Zur photometrischen Konzentrationsbestimmung von DNA wurde die optische Dichte (OD) der gelösten DNA bei 260 nm gemessen. Eine OD von 1,0 entspricht hierbei 50 μg/ml doppelsträngiger DNA (spezifischer Multiplikationsfaktor für doppelsträngige DNA). Unter Einbeziehung des Verdünnungsfaktors ergibt sich:
l
Durch zusätzliche Messung der OD bei 280 nm konnte eine Aussage über die Reinheit der DNA getroffen werden. Eine reine Nukleinsäurelösung weist im Verhältnis OD260nm/OD280nm einen Wert zwischen 1,8 und 2,0 auf.
Bei der photometrischen Konzentrationsbestimmung von RNA wurde analog zur DNA-Konzentrationsbestimmung verfahren. Allerdings entspricht eine OD von 1,0 hierbei 40 μg/ml RNA (spezifischer Multiplikationsfaktor für RNA) und ist beim Einsetzen in die Formel zu berücksichtigen.
2.2.1.2 Agarosegelelektrophorese
Zur Auftrennung und Visualisierung von DNA-Fragmenten und genomischer DNA wurde eine Agarosegelelektrophorese durchgeführt. Je nach der erwarteten Fragmentlänge wurden 0,5 bis 1,5% Agarosegele eingesetzt. Da Nukleinsäuren eine negative Ladung aufweisen, bewegen sie sich im elektrischen Feld gerichtet und lassen sich somit ihrer Größe entsprechend auftrennen. Durch die Färbung mit Ethidiumbromid konnten die Nukleinsäurefragmente unter UV-Licht (254 nm oder 366 nm) sichtbar gemacht werden, da Ethidiumbromid die DNA interkaliert.
Die Agarose (0,5-1,5%) wurde in TAE-Puffer gelöst und mit 0,0001 Vol.
Ethidiumbromidlösung (10 mg/ml) versetzt. Vor dem Auftragen wurden die DNA-Proben mit 0.2 Vol. 5 X Ladepuffer gemischt. Zur Charakterisierung der Banden wurde zusätzlich ein Größenstandard aufgetragen. Danach erfolgte die Auftrennung bei einer konstanten Spannung von 5 V/cm mit TAE als Laufpuffer.
50x TAE-Stammlösung: (add 1Liter) Endkonzentration
242 g Tris 2M Tris
57,1 ml Essigsäure 5,7% (v/v) Essigsäure
100ml 0,5M EDTA, pH 8,0 50 mM EDTA
Aus dieser Stammlösung wurde eine 1x Gebrauchslösung hergestellt.
5x DNA-Ladepuffer: (add 100 ml) Endkonzentration
50 mg Bromphenolblau-Natrium 0,05% (w/v) Bromphenolblau
50 mg Xylencyanol 0,05% (w/v) Xylencyanol
34 ml 100% Glycerol 30% Glycerol
20 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0 0,1 M EDTA
2.2.1.3 Transformation von E. coli
Für die Transformation (Aufnahme von Fremd-DNA in Bakterien) wurden chemisch kompetente One Shot ® TOP10 F’ E.coli Bakterien der Firma Invitrogen verwendet.
Pro Reaktion wurde ein 50 μl-Aliquot kompetenter Zellen vorsichtig auf Eis aufgetaut. Bei Verwendung des TOPO®-TA Cloning Kits der Firma Invitrogen wurden 2 μl Ligationsansatz, bei Klonierung in den pGL2-Vector 10 μl Ligationsansatz hinzugegeben und vorsichtig gemischt. Nach 30-minütiger Inkubation auf Eis wurden die Bakterien einem Hitzeschock (42°C/30 sec im Wasserbad) ausgesetzt und anschließend sofort wieder auf Eis überführt. Der Ansatz wurde mit 250 μl SOC-Medium versetzt und eine Stunde bei 200 rpm im Heizblock gerüttelt. Pro Reaktion wurden derweil 2 mit Ampicillin versetzte LB-Agarplatten im Brutschrank vorgewärmt. Nach abgelaufener Inkubationszeit wurden auf der einen Platte 50 μl Bakteriensuspension und auf der anderen Platte der Rest der Suspension ausplattiert. Die Agarplatten wurden umgedreht über Nacht bei 37°C im Brutschrank inkubiert.
Um nach T/A-Ligationsreaktion und Transformation in TOP10F‘-Zellen Bakterienkolonien mit religierten Plasmiden von Bakterienkolonien mit rekombinantem Plasmid zu unterscheiden, wurde das Verfahren der Blau-Weiß-Selektion angewandt.
Hierzu wurden zusätzlich folgende Lösungen benötigt:
40mg/ml X-Gal-Lösung:
400 mg 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid (X-Gal) wurden in 10 ml Dimethylformamid gelöst und bei –20°C gelagert.
100 mM IPTG-Lösung:
238 mg Isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosid (IPTG) wurden in 10 ml dest. H20 gelöst, zu je 1 ml aliquottiert und bei –20°C gelagert
Da TOP10F‘ Zellen einen Lac-Repressor überexprimieren, mussten die Agarplatten zur Blau-Weiß-Selektion mit 40 μl X-Gal-Lösung sowie mit 40 μl IPTG vorbehandelt werden.
IPTG verdrängt als allosterischer Inhibitor den Lac-Repressor vom Lac-Promoter des Plasmids, der das β-Galaktosidase-Gen steuert. Unter Anwesenheit von IPTG konnte die vom Plasmid kodierte β-Galaktosidase erzeugt werden, die dann X-Gal in eine blaues
Indigoderivat umsetzte. Es blieben nur die Bakterienkolonien weiß, in deren Plasmid eine Insertion die Transkription des β-Galaktosidase-Gen unterbunden hatte (lacZ-Mutanten).
2.2.1.4 Vermehrung transformierter Bakterienstämme
Zur Vermehrung plasmidtragender Bakterienklone wurde eine Vorkultur (2 ml LB-Medium mit Antibiotika versetzt) angesetzt und diese über Nacht bei 37°C im Bakterienschüttler bei 220 rpm inkubiert. Zur Mini-Plasmidpräparation wurden 1,5 ml Bakteriensuspension eingesetzt. Um DNA mit höherem Reinheitsgrad zu isolieren, wurde aus den Überständen der positiven Klone erneut eine Übernachtkultur in 5 ml LB-Medium angesetzt. Daraus wurde eine DNA-Präparation mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit der Firma Qiagen durchgeführt (siehe 2.2.1.6).
Zur Isolierung großer DNA-Mengen (Maxi Plasmidpräparation) wurde eine Übernachtkultur in 400 ml LB-Medium angesetzt und bei 37°C im Bakterienschüttler inkubiert.
2.2.1.5 Mini-Plasmidpräparation
Mit dieser Methode wurde DNA aus kleinen Bakterienkulturen (2 ml) isoliert. Sie wurde eingesetzt, um eine große Anzahl transformierter Bakterienklone im Restriktionsverdau schnell überprüfen zu können.
1,5 ml der Übernachtkultur wurden in ein Eppendorfgefäß überführt und 1 min bei 10000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde fast vollständig verworfen und das Pellet durch Vortexen resuspendiert. Zu dieser Suspension wurden 300 μl TENS-Puffer gegeben, durch ca. 5 sec vortexen gemischt und 2 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 150 μl 3 M NaAcetat-Lösung (pH 5.2) hinzugegeben, 5 sec gevortext und 5 min auf Eis inkubiert. Durch 5 min Zentrifugieren bei 10000 x g wurden Zellfragmente und chromosomale DNA pelletiert. Der Überstand wurde in ein neues Eppendorfgefäß überführt und mit 900 μl, bei –20°C vorgekühltem 95%-igem Ethanol versetzt. Durch 10 minütige Zentrifugation bei 10000 x g (4°C) wurde die Plasmid-DNA pelletiert und anschließend zweifach mit 70%-igem Ethanol gewaschen. Die DNA wurde 20 min an der
Luft getrocknet und anschließend in 50 μl TE-Puffer pH 8.0 aufgenommen. Die erhaltene DNA wurde bei –20°C gelagert.
TENS-Puffer: (add 0,5 Liter) Endkonzentration
5 ml 1 M Tris-HCl, pH 8,0 10mM Tris-HCl, pH 8,0
1 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0 1mM EDTA, pH 8,0
5ml 10N NaOH 0,1N NaOH
12,5 ml 20% SDS 0,5% SDS
TE-Lösung: (add 0,5 Liter) Endkonzentration
5 ml 1M Tris-HCl, pH 8,0 10mM Tris, pH 8,0
1 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0 1mM EDTA, pH 8,0
2.2.1.6 Mini-Plasmidpäparation mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit
Um für einige Untersuchungen, wie z. B. Sequenzierungen, besonders reine DNA zu isolieren, wurde ein QIAprep Spin Miniprep Kit verwendet. Von den im Restriktionsverdau positiven Klonen wurde zunächst eine Übernachtkultur in 5 ml LB-Medium angesetzt und bei 37°C im Bakterienschüttler inkubiert. Die Übernachtkultur wurde in ein Eppendorfgefäß überführt und 1 min bei 10000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde bis auf ca. 50 μl vollständig verworfen und das Pellet durch Vortexen resuspendiert. Die weitere Aufarbeitung der DNA erfolgte nach den Angaben des Herstellers (Qiagen). Zunächst wurde die Bakteriensuspension in 250 μl Puffer P1 aufgenommen und anschließend mit 250 μl Puffer P2 versetzt und durch 4-6 maliges Schwenken des Eppendorfgefäßes vermischt. Nachdem 350 μl Buffer N3 in das Eppendorfgefäß gegeben wurden und es vorsichtig gewendet wurde, wurde 10 min bei 10000 x g und Raumtemperatur zentrifugiert. Der dabei entstandene Überstand wurde auf eine QIAprep Säule pipettiert, 60 sec zentrifugiert (10000 x g; RT) und die dabei aufgefangene Flüssigkeit verworfen. Die DNA wurde an die Membran der QIAprep Säule gebunden. Zum Waschen wurden 750 μl Puffer PE auf die Säule gegeben und wie eben beschrieben zentrifugiert und verworfen. Die Säule wurde nun auf ein frisches Eppendorfgefäß gesetzt und 50 μl Puffer EB auf die Membran der Säule pipettiert. Nach
1 min Inkubationszeit wurde 1 min bei 10000 x g und Raumtemperatur zentrifugiert. Das 50 μl Eluat wurde bei –20°C gelagert.
2.2.1.7 Maxi Plasmidpräparation
Diese Plasmidpräparation wurde mit dem QIAGEN Endofree Maxi Kit der Firma Qiagen durchgeführt. Das Protokoll des Herstellers wurde ohne Abweichungen befolgt.
Die Verwendung endotoxinfreier DNA erhöht bei Transfektionsexperimenten die Effizienz des Transfers erheblich.
Eine Übernachtkultur von 400 ml wurde bei 3800 X g für 15 min bei 4 °C zentrifugiert und das Pellet in 10 ml P1 Puffer resuspendiert. Anschließend wurden 10 ml P2 Puffer dazugegeben, es wurde durch mehrmaliges Kippen des Zentrifungenröhrchens gemischt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zugabe von 10 ml gekühltem P3 Puffer wurde, wie oben beschrieben, gemischt und das Lysat in ein QIAfilter Cartridge gegeben.
Es folgte eine Inkubation von 10 min bei Raumtemperatur. Daraufhin wurde der Ansatz gefiltert und in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen aufgefangen. Nachdem 2,5 ml ER Puffer hinzugegeben wurden, erfolgte eine 30-minütige Inkubation auf Eis. Bevor das gefilterte Lysat auf ein QIAGEN-tip überführt wurde, wurde dieser mit 10 ml QBT Puffer äquilibriert. Nachdem das Lysat die Säule passiert hatte, wurde zweimal mit 30 ml QC Puffer gewaschen. Die Elution erfolgte mit 15 ml QN Puffer. Das Eluat wurde mit 10,5 ml Isopropanol versetzt, sofort gemischt und bei 13000 X g bei 4 °C für 30 min zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde mehrfach mit 70%-igem Ethanol gewaschen und anschließend erneut zentrifugiert (13000 X g/10 min). Nachdem der Überstand vorsichtig dekantiert wurde, wurde das Pellet 10 min an der Luft getrocknet und in 100 μl TE aufgenommen. Bei diesem Verfahren konnte bis zu 500 μg DNA isoliert werden.
2.2.1.8 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen
Die gewonnene Plasmid-DNA wurde mit Restriktionsenzymen gespalten. Es wurden Enzyme und dazugehörige Puffer von der Firma NEB eingesetzt. Es wurden jeweils 1-2 U Enzym/μg DNA eingesetzt. Nach Angaben des Herstellers wurde bei Bedarf BSA eingesetzt.
Nach 1 Stunde Inkubation bei 37°C wurde das Restriktionsenzym, falls notwendig, nach Herstellerangaben hitzeinaktiviert. Danach wurden 5 x DNA-Ladepuffer hinzugegeben und in einem 1%-igem Agarosegel (in TAE) aufgetrennt. Die DNA wurde durch EtBr gefärbt und unter UV-Licht (254 nm oder 366 nm) dargestellt. Die Identifizierung der Banden erfolgte durch Vergleich mit einem 1 kb + -DNA-Größenstandard der Firma Invitrogen.
2.2.1.9 Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
Zur Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen wurde das Qiaquick Gel Extraction Kit der Firma Qiagen verwendet, wobei das Herstellerprotokoll ohne Abweichungen befolgt wurde. Nach der Restriktionsspaltung wurde die gewünschte Bande nach elektrophoretischer Auftrennung mit einem Skalpell auf einem UV-Licht-Tisch ausgeschnitten. Um die DNA nicht zu zerstören, wurde 70%-iges UV-Licht zur Präparation eingesetzt.
Das Gel-Stück wurde mit dem 3-fachen Volumen an QG Puffer versetzt (100mg ∼ 100μl) und für 10 min im Heizblock bei 50°C inkubiert. Nachdem das Gel-Stück vollständig aufgelöst war, wurde ein einfaches Gelvolumen (100mg ∼ 100μl) Isopropanol hinzugegeben, gemischt und der komplette Ansatz auf eine QIAquick spin Säule überführt.
Um die DNA an die Säule zu binden, wurde nun 1 min bei 10000 x g in der Tischzentrifuge zentrifugiert. Zum Waschen wurden 750μl PE Puffer auf die Säule gegeben und erneut 1 min zentrifugiert. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt zur Trocknung der Membran wurden nun 30 bzw. 50 μl EB Puffer auf die Membran pipettiert, 1 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend durch 1 min Zentrifugation bei 10000 x g in der Tischzentrifuge eluiert. Die Kontrolle erfolgte mit einem Minigel.
2.2.1.10 Präzipitation von Nukleinsäuren
Zur Aufreinigung oder Konzentrierung wässriger DNA-Lösungen wurde diese durch Zugabe von 2 Volumina Ethanol (100%) und 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat pH 5.2 ausgefällt. Die Präzipitation erfolgte eine Stunde oder über Nacht bei –20°C. Nach einer Zentrifugation bei 4°C (15000 x g, 10 min) wurde der Überstand abgenommen, das Pellet
20 min an der Luft getrocknet und die DNA in einem geeigneten Volumen H2O wieder aufgenommen.
2.2.1.11 Aufreinigung von DNA-Fragmenten
Die Aufreinigung von DNA erfolgte mit dem QIAquick PCR Purification Kit der Firma Qiagen, das Herstellerprotokoll wurde ohne Abweichungen befolgt. Diese Methode wurde eingesetzt, um einzel- oder doppelsträngige DNA zwischen 100 bp und 10 kb Größe von Verunreinigungen zu befreien (Salze, Primer, Nukleotide, Polymerasen).
Nachdem zu der DNA-Lösung eine 3-faches Volumen an PB Puffer gegeben wurde, konnte der Ansatz auf ein QIAquick-Säulen pipettiert werden. Durch Zentrifugieren (10000 x g/30-60 sec) in einer Tischzentrifuge konnte die DNA an die Membran gebunden werden. Der Durchlauf wurde verworfen und die Membran durch Zugabe von 750 μl PE Puffer mit nachfolgender Zentrifugation (wie oben beschrieben) gewaschen. Die DNA wurde anschließend mit 30 μl EB Puffer eluiert.
Im Rahmen des Bisulfite genomic Sequencing wurde die DNA mit dem QIAEX II Kit der Firma Qiagen aufgereinigt (siehe 2.2.3.3).
2.2.1.12 Klonierung von PCR-Produkten (TOPO®-TA-Cloning-Kit, Invitrogen) Mit Hilfe des TOPO®-TA-Cloning-Kits (Fa. Invitrogen) wurden Taq-amplifizierte PCR Produkte effektiv in den pCR®2.1-TOPO® Vector kloniert. Dieser liegt linearisiert mit Thymidin-Überhängen am 3’-Ende vor. Taq-Polymerase bildet PCR-Produkte mit 5’
überhängenden Adenosin-Resten. Mit Hilfe der kovalent an den Vektor gebundenen Topoisomerase I, wird in einem einfachen Inkubationsschritt das PCR-Fragment in den PCR 2.1 Vektor ligiert.
Nachdem die Größe des amplifizierten PCR-Fragments auf einem Agarosegel kontrolliert worden war, wurde der Reaktionsansatz nach Angaben des Herstellers pipettiert. Die Menge des eingesetzten PCR-Produkts variierte ja nach Intensität der Bande im Agarosegel.
Reaktionsansatz Volumen
Frisches PCR-Produkt 0,5- 4μl
Salt Solution 1μl
TOPO® Vector 1μl
Steriles H2O add 6μl
Gesamtvolumen 6μl
Der Ansatz wurde vorsichtig gemischt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend wurden für die Transformation in kompetente One Shot ® TOP10 F’ E.coli Bakterien 2 μl Reaktionsansatz eingesetzt oder der Ansatz bei –20°C gelagert.
2.2.1.13 Ligation von DNA-Fragmenten
Zur Herstellung neuer rekombinanter Plasmide wurden geeignete Vektoren und DNA-Fragmente zunächst mit kompatiblen Restriktionsenzymen linearisiert. Anschließend erfolgte eine Ligation des Fragments in den Vektor durch T4-Ligase. T4-Ligase sowie der T4-DNA-Ligase Puffer wurden von der Firma NEB bezogen. Es wurden äquimolare Mengen an Vektor- und DNA-Fragment-Enden eingesetzt, das Liagtionsvolumen betrug 10-20 μl.
Der Ligationsansatz wurde über Nacht bei 16°C im Wasserbad inkubiert. Im Anschluß wurde der Ligationsansatz in kompetente One Shot ® TOP10 F’ E.coli Bakterien transformiert oder –20°C gelagert.
2.2.1.14 Isolation genomischer DNA aus Mauslebern
Um genomische DNA aus Mauslebern zu isolieren, wurde ein Stück Lebergewebe mit 750 μl Lysis-Puffer und 50 μl Proteinase K versetzt. Der Ansatz wurde über Nacht bei 55°C unter leichtem Schütteln inkubiert. Anschließend wurde 5 min (14000 rpm) zentrifugiert und der Überstand in ein neues Eppendorfgefäß überführt. Hierzu wurden 750 μl (entspricht 1 Volumen) Isopropanol gegeben und gevortext, um eine Phasenbildung zu verhindern. Nach erneuter Zentrifugation (14000 rpm/5 min) wurde der Überstand verworfen und das Pellet zweifach mit 70%-igem Ethanol gewaschen. Nachdem das Pellet an der Luft getrocknet wurde, konnte die DNA in 100 μl dest. H2O aufgenommen werden.
Lyse-Puffer: (add 0,5 Liter) Endkonzentration
25 ml 1 M Tris-HCl, pH 8,0 50 mM Tris
50 ml 1M NaCl 100 mM NaCl
100 ml 0,5M EDTA, pH 8,0 100 mM EDTA
25 ml 20%SDS 1% SDS
TE-Lösung: (add 0,5 Liter) Endkonzentration
5 ml 1M Tris-HCl, pH 8,0 10mM Tris, pH 8,0
1 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0 1mM EDTA, pH 8,0
2.2.2 Methoden zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen