Untersuchung der Caspase 8 Expression

Um die Auswirkungen der JO2-Injektion auf die Expression von Caspase 8 zu beurteilen, wurde als nächstes das Expressionsniveau von Caspase 8 in den zu untersuchenden murinen hepatozellulären Karzinomen (HCCs) und zugehörigen nicht-tumorösem Lebergewebe durch RT-PCR untersucht.

Hierfür wurde aus dem gewonnen Tumor- sowie Normalgewebe Gesamt-RNA isoliert und mittels reverser Transkription (RT) komplementäre DNA (cDNA) erzeugt. Mit dieser konnte analog zu den in Kapitel 3.2.2.1 beschriebenen Experimenten eine für Caspase 8 und GAPDH spezifische PCR durchgeführt werden. Als Positivkontrolle wurde cDNA einer Maus des DBA2-Stamms verwendet. Die Ergebnisse sind in Abbildung 19 dargestellt.

Es zeigten sich starke Unterschiede im Expressionsniveau von Caspase 8 zwischen der JO2 behandelten Kontrolle (Maus 10) und den transgenen Tieren. Besonders hervorzuheben ist die relativ starke Expression von Caspase 8 in HCCs des Tieres #8, die mit massiver Apoptose und hohen Transaminasen korreliert ist (vergleiche Abb.17 und 18). Weiterhin fällt auf, dass in dem nicht-tumorösen Lebergewebe der Tiere #11 und #12 nur eine minimale Caspase 8 Expression nachweisbar war. Dies ist in guter Übereinstimmung mit den übrigen Befunden aus diesen Tieren nach JO2 Applikation (hohe Vitalität, mittlere Erhöhung der Transaminasen im Vergleich zu anderen Tieren, keine signifikante Apoptose in der Leber), was darauf hinweist, dass diese Tiere unter anderem aufgrund reduzierter Caspase 8 Expression vor Fas-induzierter Apoptose geschützt waren, während in anderen Mäusen wie z. B. Tier #8 eine relativ starke Caspase 8 Expression mit massiver Apoptose einherging.

Abb. 19: RT-PCR-Analyse der Expressionsmuster von Caspase 8 in hepatozellulären Karzinomen (HCCs) aus c-myc- oder IgEGF transgenen Mäusen nach Applikation von JO2-Antikörper; Es wurde 1,7 μg Antikörper/g Körpergewicht injiziert.

Die Nomenklatur der Mäuse wurde aus Tabelle 2 übernommen, der jeweilige genetische Hintergrund ist in der zweiten Spalte angegeben. Die Mäuse # 1 bis 3 erhielten keinen Jo2-Antikörper und fungierten somit als Kontrolltiere (siehe Spalte 3). Die erste Lane der RT-PCR-Analysen zum Nachweis von Caspase 8 jeder Maus zeigt entnommenes Normalgewebe. Es folgen die Analysen der entnommenen Tumoren jeder Maus (vgl. Tab.

2). Als interner Standard diente die Messung des housekeeping-Gens GAPDH.

4 Diskussion

Zelltod durch apoptotische Mechanismen spielt eine duale Rolle in der Leber. Einerseits basieren viele Lebererkrankungen wie z. B. das akute Leberversagen oder die chronische HCV-Infektion auf einer massiven Schädigung von Hepatozyten durch Apoptose (81). Auf der anderen Seite wird davon ausgegangen, dass ein Fehlen von apoptotischen Faktoren wie Caspasen oder Rezeptoren der TNF Familie zumindest partiell für Tumorentwicklung und Chemoresistenz verantwortlich sind (81; 82). Apoptose-vermittelter Zelltod spielt eine Schlüsselrolle in der Regulation von physiologischen und pathologischen Abläufen.

Darüber hinaus wird in den meisten Fällen über Apoptose die Therapie-induzierte Zytotoxizität, z. B. durch Chemotherapeutika, vermittelt (83-86).

Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Expression des pro-apoptotischen Faktors Caspase 8 in etablierten HCC-Modellen zu untersuchen.

Dazu wurden bereits beschriebene, leberspezifische transgene Mausstämme verwendet, welche entweder das Protoonkogen c-myc (AAT-myc) oder den Wachstumsfaktor IgEGF (alb-IgEGF) hepatozytenspezifisch exprimieren. Diese Tiere entwickeln innerhalb von 7 bis 14 Monaten Lebertumoren (67). Während Caspase 8 in der Leber normalerweise konstitutiv exprimiert wird, wurde im Rahmen dieser Arbeit in etwa 50% der untersuchten Tumoren keine Caspase 8 mRNA-Expression gefunden. Die ausführliche Analyse des molekularen Mechanismus, der zum Caspase 8 Silencing führte, war das zweite Ziel dieser Arbeit.

Durch Sequenzierung und Southern Blot Analyse wurde gezeigt, dass die Inaktivierung der Caspase 8 Expression nicht auf Punktmutationen im Caspase 8 Promoter und auch nicht auf genomische Deletionen des murinen Caspase 8 Lokus zurückzuführen ist. Dies deutet auf andere ursächliche Mechanismen hin.

Für die humane Caspase 8 wurde bereits ein Silencing im juvenilen Neuroblastom (50), im Lungenzell-Karzinom (87) sowie für von diesen Tumoren ausgehende Zelllinien beschrieben. Diese Expressionsinaktivierung war verbunden mit der Hypermethylierung des Caspase 8 Gens. Allerdings ist der genaue Mechanismus des Silencings der humanen Caspase 8 durch Methylierung nicht geklärt, da gezeigt wurde, dass der in Tumoren hypermethylierte Bereich im Intron 3 (50; 52) lokalisiert ist, während ein Gensilencing

üblicherweise durch Hypermethylierungen an Promotersequenzen verursacht wird. Der humane Caspase 8 Promoter, der in vorhergehenden Studien identifiziert wurde, ist in den oben beschriebenen Tumoren nicht methyliert und enthält darüber hinaus auch kaum Zielsequenzen für Methylierungen (78).

Um potentielle Methylierungen am murinen Caspase 8 Promoter in Tumoren zu untersuchen, wurde dieser zunächst analog zu dem bereits beschriebenen humanen Promoter (78) kloniert und charakterisiert. Dabei zeigte sich, dass die basale Aktivität des humanen und des murinen Promoters gleichermaßen durch Bindungsstellen des Transkriptionsfaktors SP1 vermittelt wird. Die DNA-Sequenz beider Promotoren zeigte allerdings keine signifikanten Homologien. Weitere Unterschiede zeigten sich bei der Basenzusammensetzung beider Promotoren. So gibt es im humanen Caspase 8 Promoter keinen erhöhten Gehalt an CG-Dinukleotiden und dementsprechend keine CpG-Islands (52; 78). Im Gegensatz dazu findet sich eine hohe Anzahl von CG-Dinukleotiden im murinen Caspase 8 Promoter. Interessanterweise sind zwei der gefundenen CpG Sites im Mauspromoter mit zwei funktionellen SP1 Bindungsstellen co-lokalisiert. Um den Mechanismus des Caspase 8 Silencing zu klären, wurden zunächst Caspase 8 Promotersequenzen aus Lebertumoren auf CpG-Methylierung mittels genomischer Bisulfit Sequencierung (Bgs; Bisulfite genomic sequencing) untersucht. Für diese Methode wird eine große Menge an genomischer DNA (2μg) benötigt (vgl. Kapitel 3.2.3.1). Daher konnte diese Methode ausschließlich mit großen Tumoren durchgeführt werden, aus denen eine ausreichende Menge an DNA isoliert werden konnte (vgl. Tabelle 1).

Das Methylierungsmuster der Caspase 8 Promotoren aus drei relativ großen Tumoren (# 15, 70, 78), die keine Caspase 8 Expression aufwiesen, zeigten eine starke Methylierung an CG-Dinukleotiden im Vergleich zu Promotoren aus gesunden Leberproben bzw. aus dem Caspase 8 exprimierenden Tumor #55. Bei den Tumoren ohne Caspase 8 Expression wurde im 5´-Bereich des Promoters ein gleichartiges Methylierungsmuster gefunden, das in allen Proben eine starke CpG-Methylierung zeigte. Diese stark methylierte Sequenz beinhaltet die beiden SP1 Bindungsstellen, die für die basale Aktivität des Wildtyp-Caspase 8 Promoters essentiell sind. Daher wurden zwei unterschiedliche Hypothesen zur Erklärung des Caspase 8 Silencings durch dieses Methylierungsmuster formuliert. Zum einen könnte eine Methylierung dieser Region die übergeordnete Promoterstruktur so komprimieren, dass die Interaktion von Transkriptionsfaktoren wie z. B. SP1 an den

Promoter vollständig verhindert und die Trans-Aktivierung von Caspase 8 somit unterbunden wird (88). Zum anderen könnte eine Methylierung der SP1 Konsensussequenz die Bindung von SP1 unmittelbar blockieren.

Die Möglichkeit, eine SP1 Bindung durch CG-Methylierung der Zielsequenz zu inhibieren, wird kontrovers diskutiert. Frühere Studien zeigten, dass eine artifizielle Methylierung des SP1 Konsensuselements keinen Einfluß auf die Affinität von SP1 an seine Erkennungssequenz hat (89). Allerdings wurde auch gezeigt, dass im p21^Cip1 Promoter eine Promotermethylierung in direkter Nachbarschaft zur SP1 Konsensussequenz die Bindung von SP1 vollständig inhibiert (90).

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde zumindest in vitro nachgewiesen, dass eine CpG-Methylierung der SP1 Bindungsstellen im murinen Caspase 8 Promoter ausreichend ist, um die Bindung von SP1 vollständig zu verhindern. Allerdings konnte dieser Effekt nur eindeutig beobachtet werden, wenn beide DNA-Stränge methyliert waren. Bei alleiniger Methylierung am Sense-Strang war die SP1 Affinität zu seiner Erkennungssequenz unverändert im Vergleich zu unmethylierter DNA. Die Methylierung des Antisense-Strangs hingegen zeigte eine leicht reduzierte Affinität für SP1. Folglich unterstützen diese Daten die Hypothese, dass eine Methylierung der SP1 Erkennungssequenzen im Caspase 8 Promoter die SP1-vermittelte Transaktivierung von Caspase 8 inhibiert wodurch das eigentliche Silencing von Caspase 8 in den Tumoren verursacht wird. Die Mutationsanalysen der beiden benachbarten SP1 Bindungsstellen ergaben, dass beide Elemente für die basale Promoteraktivität erforderlich sind. Eine gleichzeitige Hypermethylierung beider SP1 Sites könnte eine sterische Beeinträchtigung der simultanen SP1 Bindung an beide Konsensuselemente, die für die Caspase 8 Transkription benötigt werden, bewirken.

Um die Hypothese, dass die Methylierung des Caspase 8 Promoters für die Hemmung der Genexpression verantwortlich ist, weiter zu unterstützen, wurden in vitro methylierte Promoter-Reporterkonstrukte hergestellt und untersucht. Ein Problem bei der Auswertung dieser Daten bestand darin, dass bereits die Methylierung des Luziferase-Reportergens die Luziferaseaktivität auf 30% der Ausgangsaktivität reduzierte, wie initiale Kontrollexperimente zeigten. Eine ähnlich Beobachtung wurde bei einer vergleichbaren Studie mit APC-Gen Promoterkonstrukten gefunden, in der ebenfalls die in vitro Methylierung untersucht wurde (91).

Darüber hinaus zeigt dieses Experiment, dass eine vollständige Methylierung aller CG-Dinukleotide im murinen Promoters dessen Aktivität auf Hintergrundniveau drosselt (Reduktion auf 1,9%). Es kann allerdings mit diesem Experiment nicht völlig ausgeschlossen werden, dass die Methylierung des Caspase 8 Promoters nicht nur direkt durch Inhibition der SP1 Transaktivierung, sondern eventuell auch indirekt über die Ausbildung von kompakteren DNA-Strukturen die Caspase 8 Expression inhibiert.

Interessanterweise wurde in vielen Tumoren ohne Caspase 8 Expression ein Co-Silencing für cFLIP gefunden. Dieses Ergebnis war unerwartet, da cFLIP ein Antagonist der Caspase 8 ist und eine gleichzeitige Repression beider Faktoren keinen offensichtlichen, biologischen Sinn ergibt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der molekulare Mechanismus des cFLIP-Silencings in HCCs nicht weiter untersucht, obwohl dies möglicherweise die Funktion und Spezifität der beteiligten Methyltransferasen während der HCC Entwicklung genauer klären könnte. Die murinen Gen-Loki für Caspase 8 und cFLIP befinden sich auf Chromosom 1 und sind genetisch gekoppelt (49). Der hohe Grad der Sequenzhomologie von Caspase 8 und cFLIP zusammen mit der genetischen Kopplung deuten darauf hin, dass beide Gene im Rahmen der Evolution durch Genduplikation entstanden sind. Eine Erklärung für das unerwartete Co-Silencing von Caspase 8 und cFLIP wäre daher, dass während der frühen Tumorentwicklung Methyltransferasen wie DMNT 1, 2 oder 3 (92) eher lokusspezifisch größere chromosomale Abschnitte methylieren und nicht gezielt Tumorsuppressorgene inaktivieren.

Die Häufigkeit des Caspase 8 Silencings war stark vom jeweils verwendeten Mausmodell abhängig. Obwohl 100% der aus alb-IgEGF-transgenen Mäusen entnommenen HCCs keine Caspase 8 Expression mehr aufwiesen, entwickelten nur 22% der AAT-c-myc-transgenen und 16% der alb-IgEGF/AAT-myc-AAT-c-myc-transgenen Tiere Tumoren, mit einem Silencing von Caspase 8. Die im Vergleich zu den alb-IgEGF-transgenen Mäusen niedrige Frequenz des Silencings in den doppeltransgenen Mäusen ist dabei besonders schwer zu erklären. In diesem Zusammenhang könnte die Wachstumsgeschwindigkeit der unterschiedlichen HCCs eine besondere Rolle spielen. Doppeltransgene alb-IgEGF/AAT-myc Mäuse entwickelten besonders schnell in einem Alter von 3 bis 6 Monaten Tumoren und zeigten eine frühe Mortalität. Die einfach transgenen alb-IgEGF und AAT-myc Mäuse hingegen entwickelten erst im Alter von 9 bis 12 bzw. 12 bis 15 Monaten Lebertumoren (67). Die Methylierung des Caspase 8 Promoters und das nachfolgende Silencing könnte

deswegen ein spätes Ereignis in der Hepatokarzinogenese sein, das in erster Linie bei überlebenden Tieren mit einer relativ langen Tumorlatenzzeit auftritt. Eine Inaktivierung der Caspase 8 zu einem späten Zeitpunkt könnte dann eine weitere HCC-Entwicklung in diesen Tumoren begünstigen.

Es wird davon ausgegangen, dass die Promotermethylierung von der Expression von Methyltransferasen wie z. B. DMNT1 und DMNT3a abhängig ist (93-95). Der konkrete molekulare Zusammenhang zwischen IgEGF- oder c-myc-Überexpression und erhöhter Methyltransferaseaktivität ist nicht bekannt. Aktuelle Microarry-Genexpressionsanalysen von alb-IgEGF Tumoren zeigen keine direkte Verbindung zwischen transgener IgEGF Überexpression und einer Aktivierung von Methyltransferasen (96), was entweder impliziert, dass die verwendeten Microarrays die relevanten Methyltransferasen nicht enthielten, oder dass die Methylierung in IgEGF trangenen Mäusen einen indirekten, komplexen Prozess darstellt.

Im Gegensatz dazu gibt es Hinweise, dass das Onkogen c-myc Methyltransferasen direkt zu verschiedenen Zielgenen rekrutieren kann (97). Dieser Mechanismus könnte eventuell auch bei der nachgewiesenen Methylierung des Caspase 8 Promoters in AAT-myc-transgenen Tieren eine Rolle spielen, wobei diese Hypothese durch weiterführende Untersuchungen erhärtet werden müsste.

Die bisher diskutierten Daten zeigten, dass murine HCCs aus IgEGF- oder c-myc- transgenen Mäusen eine hohe Inzidenz für eine Caspase 8 Inaktivierung zeigen. In weiterführenden Versuchen sollte daher untersucht werden, inwieweit das Caspase 8 Silencing zur Apoptoseresistenz und damit auch zur Chemoresistenz gegen therapeutisch relevante Medikamente beitragen könnte. Hierzu wurde eine Gruppe von älteren (≥ 9 Monate) c-myc- oder IgEGF-transgenen Mäusen mit einer hohen Wahrscheinlichkeit für HCCs sowie nicht-transgene Kontrolltiere mit einem Fas-aktivierenden Antikörper (JO2) behandelt. In Wildtyp-Mäusen führt eine intraperitoneale Injektion von JO2 innerhalb weniger Stunden zum Tod der Tiere durch akutes Leberversagen aufgrund massiver Apoptose in der Leber (98).

In dem durchgeführten Experiment zeigten die Wildtyp-Kontrollen nach JO2 Applikation wie erwartet massive Apoptose in der Leber, die mit erhöhten Serumtransaminasen und Caspase 8 mRNA-Expression korreliert. Für die untersuchten c-myc- und IgEGF-transgenen Mäuse wurde eine große Variabilität in der Antwort auf die Fas Stimulation

beobachtet. Während in einigen Tieren nach JO2 Gabe starke Apoptose beobachtet wurde, die mit extrem erhöhten Serumtransaminasen und starker Caspase 8 Expression sowohl in der nicht-tumorösen Leber als auch in den untersuchten HCCs einherging, waren andere Tiere vor Fas-vermittelter Apoptose vollständig geschützt und exprimierten nur geringe Mengen an Caspase 8. Somit kann davon ausgegangen werden, dass die erworbene Resistenz gegen Apoptose zumindest in einigen der hier untersuchten Tiere einen wichtigen Mechanismus im Rahmen der Tumorgenese darstellt. Allerdings scheint eine Inaktivierung von Caspase 8 nicht der einzige Mechanismus für diesen protektiven Effekt zu sein, da in den meisten untersuchten Proben zumindest noch eine schwache Caspase 8 Expression nachweisbar war. Die hier dargestellten Daten weisen darauf hin, dass im Rahmen der c-myc- oder IgEGF-induzierten Tumorgenese noch weitere pro-apoptotische Faktoren inhibiert werden.

Ein Problem bei der Auswertung dieser Experimente war sicherlich der sehr kleine Stichprobenraum der zur Verfügung stehenden Tiere. Zudem wiesen nicht alle verwendeten transgenen Tiere auch tatsächlich HCCs auf, wodurch die Gruppengröße ungewollt weiter verkleinert wurde. Auf Grund der langen Latenzzeit von 9-12 Monaten bis zur Bildung von HCCs in den verwendeten Mäusen war es im Rahmen dieser Arbeit nicht möglich, einen größeren Stichprobenraum von Tieren zu analysieren.

In diesem Zusammenhang muss auch die Analyse bzw. die Vergleichbarkeit der Caspase 8 Expression in den HCCs kritisch diskutiert werden. In unerwartet vielen Tumoren war immer noch zumindest schwache Caspase 8 Expression nachweisbar, während in den vorausgegangenen Experimenten ca. 50% der untersuchten HCCs keine Caspase 8 Expression zeigten. Für einen aussagekräftigeren Vergleich der Genexpression müssten hier in Zukunft sicherlich sensitivere Methoden wie z. B. die quantitative real-time PCR (TaqMan^©) verwendet werden, die zum Zeitpunkt der durchgeführten Experimente allerdings nicht zur Verfügung standen.

Ein besonderes Problem der Therapie von hepatozellulären Karzinomen stellt die Resistenz gegen die meisten Chemotherapeutika dar (99). Dieses Phänomen wird im Englischen mit dem Begriff „multidrug resistance“ (MDR) beschrieben (99). Diese Resistenz schließt typischerweise Therapeutika mit ein, die sich strukturell und funktionell nicht unbedingt ähneln. Daher scheint MDR ein übergeordneter Mechanismus zu sein, der allen Medikamentenwirkungen gemein ist. MDR ist eines der größten Probleme in der

heutigen Krebstherapie und betrifft nicht nur das HCC, sondern auch weitere Karzinome, wie z. B. das kindliche Neuroblastom (100), maligne Gliome (101) oder Medulloblastome (102), die ebenfalls Resistenzen gegen chemotherapeutische Medikamente aufweisen.

Deshalb erfordert dieses Thema eine besondere Aufmerksamkeit. Im Besonderen die Fehlregulation apoptotischer Signalwege wird als Ursache dieser Therapieresistenzen vermutet, wie im folgenden Abschnitt genauer erläutert werden soll.

Es wird angenommen, dass unter anderem epigenetische Modifizierungen, wie die DNA-Methylierung, zu einem Genfunktionsverlust sowie zur Tumorentstehung beitragen können (79). Zielgene der epigenetischen Inaktivierung während der Tumorgenese sind insbesondere Tumorsuppressorgene (TSG). Durch ihren Genfunktionsverlust wird die Karzinogenese begünstigt (103; 104). Charakteristisch für epigenetische Veränderungen ist, dass sie reversibel sind und nicht auf Veränderungen der DNA-Sequenz beruhen (88; 105-107). Im Speziellen die Methylierung von normalerweise unmethylierten CpG Sites im Promoterbereich von TSG ist häufig mit Tumorentstehung assoziiert (103; 108;

109) und wurde im Rahmen dieser Arbeit ebenfalls für den Caspase 8 Promoter in murinen HCCs nachgewiesen. Die Inaktivierung von Caspase 8 in der Leber könnte daher nicht nur eine Tumorentstehung begünstigen, sondern auch zur Chemoresistenz des HCCs beitragen.

Es ist daher zu diskutieren, ob eine Reversion der Caspase 8 Promotermethylierung eine Tumorprogression inhibieren und Chemoresistenz aufheben könnte.

Ein vielversprechender therapeutischer Ansatz ist die Verwendung von demethylierenden Verbindungen wie z. B. 5-Aza-2’deoxycytidine (5-dAzaC), welches zur Demethylierung von CpG-Dinukleotiden führt (110). Applikation von 5-dAzaC könnte zu einer Caspase 8 Re-Expression in HCCs und damit zu einer Apoptosesensitivität des Tumor führen. In Ewing-Tumor-Zelllinien konnte durch den Einsatz von 5-dAzaC eine Re-Expression von Caspase 8 mRNA und -Protein bereits erreicht werden (111). Als zukünftige, alternative Methode zur Expression von Caspase 8 in Tumoren könnte versucht werden, zunächst im Tiermodell eine Caspase 8 Gentherapie zu etablieren (111).

Die hier dargestellten Ergebnisse sowie Studien anderer Arbeitsgruppen um TEITZ, HOPKINS-DONALDSON und GROTZER zeigen, dass Caspase 8 wahrscheinlich zur Gruppe der Tumorsuppressorgene gehört (50; 112; 113). Eine sichere Klassifizierung von Caspase 8 zu den TSG wird aber erst nach eingehenderen Untersuchungen, z. B. in konditionalen Caspase 8 knockout Mäusen möglich sein.

Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass in murinen hepatozellulären Karzinomen der proapototische Faktor Caspase 8 häufig nicht exprimiert wird. Dieses Silencing korreliert mit einer Hypermethylierung des Caspase 8 Promoters. Die basale Caspase 8 Expression wird insbesondere durch zwei SP1 Sites im Promoter reguliert.

Diese SP1 Bindungsstellen sind während der Onkogenese Ziele für die Promotermethylierung, wodurch unmittelbar die Bindung von SP1 und damit die Transaktivierung von Caspase 8 verhindert wird. Der Nachweis des Caspase 8 Silencings könnte ein vielversprechender diagnostischer Marker für eine frühe HCC-Entwicklung sein und die Resistenz gegen chemotherapeutische Pharmaka im Rahmen einer HCC-Therapie erklären.