Das grundlegende Problem der vorliegenden Arbeit bestand in der langen Latenzzeit bis zur Bildung von hepatozellulären Karzinomen in den verwendeten transgenen Mausstämmen. Dadurch war der zu Verfügung stehende Stichprobenumfang für die hier dargestellten Versuche stark limitiert, so dass unter anderem vielversprechende Experimente wie die Fas-Applikation in potentiell tumorösen Mäusen mit suboptimalen Tierzahlen durchgeführt werden mussten.
Ein weiteres Problem war das limitierte HCC-Probenmaterial aufgrund zum Teil sehr kleiner HCCs. Für eine optimale Analyse der HCCs wäre jeweils eine Isolierung von RNA, DNA und Proteinextrakten nötig gewesen, wozu in vielen Fällen jedoch kein ausreichendes Gewebematerial zur Verfügung stand. Insbesondere für die Messung der Promotermethylierung durch die genomische Sequenzierung nach Bisulfitkonvertierung stand in vielen Fällen die erforderliche Menge von 2 μg genomischer DNA nicht zur Verfügung, so dass die Methylierungsanalyse nur mit ausgewählten HCC Proben durchgeführt werden konnte.
Die Messung von Methylierungsmustern in Promotoren ist eine anspruchsvolle und fehleranfällige Methode, die in einer Reihe von Publikationen kritisch dargestellt und diskutiert wird (114-116). Die Qualität der erhaltenen Daten hängt wesentlich von der vollständigen chemischen Umsetzung von Cytosinresten durch Natriumbisulfit ab.
Während der Durchführung dieser Arbeit mussten diese Methoden eigenständig etabliert
und optimiert werden. Mittlerweile sind allerdings kommerzielle Kits erhältlich, die eine optimierte Methylierungsanalyse erlauben.
4.2 Ausblick
Die Daten dieser Studie geben neue Einblicke in die Rolle von Caspase 8 bei der Entstehung hepatocellulärer Karzinome und könnten Bedeutung für die Entwicklung neuer Therapiekonzepte haben. In diesem Sinne scheint der Chemotherapie und der Chemoresistenz von HCCs ein besonderer Stellenwert zuzukommen.
Die Demethylierung methylierter Promoterabschnitte kann zu einer erneuten Caspase 8 Expression in vitro führen. Dieser Befund könnte in Zukunft auch in vivo genutzt werden, um Karzinom-Zellen wieder für Apoptose zu sensitivieren. Über diesen Weg könnte eine Überwindung der Resistenz gegen gängige Chemotherapeutika möglich werden, da in der Regel der zytotoxische Effekt über apoptotische Mechanismen induziert wird.
Chemoresistenz korreliert daher vermutlich immer mit Apoptoseresistenz der Tumorzellen (23-25).
Wird, wie in der hier dargestellten Arbeit, Apoptoseresistenz durch Promotermethylierungen verursacht, könnten demethylierende Medikamente wie z. B. 5-Aza-2’deoxycytidine (5dAzaC) in der zukünftigen Tumortherapie zum Einsatz kommen (111). Allerdings bringt dieses Vorgehen auch Probleme mit sich, da Promotermethylierungen auch physiologisch zur Genregulation komplexer Organsysteme beitragen.
Ein systemischer Einsatz von 5-dAzaC wird allerdings immer unspezifisch demethylieren und somit auch physiologisch gewünschte Methylierungen aufheben, was unkontrollierbare Folgeschäden mit sich bringen könnte. Für einen sinnvollen, therapeutischen Einsatz von 5-dAzaC müsste somit eine lokale und transiente Applikation etabliert werden.
Ein weiterer Vorteil im klinischen Alltag könnte das diagnostische Screening auf vorhandene Basalexpression von Caspase 8 sein. Noch bevor der Patient einer oft erfolglosen Chemotherapie zugeführt werden würde, könnte anhand des Expressionsmusters die Erfolgswahrscheinlichkeit abgewogen werden. Im Falle einer vorliegenden Methylierung in Verbindung mit einer verminderten oder aufgehobenen
Caspase 8 Expression könnte über den Einsatz von Demethylasen oder zumindest von Therapieformen nachgedacht werden, die nicht über apoptotische Mechanismen verlaufen.
Dieses Vorgehen würde auch Patienten, denen eine erfolgreiche Chemotherapie bis dahin verschlossen geblieben wäre, neue Chancen eröffnen.
5 Zusammenfassung
Caspase 8 steht am Anfang einer Caspase-Kaskade und ist für die Auslösung von Apopto-se durch Stimuli wie FasL und TNF von Bedeutung. Die AnalyApopto-se des humanen CaspaApopto-se 8 Promoters zeigt, dass basale Caspase 8 Aktivität vor allem über den Transkriptionsfaktor SP1 vermittelt wird und eine zusätzliche Stimulation des Promoters über einen p53-abhängigen Mechanismus möglich ist. Da bekannt ist, dass das hepatozelluläre Karzinom (HCC) häufig mit Mutationen des p53 Gens assoziiert ist, sollte im Rahmen dieser Studie die Expression von Caspase 8 in murinen HCCs untersucht werden. Für diese Untersu-chungen wurden c-myc bzw. IgEGF transgene Mausstämme verwendet. Diese Tiere ent-wickeln in 6-12 Monaten HCCs. Aus HCC Knoten wurde RNA isoliert und mittels RT-PCR auf Caspase 8 Expression untersucht. In 46% der untersuchten Tumoren konnte keine basale Caspase 8 Expression mehr nachgewiesen werden. Um zu überprüfen, ob das Silen-cing von Caspase 8 auf Methylierung von CpG Dinukleotiden im Promoter zurückzufüh-ren ist, wurde ein für Caspase 8 spezifischer Methylierungsassay etabliert. Auf diese Weise wurden in den HCCs fünf hypermethylierte Sequenzbereiche identifiziert. Zwei dieser Se-quenzabschnitte sind mit Bindungsstellen für SP1 identisch. Die Funktionalität der SP1 Bindungsstellen für die Caspase 8 Promoteraktivität wurde durch Gelshift-Analysen und Luziferase-Reporterexperimente nachgewiesen. In vitro Methylierung des Caspase 8 Pro-moter unter Verwendung des Enzyms CpG-Methylase zeigte, dass ein entsprechend me-thyliertes Promoter-Luciferase Reporterkonstrukt eine dramatische Reduktion der Promo-teraktivität aufweist. Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass Caspase 8 in etwa 50%
der untersuchten HCCs nicht mehr exprimiert wird, was auf eine Hypermethylierung von Regulationselementen der basalen Transkription wie z. B. SP1 zurückzuführen ist.
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