Die eingesetzte murine Hepatomzelllinie Hepa 1-6 wurde in 250 ml Gewebekulturflaschen mit 10 ml DMEM (mit 10% FCS und 1% Penicillin/Streptomycin) bei 37°C, 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit kultiviert.Die Zellen wurden als einschichtiger Zellrasen gehalten.
Bei Erreichen der Konfluenz des Zellrasens wurden die Zellen umgesetzt. Dazu wurde das Medium abgesaugt, die Zellen mit PBS gewaschen und trypsiniert (2 ml 1 X Trypsin). Die Inkubation erfolgte 2-5 min im Brutschrank. Anschließend konnten die Zellen durch Klopfen vom Flaschenboden gelöst werden. Nach Zugabe von 8 ml DMEM wurden die Zellen resuspendiert und durch auf- und abpipettieren vereinzelt. Die Zellen wurden im Verhältnis 1:5 oder 1:10 mit frischem Medium verdünnt und neu ausgesät.
Alle Arbeiten im Umgang mit Zellen wurden unter einer sterilen Werkbank mit sterilen Geräten und Lösungen durchgeführt.
2.2.5.2 Kryokonservierung von Zellen
Zum Kryokonservieren von Zellen wurden diese zunächst trypsiniert (wie oben beschrieben) und für 5 min (1000 rpm/Raumtemperatur) zentrifugiert. Das so entstandene
Pellet wurde in Einfriermedium (DMEM mit 20% FCS und 10% DMSO) resuspendiert und die Lösung in Kryoröhrchen (Nunc) überführt. Mit einer Einfrierhilfe (Fa. Nunc) wurden die Zellen dann langsam (1°C/Minute) in einem –80°C Gefriefschrank eingefroren und anschließend in flüssigen Stickstoff überführt.
2.2.5.3 Auftauen von Zellen
Die dem Stickstofftank entnommenen Zellen wurden rasch bei 37°C im Wasserbad aufgetaut. Die Zellen wurden mit 10 ml Kulturmedium verdünnt, in Zellkulturflaschen überführt und bei 37°C und 5% CO2 kultiviert. Nach erfolgter Adhäsion der Zellen (4-8 Stunden) wurde das Medium gewechselt.
2.2.5.4 Transiente Transfektion mittels PolyFect Reagenz (Qiagen)
Durch transiente Transfektion kann Fremd-DNA effektiv in eukaryontische Zellen eingebracht werden. Die Transfektionsversuche wurden mittels PolyFect Reagenz der Firma Qiagen durchgeführt. Das Reagenz ist eine Lösung aus aktivierten Dendrimeren, die eine typisch verzweigte Struktur aufweisen, und sich aus 2 Monomeren zusammensetzen.
An den Enden der Verzweigungen befinden sich Aminogruppen, die mit den negativ geladenen Phosphatgruppen der Nukleinsäuren interagieren. So entsteht eine kompakte Struktur aus Plasmid-DNA und Dendrimer, die an die Zelloberfläche bindet, und so über unspezifische Endozytose in die Zelle aufgenommen wird.
Für die Transfektion wurden Hepa 1-6 Zellen eingesetzt. Diese wurden einen Tag vor der Transfektion mit einer Dichte von 8 X 105 Zellen/6 cm Schale ausgesät. Pro Kulturschale wurden 5 ml Zellsuspension eingesetzt. Die Zellkultivierung erfolgte für 24 Stunden im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2. Im Folgenden werden die Ansätze für eine Doppelbestimmung beschrieben.
Es wurden 2,5 μg Plasmid-DNA in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß pipettiert. Da als interner Standard der β-Galaktosidase Nachweis verwendet wurde, wurden zusätzlich 2 μl CMV-ß-Galaktosidasevektor zum Transfektionsansatz gegeben. Dieser wurde mit 300 μl reinem DMEM (ohne Zusatz von FCS und P/S) versetzt, kurz gevortext und einige Sekunden zentrifugiert (10000 x g/Raumtemperatur). Nach der Zugabe von 30 μl PolyFect Reagenz
wurde durch auf- und abpipettieren gemischt und der Ansatz 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Währenddessen wurden die Zellen einmal mit 4 ml PBS gewaschen und mit 3 ml frischem DMEM (10% FCS, 1% P/S) versetzt.
Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde der Transfektionsansatz auf zwei Eppendorfgefäße aufgeteilt. Nun konnte auf jedes Reaktionsgefäß 1 ml DMEM (10% FCS, 1% P/S) gegeben und gemischt werden. Anschließend wurde der komplette Ansatz aus einem Eppendorfgefäß auf eine der vorbereiteten Kulturschalen gegeben und diese vorsichtig geschwenkt. Die Zellen wurden für 24 Stunden bei 37°C und 5% CO2 im Brutschrank kuliviert und im Anschluss geerntet.
2.2.5.5 Luciferase-Assay
Der Luciferase-Assay wurde zur Quantifizierung der Promoteraktivität eingesetzt. Hierfür wurde das zu untersuchende Promoterkonstrukt mit einem Luciferasegen fusioniert, welches als Reportergen fungierte. Das Protein Luciferase katalysiert die Oxidation von Luciferin unter der Emission von Photonen (Abb. 5).
Abb. 5: Darstellung des zu Grunde liegenden Prinzips des Luciferase-Assays; Das zu untersuchende Promoterfragment wird in den pGL2-Basic-Vector kloniert und kontrolliert dort das luc-Gen. Es kodiert für das Enzym Luciferase, welches die Oxidation von Luciferin unter Emission von Photonen (Licht) katalisiert. Die entstandene Lichtmenge wird mit einem Luminometer (z. B. Lumat, Fa. Berthold) quantifiziert und ist proportional zur entstandenen Menge an Luciferase.
Das emittierte Licht kann mittels eines Luminometers (z. B. Lumat, Firma Berthold) quantifiziert werden und ist der Menge an gebildetem Protein proportional.
Nach der Transfektion mit Promoter-Luciferase Reporterplasmiden wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und anschließend mit 350 μl 1 X Extraktionspuffer versetzt.
Die Inkubation erfolgte für 10 min bei Raumtemperatur. Im Anschluss wurde das Zelllysat
abgeschabt, in 1,5 ml Eppendorfgefäße überführt und 5 min (10000 x g/Raumtemperatur) zentrifugiert. Der Überstand wurde in einem neuen Reaktionsgefäß bis zur Messung auf Eis gehalten. Für die folgende Emissionsmessung wurden pro Probe 300 μl Messpuffer in 5 ml Sarstedt-Röhrchen vorgelegt. Die Zugabe von 50 μl Zell-Lysat erfolgte erst direkt vor der Messung im Lumat.
Zur Auswertung wurde die relative Luciferaseaktivität aus der jeweiligen Luciferaseaktivität und dem zugehörigem β-Galaktosidase Wert, der als interner Standard eingesetzt wurde, ermittelt.
Luciferase-Assaypuffe Endkonzentration
25 mM Glycylglycin
15 mM MgSO4
frisch hinzufügen: 5 mM ATP
2.2.5.6 ß-Galactosidase-Assay
Zur Kontrolle der Transfektionseffizienz wurde der CMV-ß-Galaktosidasevektor kotransfiziert und die ß-Galaktosidaseaktivität bestimmt, welche direkt proportional zur Transfektionsrate ist. Zur Korrektur unterschiedlicher Transfektionseffizienzen wurde dann das Verhältnis aus Luziferaseaktivität/ß-Galaktosidaseaktivität bestimmt.
Die Aktivität der ß-Galaktosidase kann, nach Zugabe entsprechender Substrate, durch eine Farbreaktion photometrisch schnell und einfach nachgewiesen und anschließend quantifiziert werden.
Bei einem Transfektionsansatz mit 4 μg DNA wurde jeweils 1 μg CMV-ß-Galaktosidasevektor zugesetzt. Von den gewonnen Zellextrakten (siehe 2.2.5.6) wurden jeweils 10 μl auf eine Mikrotiterplatte (Fa. Greiner) pipettiert und 100 μl Assaypuffer hinzugegeben. Es wurde bei Raumtemperatur inkubiert, bis sich eine leichte Gelbfärbung zeigte. Anschließend wurde die Reaktion mit 50 μl 1 M Na2CO3 abgestoppt und die OD bei 405 nm im Photometer bestimmt. Der lineare Bereich liegt hierbei zwischen 0,2 und 0,8 OD405nm.
5x Extraktions-Puffer: (add 100ml) Endkonzentration
12,5 ml 1M Tris/phosphat (pH 7,8 mit H3PO4) 125 mM Tris/phosphat, pH 7,8 2 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0 10 mM EDTA, pH 8,0
50 ml 100% Glycerol 50% Glycerol
5 ml Triton X-100 5% Triton-X100
frisch zufügen:
2 µl/ml 1 M DTT-Lösung 2 mM DTT
Assaypuffer: (add 1 Liter) Endkonzentration 10,7 g Na2PO4 x 2 H20 60 mM Na2HPO4 5,4 g NaH2PO4 x H20 39 mM NaH2PO4
10 ml 1 M KCl-Lösung 10 mM KCl
1 ml 1M MgSO4-Lösung 1 mM MgSO4
frisch zufügen:
2 µl/ml 1 M DTT-Lösung 2 mM DTT 1 mg/ml ONPG
2.2.5.7 In vitro Promoter-Methylierungs-Assays
Um die Auswirkungen einer Methylierung des Caspase 8 Promoters auf dessen Aktivität in vitro zu überprüfen, wurden die Enzyme CpG Methylase (NEB) und Hpa II Methylase (NEB) eingesetzt. Die zu untersuchenden Promoter-Luziferase Fusionskonstrukte wurden zunächst mit CpG Methylase oder Hpa II Methylase gemäß folgendem Ansatz methyliert:
Reporterplasmid (2,5-10 μg) 2 μl CpG Methylase oder Hpa II Methylase 2 μl
Puffer 2 1 μl
S-adenosyl-Methionin (160 μM) 1 μl
H2O 4 μl
Gesamtansatz 10 μl
Nach einer 2-stündigen Inkubation bei 37°C im Brutschrank erfolgte die Hitzeinaktivierung des Enzyms bei 65°C für 20 min. Die Aufreinigung erfolgte mit Hilfe des QIAquick PCR Purification Kit der Firma Qiagen.
Im Anschluß erfolgte die photometrische Konzentrationsbestimmung der DNA. 2,5 μg methyliertes Reporterplasmid wurde zur Transfektion eingesetzt. Die Bestimmung der Promoteraktivität erfolgte mittels Luciferase-Assay und β-Gal als interener Abgleich.