TOPO®-TA-Cloning-Kit, Invitrogen) Mit Hilfe des TOPO®-TA-Cloning-Kits (Fa. Invitrogen) wurden Taq-amplifizierte PCR Produkte effektiv in den pCR®2.1-TOPO® Vector kloniert. Dieser liegt linearisiert mit Thymidin-Überhängen am 3’-Ende vor. Taq-Polymerase bildet PCR-Produkte mit 5’
überhängenden Adenosin-Resten. Mit Hilfe der kovalent an den Vektor gebundenen Topoisomerase I, wird in einem einfachen Inkubationsschritt das PCR-Fragment in den PCR 2.1 Vektor ligiert.
Nachdem die Größe des amplifizierten PCR-Fragments auf einem Agarosegel kontrolliert worden war, wurde der Reaktionsansatz nach Angaben des Herstellers pipettiert. Die Menge des eingesetzten PCR-Produkts variierte ja nach Intensität der Bande im Agarosegel.
Reaktionsansatz Volumen
Frisches PCR-Produkt 0,5- 4μl
Salt Solution 1μl
TOPO® Vector 1μl
Steriles H2O add 6μl
Gesamtvolumen 6μl
Der Ansatz wurde vorsichtig gemischt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend wurden für die Transformation in kompetente One Shot ® TOP10 F’ E.coli Bakterien 2 μl Reaktionsansatz eingesetzt oder der Ansatz bei –20°C gelagert.
2.2.1.13 Ligation von DNA-Fragmenten
Zur Herstellung neuer rekombinanter Plasmide wurden geeignete Vektoren und DNA- Fragmente zunächst mit kompatiblen Restriktionsenzymen linearisiert. Anschließend erfolgte eine Ligation des Fragments in den Vektor durch T4-Ligase. T4-Ligase sowie der T4-DNA-Ligase Puffer wurden von der Firma NEB bezogen. Es wurden äquimolare Mengen an Vektor- und DNA-Fragment-Enden eingesetzt, das Liagtionsvolumen betrug 10-20 μl.
Der Ligationsansatz wurde über Nacht bei 16°C im Wasserbad inkubiert. Im Anschluß wurde der Ligationsansatz in kompetente One Shot ® TOP10 F’ E.coli Bakterien transformiert oder –20°C gelagert.
2.2.1.14 Isolation genomischer DNA aus Mauslebern
Um genomische DNA aus Mauslebern zu isolieren, wurde ein Stück Lebergewebe mit 750 μl Lysis-Puffer und 50 μl Proteinase K versetzt. Der Ansatz wurde über Nacht bei 55°C unter leichtem Schütteln inkubiert. Anschließend wurde 5 min (14000 rpm) zentrifugiert und der Überstand in ein neues Eppendorfgefäß überführt. Hierzu wurden 750 μl (entspricht 1 Volumen) Isopropanol gegeben und gevortext, um eine Phasenbildung zu verhindern. Nach erneuter Zentrifugation (14000 rpm/5 min) wurde der Überstand verworfen und das Pellet zweifach mit 70%-igem Ethanol gewaschen. Nachdem das Pellet an der Luft getrocknet wurde, konnte die DNA in 100 μl dest. H2O aufgenommen werden.
Lyse-Puffer: (add 0,5 Liter) Endkonzentration
25 ml 1 M Tris-HCl, pH 8,0 50 mM Tris
50 ml 1M NaCl 100 mM NaCl
100 ml 0,5M EDTA, pH 8,0 100 mM EDTA
25 ml 20%SDS 1% SDS
TE-Lösung: (add 0,5 Liter) Endkonzentration
5 ml 1M Tris-HCl, pH 8,0 10mM Tris, pH 8,0
1 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0 1mM EDTA, pH 8,0
2.2.2 Methoden zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen 2.2.2.1 Polymerasekettenreaktion (PCR) und RT-PCR
Die PCR dient der Amplifikation definierter DNA-Fragmente und wurde präparativ (Gensonden, Fragmente zur Klonierung) sowie analytisch eingesetzt. Als Ausgangs-DNA (Template) können z. B. genomische DNA, Plasmid-DNA, DNA aus vorhergegangenen PCRs oder cDNA dienen.
Grundsätzlich besteht ein PCR-Programm aus drei Schritten, die zyklisch wiederholt werden: Einem Denaturierungsschritt, einem Annealingschritt und einem Elongationsschritt. Die Denaturierung erfolgt bei 95°C und führt zur Trennung der beiden Template-DNA-Stränge. Anschließend wird die Temperatur primerspezifisch gesenkt, so dass die Oligonukleotidprimer an die Template-Einzelstränge hybridisieren können. Die Temperatur für dieses sogenannte Annealing ist stark von den verwendeten Primern und deren Schmelztemperatur abhängig. Im Elongationsschritt wird die Temperatur auf 72°C (Temperaturoptimum der Taq-Polymerase) erhöht und die Taq-Polymerase startet, an den Primern beginnend, die DNA-Synthese. Da jeder Reaktionsschritt neue, identische Matrizen-DNA erzeugt, steigt die Zahl der Kopien exponentiell an (70).
In dieser Arbeit kam häufig die Reverse Transkription-Polymerasekettenreaktion (RT- PCR) zum Einsatz. Als Template für diese PCR diente komplementäre, einzelsträngige DNA (cDNA), welche vorausgehend mittels Reverser Transkription aus RNA synthetisiert wurde (siehe 2.2.4.2). Auf diese Weise konnte die Transkription des entsprechenden Gens nachgewiesen und quantifiziert werden.
In der vorliegenden Arbeit kamen zwei verschiedene PCR-Systeme zum Einsatz. Das Taq- Polymerase-Systems der Firma Invitrogen wurde für die RT-PCRs zur Untersuchng der Caspase 8 sowie cFLIP-Expresion eingesetzt. Auch die PCRs nach einer Bisulfit- Behandlung, die der Klonierung in den pCR®2.1-TOPO® Vector vorausgingen, wurden mit diesem System durchgeführt. Gleiches gilt für die PCR zur Erstellung von Konstrukten sowie der durchgeführten PCRs nach Aci I-Verdau.
Bei Einsatz des Taq-Polymerase-Systems der Firma Invitrogen wurde folgender Ansatz verwendet:
PCR
Reaktionsansatz Volumen
Template (genomische DNA: 100-500 ng; x μl Plasmid- DNA: 1-10 ng)
Sense Primer (10 pmol) 2 μl
Antisense Primer (10 pmol) 2 μl
Taq – Puffer 5 μl
MgCl2 1,5 μl
dNTP’s 4 μl
DMSO 1 μl
H2O add 50 μl
Thermus aquaticus DNA Polymerase 1 μl
Gesamtansatz 50 μl
Bei der Durchführung einer Duplex-PCR wurden zwei Gene gleichzeitig in einer Reaktion nachgewiesen, wobei das Housekeeping-Gen GAPDH als interner Standard verwendet wurde. Hierbei wurde der beschrieben Ansatz zusätzlich mit je 2 μl G1-S-Primer sowie G2-AS-Primer (beide 10 pmol) versetzt. Das MgCl2 wurde auf 2 μl, die dNTP’s auf 7 μl erhöht. Das H2O-Volumen wurde angepasst.
Durch PCR mit spezifischen Primern für die cDNA des konstitutiv exprimierten Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH)-Gens wurde zuerst die Integrität des cDNA-Gemisches bewiesen (housekeeping-Gen). Zugleich diente das GAPDH-Signal
zur Bestätigung des Einsatzes gleicher Gesamt-RNA-Mengen in der RT-Reaktion und somit als Abgleich für die folgenden PCR-Experimente.
Alternativ wurde für einige Experimente das HotStarTaq-Systems der Firma Qiagen verwendet. Dieses verbindet die Vorteile des vorbereiteten Mastermixes mit dem Hot Start-Prinzip. Die Polymerase wird erst nach einer langen Denaturierungsphase von 15 Minuten bei 95°C aktiv, die den unten beschriebenen Cycle-Programmen vorausging. So wurden unspezifische Anlagerungen der Primer, die sich in Form unspezifischer PCR- Produkte auswirken können, während der Herstellung der Reaktionsansätze vermieden.
Der HotStarTaq Mastermix enthielt 5 units/µl modifizierte, rekombinante Thermus aquaticus DNA-Polymerase, 400 mM von jedem Nukleosidtriphosphat und einen PCR- Puffer (mit 3 mM MgCl2).
Bei Einsatz des Hotstar-Taq-Systems der Firma Qiagen wurde folgender Ansatz verwendet:
PCR-Reaktionsansatz Volumen
Template (genomische DNA: 100-500 ng; x μl
Plasmid-DNA: 1-10 ng)
HotStarTaq PCR Mastermix 25 μl
Sense Primer (10 pmol) 2 μl
Antisense Primer (10 pmol) 2 μl
DMSO 1 μl
H2O add 50 μl
Gesamtansatz 50 μl
Bei der Durchführung einer Duplex-PCR (mit GAPDH als Housekeeping-Gen) wurde der beschriebene Ansatz zusätzlich mit je 2 μl G1-S-Primer sowie G2-AS-Primer (beide 10 pmol) versetzt und das H2O-Volumen angepasst.
Bei den durchgeführten RT-PCRs, dem Aci I-Verdau mit anschließender PCR sowie bei der Erstellung von Konstrukten kam folgendes Standard-Programm zum Einsatz:
Standard Programm
Vorgang Temperatur Zeit Sprung Zyklen 1. Denaturierung 94°C 2 min
2. Denaturierung 94°C 15 sec 3. Annealing TM –(2-4°C) 30 sec
4. Elongation 72°C 6 sec/100bp 2 32-40 5. Elongation 72°C 5 min
6. Konservierung 4°C Pause
Bei problematischen PCR-Reaktionen wurde ein sogenanntes „Touch-down“-Programm eingesetzt. Hierbei wird in den ersten 12 Zyklen versucht, durch ein Temperatur-Inkrement die optimale Annealing-Temperatur zu treffen, um so eine Basismenge des gesuchten PCR-Produkts zu erzeugen. Die folgenden 28 Zyklen werden mit der als optimal berechneten Annealing-Temperatur durchgeführt.
Dieses Vorgehen kam bei der PCR-Reaktion nach der Bisulfit-Behandlung (siehe 2.2.3.3) zum Einsatz, da hier die Amplifikation des spezifischen DNA-Abschnitts durch die Basen- Konversion häufig nur zu geringen PCR-Produkt-Mengen führte.
Touch-down Programm
Vorgang Temperatur Zeit Sprung Zyklen
1. Denaturierung 95°C 2 min 2. Denaturierung 95°C 15 sec 3. Annealing 60-48°C 30 sec
4. Elongation 72°C 1 min 2 12
5. Denaturierung 95°C 15 sec 6. Annealing Xx°C 30 sec
7. Elongation 72°C 1 min 5 28
