Expression, Regulation und subzelluäre Lokalisation von Tight Junction-Komponenten in Metastasierungsmodellen humaner duktaler Pankreaskarzinomzellen

des Fachbereichs Medizin der Philipps-Universität Marburg in Zusammenarbeit mit dem

Universitätsklinikum Gießen und Marburg GmbH,Standort Marburg

Expression, Regulation und subzelluläre

Lokalisation von

Tight Junction -Komponenten

in Metastasierungsmodellen

humaner duktaler Pankreaskarzinomzellen

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der Humanmedizin (Dr. med.)

dem Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg

vorgelegt von

Nadine Aurbek

aus Nastätten

Angenommen vom Fachbereich Medizin

der Philipps-Universität Marburg am 08.Mai 2008

Dekan: Prof. Dr. med. Rothmund

Referentin: Prof. Dr. med. B. Simon

Korreferent: PD Dr. P. Langer

INHALTSVERZEICHNIS

1.

E

... 1

1.1.

D

A

P

 ... 1

1.1.1.   Epidemiologie ... 1 

1.1.2.   Klinik und Diagnose ... 1 

1.1.3.   Pathogenese ... 2 

1.1.4.   Therapie und Prognose ... 4 

1.2.

M

P

M

 ... 4

1.3.

S

F

Z

 ... 6

1.3.1.   Der E‐Cadherin‐Catenin‐Komplex ... 6  1.3.2.   Aufbau und Funktion von Tight Junctions ... 8  1.3.2.1.  Das integrale Membranprotein Occludin ... 9  1.3.2.2.  Die Multigenfamilie der Claudine ... 11  1.3.2.3.  Das integrale Membranprotein JAM ... 14  1.3.2.4.  Tight Junction‐assoziierte Proteine ... 14 

1.4.

D

R

MAPK‐S

P

M

 ... 16

1.5.

F

 ... 18

2.

M

M

... 19

2.1.

G

 ... 19

2.1.2.   Elektrophorese‐Geräte und Zubehör ... 20 

2.1.3.    Zellkultur ... 21 

2.1.4.   Analytische Geräte ... 21 

2.1.5.   Kühlgeräte ... 21 

2.2.

C

,

E

V

 ... 22

2.2.1.   Enzyme ... 22  2.2.2.   Sequenzierung und Polymerase‐Kettenreaktion ... 22  2.2.3.   Elektrophorese ... 22  2.2.4.   Chemikalien und Puffer ... 23  2.2.5.   Radioaktive Substanzen ... 24  2.2.6.   Antikörper ... 24  2.2.7.   Bakterienkultur ... 26  2.2.8.   Zellkultur ... 26  2.2.8.1.  Pankreastumorzelllinien ... 26  2.2.9.   Verbrauchsmaterialien ... 27  2.2.10.  Plasmide und kompetente Zellen ... 27  2.2.11.  Oligonukleotide ... 28 

2.3.

S

A

 ... 30

2.4.

M

M

 ... 30

2.4.5.   Multiple Tissue Expression Array ... 36  2.4.6.   Polymerase‐Kettenreaktion (PCR) ... 37  2.4.7.    Synthese von cDNA ... 38  2.4.8.   PCR mit Reverser Transkriptase (RT‐PCR) ... 38  2.4.9.   DNA‐Sequenzanalyse ... 39  2.4.10.   Elektrophoretische Trennung von DNA ... 40  2.4.11.  Elution von DNA‐Fragmenten aus Agarosegelen ... 41  2.4.12.  Klonierung von cDNA‐Fragmenten ... 41  2.4.12.1. Vektoren und Konstrukte ... 41  2.4.12.2.  Ligation und Transformation ... 42  2.4.12.3. Restriktion mit HindIII, Eco RI und BamH I ... 43  2.4.12.4. Restriktion PcDNA 3.1/V5 TOPO mit HindIII und Eco RI ... 43  2.4.12.5. Restriktion PcDNA/TO/myc‐His mit HindIII, Eco RI und BamH I ... 43  2.4.12.6. Ligation ... 44  2.4.12.7. Transformation ... 44  2.4.13.  Plasmidgewinnung ... 45  2.4.13.1. Analytische Plasmidgewinnung ... 45  2.4.13.2. Präparative Plasmidgewinnung ... 46 

2.5.

P

M

 ... 46

2.6.

Z

M

 ... 51

2.6.5.   Transiente Transfektion mit Lipofektamin ... 54 

2.6.6.   PD98059 Behandlung von Zellen ... 54 

2.6.7.    5‐Aza‐2´‐Deoxycytidin (5‐Aza‐CdR) Behandlung ... 55 

2.6.8.   Immunfluoreszenz und DAPI‐Färbung ... 55 

3.

E

... 57

3.1.

D

E

T

J

K

C

‐1,

‐2,

‐4,

‐7

‐12

M

P

T

8988S/T

P

‐

 ... 57

3.2.

E

T

J

K

C

‐4,

‐7

–12

M

SUIT‐2

P

S

 ... 62

3.3.

H

E

M

C

P

‐

 ... 67

3.4.

M

E

C

‐4,

C

‐5,

C

‐7

P

 ... 69

3.5.

C

C

‐7

E

G

Z

 ... 73

3.5.1.   Bestätigung der differentiellen Expression von Claudin‐7 im   PaTu8988S/T Metastasierungsmodell anhand der Northern Blot  Analyse ... 73  3.5.2.   Gewebe‐, tumor‐ und entwicklungsspezifische Expression von  ...   Claudin‐7 ... 75  3.5.3.  Subzelluläre Lokalisation von Claudin‐7 Fusionsprotein in       

3.6.

E

L

T

J

‐,

T

J

‐

A

J

P

 ... 

I

R

‐MEK‐ERK‐S

P

‐

 ... 82

4.

D

... 109

4.1.

H

E

C

P

‐

R

I

M

 ... 109

4.2.

G

‐

Z

E

T

J

K

C

‐7 ... 122

4.3.

M

R

C

4.4.

R

T

J

A

J

 ... 

K

‐

P

(MAPK)

K

P

 ... 127

5.

Z

... 137

6.

L

... 139

7.

A

... 155

7.1.

V

A

 ... 155

7.2.

P

 ... 158

7.3.

A

L

 ... 158

7.4.

D

 ... 159

1. Einleitung

1.1.

Das duktale Adenokarzinom des Pankreas

1.1.1. Epidemiologie

Das duktale Adenokarzinom des Pankreas ist die viert- bis fünfthäufigste krebsbedingte Todesursache in der westlichen Welt. Es handelt sich um eine Erkrankung des höheren Lebensalters mit einem Altersgipfel zwischen dem 50. und 70. Lebensjahr, die sich selten vor dem 40. Lebensjahr manifestiert. Ca. 90% der Fälle treten sporadisch auf, während bei 10% der Patienten eine familiäre Häufung beschrieben wird. Angehörige von betroffenen Patienten besitzen ein ca. 3-fach erhöhtes Erkrankungsrisiko (Bardeesy et al., 2002). Eine um das 53-fache erhöhte Erkrankungswahrscheinlichkeit besteht für Patienten mit der seltenen hereditären Pankreatitis.

1.1.2. Klinik und Diagnose

Bei Diagnosestellung eines duktalen Adenokarzinoms des Pankreas liegen in 80% der Fälle nicht mehr resektable Primärtumoren und/oder eine fortgeschrittene Metastasierung vor (Saif et al., 2007). Unspezifische Beschwerden wie Inappetenz, Gewichtsverlust, abdominelle, oft in den Rücken ausstrahlende Schmerzen sowie ein Ikterus sind die häufigsten Symptome, die den Patienten vor der Erstdiagnose zum Arzt führen. Ein Ikterus tritt in der Regel bei Pankreaskopfkarzinomen auf, wenn durch den Tumor im Pankreasgang der Galleabfluss behindert wird. Bei einer Tumorlokalisation im Korpus oder Schwanz des Organs kann ein Ikterus fehlen. Laborchemisch tritt das duktale Adenokarzinom des Pankreas durch unspezifische Veränderung wie einer Erhöhung der Cholestasemarker oder in 10-15% der Fälle durch eine Erhöhung der Pankreasenzyme in Erscheinung. Tumormarker wie CEA, CA 19-9, CA 50 und CA 72-4 sind bei größerer Tumormasse erhöht, aber insgesamt nicht spezifisch und daher keine geeigneten Screening-Parameter. Zur bildgebenden Diagnostik eignen sich die Sonografie und die Computertomografie sowie die Magnetresonanztomografie, eine invasive diagnostische Methode stellt die ERCP dar (Zeitz, 1999).

1.1.3. Pathogenese

Das duktale Adenokarzinom des Pankreas entwickelt sich aus Pankreasgangzellen. Läsionen in Form von Dysplasien im Gangepithel werden als Karzinomvorstufen betrachtet und nach einem auf histologischen Merkmalen basierenden Modell in PanIN 1-3 (pancreatic intraepithelial neoplasia; Abbildung 1) eingeteilt. Häufige, in duktalen Pankreaskarzinomzellen identifizierte molekulare Veränderungen sind Mutationen in den Gensequenzen für KRas, CDKN2A (cyclin dependent kinase 2A), P53, BRCA2 (breast cancer 2) und SMAD4/DPC4, deren Auftreten zeitlich in Zusammenhang mit den Stadien der Tumorentstehung gesetzt werden kann (Abbildung 1). Das Auftreten dieser genetischen Veränderungen kann nicht mit dem histologischer Veränderungen korreliert werden, da die durch die Mutationen hervorgerufenen biochemischen und zellulären Veränderungen nicht hinreichend bekannt sind. Mutationen im KRas-Gen werden bereits in histologisch unveränderten Pankreasgangzellen sowie in 30% der Karzinomvorstufen im Stadium PanIN-1 gefunden. Im manifesten Adenokarzinom treten Veränderungen im KRas-Gen in bis zu 100% der Fälle auf (Rozenblum et al., 1997; Wilentz et al., 1998). Die Mutation führt zu einer Aktivierung von KRas und damit auch zur Aktivierung verschiedener Effektor-Wege in der Zelle. Ein wichtiger Faktor in der Pathogenese der Tumorentstehung sind hier die durch den EGF (epidermal growth-factor) vermittelten Signalwege, die durch Mehrexpression der EGF-Rezeptoren EGFR und ERBB2 aktiviert werden. Eine Überexpression von EGFR wurde immunhistochemisch bei Patienten mit einem metastasierten duktalen Pankreaskarzinom in 21% der Fälle nachgewiesen (Safran et al, 2001). Weitere bedeutende Folge der KRas-Mutation ist die Aktivierung des MAPK (mitogen-activated protein kinase) -Signaltransduktionsweges mit Auswirkungen auf Zellfunktionen im Bereich von Zellwachstum, teilung und -differenzierung (Abbildung 1). Ein Verlust der CDNK2A-Funktion ist in 80-95% der sporadisch auftretenden duktalen Adenokarzinome des Pankreas vorhanden und tritt schon in frühen Stadien der Karzinomentstehung (PanIN-1) auf. Mit ihm entfällt die Transkription der Tumorsuppressoren INK4A und ARF, wobei INK4A eine größere Bedeutung für die Entstehung von

Pankreaskarzinomen zugeschrieben wird. Es blockiert den Eintritt der Zelle in die S-Phase der Mitose, durch Verlust dieses Faktors wird die Zellproliferation begünstigt. Mutationen im P53-Gen treten bei 50-60% (Ruggeri et al., 1997) der duktalen Pankreaskarzinome auf. Durch Ausfall der TP53-vermittelten DNA-Reparationsmechanismen werden chromosomale Veränderungen insbesondere der Telomeren begünstigt, die zur genetischen Instabilität der Tumorzellen führen. Da Mutationen im P53-Gen in niedrig- und hochmalignen Tumoren auftreten, wird der Zeitpunkt der Mutation in einem frühen Stadium der Karzinompathogenese vermutet.

Abbildung 1. Modell der genetischen Progression des duktalen Adenokarzinom des Pankreas.

Die PanIN (pancreatic intraepithelial neoplasia) repräsentiert Stadien neoplastischen Wachstums im Pankreasgang als Vorstufe zum manifesten duktalen Adenokarzinom des Pankreas, die sich mit dem Auftreten spezifischer Mutationen in Verbindung bringen lassen. Der dadurch verursachte Funktionsausfall der Proteine ERBB2/EGFR, KRas, INK4A, TP53, SMAD4/DPC4, BRCA2, und der Telomerase finden sich ab bestimmten Stadien der Tumorentstehung (nach

Bardeesy et al., 2002).

Auch BRCA2 spielt eine Rolle bei der Reparatur der DNA, sein Verlust verstärkt vermutlich die maligne Progression in bereits vorhandenen Läsionen. Eine Mutation dieses Gens ist in ca. 17% der duktalen Adenokarzinome des

Pankreas vorhanden, während ein Funktionsverlust des SMAD4/DPC4-Gens in bis zu 55% der Fälle zu finden ist (Wilentz et al., 2000). SMAD4/DPC4 vermittelt die TGF-α (tumor growth factor-α) -assoziierte Inhibition von Wachstumsvorgängen bzw. Apoptose. Sein Verlust tritt erst in späten Stadien der Karzinomentstehung auf (PanIN-3) und verschlechtert die Prognose der Erkrankung (Bardeesy et al., 2002).

1.1.4. Therapie und Prognose

Das duktale Adenokarzinoms des Pankreas besitzt mit einer 5 Jahres-Überlebensrate von 0,4 – 4% (Saif et al., 2007) und einer medialen Überlebenszeit von 6 Monaten die bei weitem schlechteste Prognose von allen Neubildungen des Gastrointestinaltraktes (Bardeesy et al., 2002). Zwischen 75 und 85 % der Patienten weisen bei Diagnosestellung bereits ein Tumorstadium jenseits der Resektabilität auf (Friess et al., 1999), welches aufgrund des geringen Ansprechens des Tumors auf Chemo- und/oder Radiotherapie (Bardeesy et al., 2002) lediglich einen palliativen Therapieansatz erlaubt. Bei früher Diagnose und damit kurativem Ansatz ist die Therapie der Wahl die partielle Duodenopankreatektomie nach Whipple (Erstbeschreibung 1935) bzw. eine totale Duodenopankreatektomie, wodurch für die betroffenen Patienten jedoch lediglich eine Steigerung der 5 Jahres-Überlebensrate auf 20% erreicht werden kann (Bardeesy et al., 2002). Experimentelle Therapieansätze wie eine antihormonale Therapie mit Tamoxifen oder Burserelin oder die systemische Applikation von monoklonalen anti-Tumorzell-Antikörpern haben bisher ebenfalls nicht zu einem Anstieg der Überlebensrate geführt (Friess et al., 1999; Saif et al., 2007).

1.2.

Mechanismen im Prozess der Metastasierung

Die Metastasierung des Primärtumors ist im Hinblick auf die Prognose einer Krebserkrankung ein entscheidender Faktor. Im Falle des duktalen Adenokarzinoms des Pankreas sind Metastasen für 90% der Letalität

entsteht durch einen komplexen, vielschrittigen Prozess, der bis heute nicht vollständig bekannt ist. Er beinhaltet die Loslösung einzelner Zellen bzw. kleinerer Zellverbände von der primären Tumormasse, deren Bewegung durch die extrazelluläre Matrix, ihre Intravasation, das Überleben von Tumorzellen in der Zirkulation des Körperkreislaufs, die Adhäsion und Proliferation in Endothelien des Zielgewebes, das Eindringen in dasselbe und letztendlich die Interaktion mit dem lokalen Gewebe einschließlich der Induktion der Angiogenese zur Eigenversorgung (Stamenkovic 2003).

Viele Theorien versuchen, Erklärungsansätze zur Pathogenese von Metastasierungsabläufen zu liefern. Ein Erklärungsansatz ist die „homing theory“, die eine Anziehung von malignen Zellen durch das Zielgewebe der Metastasierung mithilfe der Expression von Zelladhäsionsproteinen und/oder der Sekretion löslicher chemotaktischer Faktoren unterstellt. Die „fertil soil theory“ hingegen vermutet, dass unterschiedliche, bereits vorhandene Wachstumsbedingungen in Zielgeweben die Invasion bestimmter maligner Zellen begünstigen (Keleg et al., 2003). Beide Theorien berücksichtigen die Bedeutung von Zell-Zell- bzw. Zell-Matrix-Interaktionen in der Pathogenese der Metastasierung. Zelladhäsionsproteine an der Zelloberfäche (E-Cadherin, Integrine, Tight Junction-Proteine und andere) spielen bei der Tumorzellmigration eine Rolle und regulieren die Fähigkeit von epithelialen Tumoren zur Metastasierung, da nur durch Lockerung von Zellkontakten die hierfür notwendige Zellmobilität erreicht werden kann. Von Tumorzellen oder Zellen der extrazellulären Matrix exprimierte und sezernierte Proteasen (Matrix-Metalloproteinasen, Plasminogen-Aktivator/Plasmin-System, Urokinase und andere) haben wegen ihrer Fähigkeit zur Matrixdegeneration eine Bedeutung für die Invasivität des Tumors bzw. die Überlebensfähigkeit von Metastasen in entfernten Geweben. Sie sind auch in andere Signaltransduktionsprozesse involviert, die sich auf die Expression von Wachstumsfaktoren, Cytokinen, Chemokinen bzw. deren Rezeptoren auf der Zelloberfäche in Tumor- und Stromazellen auswirken. Diese Proteine spielen wiederum bei der Induktion von Stromazellen durch Tumorzellen, der Tumorzellproliferation sowie in der Angiogenese eine Rolle. Tumorzellen schaffen so ein Netzwerk der

Kommunikation, das ihr Überleben im Primärgewebe und insbesondere im Rahmen der Metastasierung in Fremdgewebe sichern soll (Keleg et al., 2003). Die Überexpression oder Herunterregulation von Adhaerens Junction, Tight Junction und Tight Junction-assoziierten Proteinen könnte hierbei eine entscheidende Rolle spielen. Die vorliegende Arbeit untersucht daher die Metastasierungsabhängigkeit der Expression von Zelladäsionsproteinen in Pankreaskarzinomzelllinien.

1.3.

Struktur und Funktion von Zelladhäsionsproteinen

1.3.1. Der E-Cadherin-Catenin-Komplex

E-Cadherin ist ein Transmembranprotein mit einer Transmembrandomäne und bindet mit seinem extrazellulär gelegenen N-terminalen Ende, welches aus 5 identischen, aneinandergereihten Einheiten besteht, ein Kalziumion. Das Protein ist ein Mitglied der Cadherinfamilie, die mehr als 16 Mitglieder umfasst, und ist epithelial lokalisiert. Interzellulär bildet E-Cadherin Homodimere mit gleichartigen Proteinen der Nachbarzellen, interagiert aber auch heterophil mit auf Lymphozyten lokalisierten Integrinen, was zu einer Retention von Lymphozyten im Epithel führt. E-Cadherin ist in der Zellmembran in Adherens Junctions lokalisiert und spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung multimolekularer Adhäsionsvorgänge in der Zelle. Seine Funktion ist kalziumabhängig, da dieses Ion als Schutz vor proteolytischer Spaltung durch Proteasen dient (Harrington et al., 2000).

Die Verankerung der Adherens Junctions durch E-Cadherin am Zytoskelett wird über eine Interaktion zwischen dem intrazellulär gelegenen C-terminalen Ende von E-Cadherin mit Cateninen hergestellt, interzellulär bildet E-Cadherin Homodimere mit gleichartigen Proteinen der Nachbarzellen (Abbildung 2) (Harrington et al., 2000).

Abbildung 2. Der E-Cadherin-Catenin-Komplex.

E-Cadherin vermittelt über eine Interaktion mit α-, β- und γ-Catenin die Verankerung der Adherens Junction am Zytoskelett (α-cat, α-Catenin; β-cat, β-Catenin; γ-cat, γ-Catenin) (nach

Harrington et al., 2000).

Der E-Cadherin-Catenin-Komplex übt durch Zell-Zell- bzw. Zell-Matrix-Interaktionen sowie durch Beteiligung an der intrazellulären Signaltransduktion Einfluss auf die Homöostase des Epithels aus. Er reguliert unter anderem die durch die Ausbildung von Tight Junctions hervorgerufene Zellpolarität der Epithelzellen. Weiterhin wurde auch ein Einfluss auf Zellmigration und -proliferation beschrieben. Unregelmäßigkeiten im E-Cadherin-Catenin-Komplex führen zu einer gestörten Permeabilität des betroffenen Epithels. Eine reduzierte oder abnormale Expression von E-Cadherin ist mit unterschiedlichen humanen Karzinomen assoziiert und tritt insbesondere bei höhermalignen Prozessen mit schlechter Überlebensrate auf. In der Pathogenese der Metastasierung wird die E-Cadherin-Expression während der Intravasation hochreguliert, während bei Extravasation und Etablierung von Tumorzellen in

entferntem Gewebe wiederum niedrige E-Cadherin-Level vorliegen (Harrington et al., 2000).

1.3.2. Aufbau und Funktion von Tight Junctions

Tight Junctions werden im oberen Bereich der lateralen Membran von Endothel-, Mesothel- oder Epithelzellen als eine die Zelle in ihrer Gesamtheit umrundende, strang- bzw. netzartige Struktur ausgebildet. Durch Assoziation mit Tight Junction-Strängen von Nachbarzellen kommt es hier optisch zu einer Unterbrechung des Interzellularraums, die elektronenmikroskopisch als sogenannter „kissing point“ in Erscheinung tritt (Tsukita et al., 2001). Es findet sich bei der Ausbildung von Zell-Zell-Kontakten durch Tight Junctions auch tatsächlich eine Unterbrechung des parazellulären Flusses, das heißt eine Obliteration des Interzellularraums, die eine Abgrenzung und Abdichtung flüssigkeitsgefüllter Kompartimente gegeneinander bewirkt („barrier-function“) (Tsukita et al., 2001).

Neben ihrer Wirkung auf den Interzellularraum haben Tight Junctions auch für die Zelle selbst eine entscheidende Bedeutung. Zellen, die als Grenzstruktur dienen, d.h. Endothel-, Mesothel und Epithelzellen, besitzen für die apikale und basolaterale Membran spezifische Membranproteine und -lipide, was der unterschiedlichen Funktion dieser Membranabschnitte als luminale oder serosale Begrenzung der Zelle Rechnung trägt. Nach dem Flüssig-Mosaik-Modell sind Membranproteine und -lipide jedoch in der Lage, sich innerhalb der Zellmembran frei zu bewegen. Tight Junctions dienen hier offensichtlich als Grenzstruktur, die von Membranproteinen bzw. -lipiden nicht überwunden werden kann und so die Ausbildung spezieller Funktionen von Membranabschnitten innerhalb einer Zelle ermöglicht („fence-function“) (Tsukita et al., 2001). Tight Junctions werden von 3 verschiedenen integralen Membranproteinen gebildet: Occludin, den Mitgliedern der Multigenfamilie der Claudine und JAM (Abbildung 3). Die Proteine polymerisieren zu Tight Junction-Strängen und interagieren mit gleichen Strukturen in Nachbarzellen. Über MAGUK´s (membranassoziierte Guanylatkinase-homologe Transmembran-proteine) stellen sie eine Verbindung zum Zytoskelett her und nehmen über

Interaktionen mit diesen und anderen Tight Junction-assoziierten Proteinen Einfluß auf unterschiedliche Zellfunktionen. Die vielfältigen Funktionen der Tight Junction-Proteine sind heute noch weitgehend unbekannt.

Abbildung 3. Verankerung von Tight Junctions am Zytoskelett.

Claudine und Occludin bilden das Gerüst der Tight Junctions. Beide Proteine interagieren mit der PDZ-Domäne der membranassoziierten Guanylatkinase -homologen Transmembranproteinen ZO (Zonula occludens) -1 und –2, die über α-Catenin eine Bindung zu den Aktifilamenten des Zytoskeletts herstellen. (ZO, Zonula occludens; α-Ct, α-Catenin) (nach Rajasekaran et al., 2003).

1.3.2.1. Das integrale Membranprotein Occludin

Occludin ist ein ca. 60 kD großes integrales Membranprotein mit 4 Transmembrandomänen und einem langen zytoplasmatisch gelegenen C-terminalen Ende (Abbildung 4). Dieses interagiert mit den PDZ-Domänen Tight Junction- assoziierter zytoplasmatischer Proteine (s. u.). Occludin war das erste Protein, für das eine Beteiligung an der Ausbildung von Tight Junctions beschrieben wurde (Furuse et al., 1993). Die Expression von Occludin korreliert

mit der Anzahl der vorhandenen Tight Junction -Stränge in verschiedenen Geweben, sodass davon ausgegangen werden kann, dass Occludin in Tight Junctions mit relativ konstanter Dichte rekrutiert wird (Saitou et al., 1997).

Abbildung 4. Die Struktur von Occludin.

Das Tight Junction-Protein besitzt 4 Transmembrandomänen und 2 extrazelluläre Loops. Der erste extrazelluläre Loop ist reich an Glycin und Tyrosin (60%). Mit seinem langen C-terminalen Ende (C) geht Occludin Bindungen mit den PDZ-Domänen Tight Junction-assoziierter Proteine ein (nach Tsukita et al., 2001).

Es werden auch in Occludin-defizienten Zellen Tight Junctions ausgebildet, bei einigen Spezies konnten Occludin-defiziente Zellen in verschiedenen Geweben nachgewiesen werden. Eine Interaktion von in Tight Junctions lokalisiertem Occludin mit der entsprechenden Struktur in Nachbarzellen wurde bisher nicht beschrieben. Tatsächlich scheint Occludin auf die „barrier function“ wenig Einfluß zu haben. Vielmehr spielt es eine Rolle bei der Verankerung von Tight Junctions an den Aktinfilamenten des Zytoskeletts (Kuwabara et al., 2001). Die

vollständige Funktion von Occludin in der Zelle ist jedoch noch weitgehend unbekannt.

1.3.2.2. Die Multigenfamilie der Claudine

Claudine sind zwischen 22 und 24 kD große Transmembranproteine, die als Komponenten von Tight Junctions identifiziert wurden (Furuse et al., 1998). Ihr Name leitet sich von dem lateinischen Verb „claudere“ (= schließen) ab. Nachdem zunächst die Proteine Claudin-1 (Abbildung 5) und Claudin-2 beschrieben wurden (Furuse et al., 1998), erfolgte bis heute die Identifikation von 22 weiteren Mitgliedern dieser Proteinfamilie (Tsukita et al., 2001).

Alle Claudine besitzen 4 Transmembrandomänen mit Seqenzhomologien in der ersten und vierten Transmembrandomäne sowie im ersten und zweiten extrazellulären Loop. Bei allen Mitgliedern der Proteinfamilie wird der erste extrazelluläre Loop im Vergleich zum zweiten als länger und hydrophober beschrieben. Das intrazellulär gelegene C-terminale Ende der Claudine ist mit der Aminosäuresequenz Tyrosin-Valin ausgestattet (Morita et al., 1998). Dies macht eine Bindung an Tight Junction-assoziierte Proteine mit PDZ-Domäne möglich (Itoh et al., 1999).

Abbildung 5. Die Struktur von Claudin-1.

Das Protein ist ein Vertreter der Proteinfamilie der Claudine. Die 24 Mitglieder weisen alle 4 Transmembrandomänen und 2 extrazelluläre Loops auf. Der erste extra-zelluläre Loop ist länger und hydrophober als der zweite und dient wahrscheinlich der Assoziation der Claudine untereinander. Mit ihrem C-terminalen Ende interagieren die Claudine mit der PDZ -Domäne Tight Junction -assoziierter Proteine (nach Tsukita et al., 2001).

Neben Interaktionen mit zytoplasmatischen Proteinen ist auch die Ausbildung der Zell-Zell-Kontakte im Bereich der Tight Junctions mit den Claudinen assoziiert. Über den bereits erwähnten ersten extrazellulären Loop kommen Interaktionen zwischen den in Tight Junctions lokalisierten Claudinen zustande, wobei nicht nur homophile Bindungen zwischen derselben, sondern auch heterophile Bindungen zwischen unterschiedlichen Claudinspezies auftreten können. Nicht alle Claudine sind jedoch untereinander zu dieser Art der Interaktion befähigt (Furuse et al., 1999). Ein weiterer Einflussbereich der Claudine ist die Regulation des parazellulären Flusses, der durch Tight Junctions zunächst blockiert wird („barrier function“). Claudine sind an der

selektiven Fluss bestimmter Ionen ermöglichen. Für Claudin-2 (Amasheh et al., 2002), Claudin-4 (Van Itallie et al., 2001) und Claudin-16/Paracellin-1 (Simon et al., 1999) wurde eine Beteiligung an kationenselektiven Kanälen beschrieben (Abbildung 6). Die Zahl und Dichtigkeit von Tight Junctions variiert in unterschiedlichen Geweben entsprechend ihrer Lokalisation bzw. physiologischen Funktion erheblich.

Abbildung 6. Poren innerhalb von Tight Junctions beeinflussen den parazellulären Fluß. Schematische Darstellung der dreidimensionalen Tight Struktur: Jeder Tight Junction-Strang ist lateral an den „Kissing Points“ mit dem einer benachbarten Zelle assoziiert. An den „Kissing Points“ ist der Interzellularraum obliteriert. Spezifische Claudine sind an der Bildung von Poren in Tight Junction-Strängen beteiligt und nehmen damit Einfluss auf den parazellulären Fluß und die Spezifität von Tight Junctions in bestimmten Geweben (nach Tsukita et al., 2001).

1.3.2.3. Das integrale Membranprotein JAM

JAM (Junctional adhesion molecule) ist ein ca. 40 kD großes Transmembranprotein mit einer Transmembrandomäne. Sein langes extrazellulär gelegenes N-terminales Ende besitzt zwei immunglobulinähnlich gefaltete Schleifen, die durch Disulfidbrücken aufrechterhalten werden. JAM ist in epithelialen Zellen lateral mit den das Tight Junction-Gerüst bildenden Claudinen assoziiert und am Adhäsionsprozess beteiligt. Diesem Protein wird auch eine Rolle bei der Extravasation von Monozyten zugeschrieben. Das Wissen über die vollständige Funktion von JAM ist jedoch begrenzt.

1.3.2.4. Tight Junction-assoziierte Proteine

Tight Junctions sind zytoplasmatisch mit einem dichten Proteinnetzwerk assoziiert (Abbildung 7). Dieses vermittelt die Verankerung von Tight Junction-Strängen am Zytoskelett, stellt eine Verbindung zu zytoplasmatischen Regulationsprozessen her und vermittelt erfolgreichen Vesikeltransport und Zellpolarität. Sowohl Occludin als auch die Mitglieder der Multigenfamilie der Claudine binden mit ihrem intrazellulären C-terminalen Ende an ZO-1 (220 kD), ZO-2 (160 kD) und ZO-3 (130 kD) (Tsukita et al., 2001). Diese Proteine sind Mitglieder der Superfamilie der MAGUK´s (membrane-assoziated guanylate kinases) und besitzen jeweils 3 PDZ-Domänen, eine SH3 (sre homology)-Domäne und eine GUK (guanylat kinase-like)-homology)-Domäne. Claudine binden an die erste PDZ-Domäne der MAGUK´s, während Occludin mit deren GUK-Domäne interagiert. ZO-1, -2, und -3 stellen eine Verbindung zu den Aktinfilamenten des Zytoskeletts her, die unterhalb des junktionalen Komplexes lokalisiert gemeinsam mit Myosin II eine ringförmige Struktur bilden, und rekrutieren über ihre freien Domänen weitere Proteine an die Plasmamembran (Mitic et al., 2000).

Zu diesen gehört Cingulin (140-160 kD), ein Phosphoprotein, das direkt mit ZO-1 interagiert und strukturelle Ähnlichkeit zu Myosin besitzt. Auch Symplectin (150 kD) und 7H6 (155 kD) sind Tight Junction -assoziiert, ebenso rab 3B, rab 13, Sec 6/8 und VAP (VAMP [vesicle-associated membrane protein]

Proteine besitzen PDZ-Domänen und können an die Plasmamembran rekrutiert werden (Mitic et al., 2000). Über diesen makromolekularen Komplex sind Tight Junctions in viele funktionelle Prozesse der Zelle und der extrazellulären Matrix eingebunden.

Abbildung 7. Schematisches Modell der Proteininteraktionen an Tight Junctions. ZO (Zonula occludens) -1 interagiert mit Mitgliedern der Multigenfamilie der Claudine und Occudin. ZO-1 rekrutieret weitere Proteine zu einem makromolekularen, Tight Junction-assoziierten Komplex: ZO-2 und –3, Aktin, AF-6, ZAK und ZONAB (ZO-1-associated nucleic acid-binding protein) sowie BAP-1 (BAI-associated protein), ASIP (atypical PKC [protein kinase C] isotype-specific interacting protein) VAP (VAMP [vesicle-associated membrane protein] associated protein) und JAM (junction adhesion molecule) (nach Mitic et al., 2000).

1.4.

Die Rolle des MAPK-Signaltransduktionsweges im

Prozess der Metastasierung

Der MAPK (Mitogen-activated protein kinase) -Signaltransduktionsweg (Abbildung 8) ist ein bedeutender Faktor bei eukaryontischen Zellregulation. Er wird durch viele sehr verschiedene Stimuli aktiviert und nimmt Einfluss auf Zellproliferation, -wachstum, -differenzierung, -migration, -alterung und -tod. Die Aktivierung von MAPK erfolgt durch die MAPK-Kinasen oder MEKs (MAPK/ ERK [extracellular signal regulated kinase] kinases) die wiederum von MEK-Kinasen aktiviert werden. Der dreistufige Signaltransduktionsweg führt letztendlich zur Phosphorylierung definierter Substrate wie Transkriptionsfaktoren, Proteinkinasen, Phospholipasen und Zytoskelett-assoziierte Proteine an Serin/Thyronin-Endsequenzen durch MAPK. Die gesteigerte Expression von Aktivatoren bzw. die dauerhafte Aktivierung des MEK-ERK-Signaltransduktionsweges wurde in humanen Karzinomen einschließlich Mamma-, Lungen-, Kolon-, Pankreas-, Prostata- und Nierenkarzinom sowie bei akuten Leukämien und malignen Gliomen gefunden und steht im Zusammenhang mit Tumorprogression und Metastasierung (Schramek et al., 2002). Während Experimente mit einem oralen MEK-Inhibitor bei Mäusen zur Suppression von Tumorwachstum führte (Schramek et al., 2002), konnte in ersten klinischen Studien mit einem oralen MEK-Inhibitor zur Behandlung des Mamma-, Kolon- und Pankreaskarzinom beim Menschen lediglich eine Tumorprogression verhindert werden, eine Remission wurde nicht erreicht (Rinehart et al., 2004).

Abbildung 8. Der MAPK (Mitogen-activated protein kinase)-Signaltransduktionsweg Der dreistufige Signaltransduktionsweg beeinflusst über eine Phosphorylierung definierter Substrate wie Transkriptionsfaktoren, Proteinkinasen, Phospholipasen und Zytoskelett-assoziierte Proteine an Serin/Thyronin-Endsequenzen Zellfunktionen wie Zellproliferation, -wachstum, -differenzierung, -migration, -alterung oder –tod. ERK, extracellular signal regulated kinase; MEK, MAPK/ ERK kinase; MP1, MEK partner 1; ksr, Kinase suppressor of Ras (nach

1.5. Fragestellung

Die infauste Prognose des duktalen Adenokarzinoms des Pankreas wird durch die relative Symptomfreiheit des Primärtumors sowie eine frühe Metastasierung verursacht. Verschiedene Theorien zum Prozess der Metastasierung („homing theory“ und „fertil soil theory“, Keleg et al., 2003) unterstellen eine Interaktion von Tumorzellen und Zielgewebe über Oberflächenproteine wie Zelladhäsionsproteine oder chemotaktische Substanzen, die Migration und Überleben der Tumorzellen ermöglichen. Die Expression von Zelladhäsionsproteinen kann unter anderem durch den MAPK-Signaltransduktionsweg reguliert werden. Die vorliegende Arbeit hatte daher zum Ziel,

1. die Transkription ausgewählter Tight und Adherens Junction-Proteine in duktalen und neuroendokrinen Pankreaskarzinomzelllinien zu charakterisieren sowie deren möglicherweise metastasierungs-abhänge Expression nachzuweisen.

2. ein gewebe- und zellspezifisches Expressionsprofil des Tight Junction-Proteins Claudin-7 zu erstellen

3. die subzelluläre Lokalisation von Claudin-7 in Pankreaskazinom-zelllinien zu untersuchen.

4. zu untersuchen, welche Rolle der MAPK-Signaltransduktionsweg bei der Translation und Lokalisation von Tight Junction- und Adherens Junction -Proteinen im Metastasierungsmodell der SUIT 2 Subzelllinien spielt.

2.

Material und Methoden

2.1. Geräte

Laborautoklav Typ GLA 40 Fritz Gössner, Hamburg

Brutschrank:

BK 5060 E Heraeus, Hanau

Bunsenbrenner Roth, Karlsruhe

Filmentwickler:

Curix 60 AGFA, Leverkusen

Fluoreszenzmikroskop:

Axioplan 2 Zeiss, Jena

Fotokamera:

MC80 DX Zeiss, Jena

Heizblock:

DRI-Block DB1 und DB2A Techne, Princeton, USA

Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg

Hybridisierungsofen Bachhofer, Reutlingen Inkubationshaube Certomat HK Braun, Melsungen

Magnetrührer:

MR3001 Heidolph, Gießen

Mikrowelle AVM 434 Whirlpool

PCR-Cycler:

Thermo-Dux PHC-3 Techne, Princeton, USA

Pipetten: 10, 20, 100, 200, 1.000 Eppendorf, Hamburg Pipettierhilfe: Pipetus-Akku Hirschmann Laborgeräte,

Eberstadt

Radioaktiv-Abfallcontainer Roth, Karlsruhe

UV Crosslinker 2400 Stratalinker, Kalifornien, USA Tisch-Rundschüttler Certomat R Braun, Melsungen

Tischzentrifugen:

Biofuge 13, Sepatech Heraeus, Hanau Biofuge 15R, Sepatech Heraeus, Hanau

MicroCen 13 Herolab, Wiesloch

Labsonic U Braun, Melsungen

Vortex: REAX 2000 Heidolph, Kelheim

Waage: 572-33 Kern, Albstadt

Wasserbad Köttermann, Hänigsen

Zentrifugen:

Cryofuge 800 Heraeus, Hanau

Rotixa ROR Hettich, Tuttlingen

2.1.2. Elektrophorese-Geräte und Zubehör

Agarose-Gelelektrophorese:

HE 99, HE 33 Minigel Hoefer, Heidelberg

Blotting-Apparatur:

Mini-Trans-Blot BioRad, München

Netzgeräte:

PS 500 XT Hoefer, Heidelberg

3000 Xi BioRad, München

SDS-Gelelektrophorese:

EC120 Mini-Vertikal Gel System EC, New York, USA

2.1.3. Zellkultur

Inkubator:

Cytoperm 8080 Heraeus, Hanau

Series 6000 Heraeus, Hanau

Mikroskop:

Olympus IX 50 Olympus, Hamburg

Olympus IMT-2 Olympus, Hamburg

Neubauer-Kammer Schreck, Hofheim

Sterile Werkbank: Lamin Air HLB 2448 Heraeus, Hanau

Stickstoff-Tank: 35 VHC tec-Lab, Königstein Zentrifuge: Labofuge GL Heraeus, Hanau

2.1.4. Analytische Geräte

Sequenziergerät:

Abi-Prism 310 Genetic Analyzer Perkin-Elmer, Langen

Sequenzierungsauswertung: Hard/Software

Power macintosh G3 Apple, Kalifornien, USA Spektralphotometer: Uvikon 860 Kontron, Eching

2.1.5. Kühlgeräte

-80°C: UF 75-45 DS, E80 Colora Messtechnik GmbH, Lorch

-20°C Liebherr, Ochsenhausen

+4°C Liebherr, Ochsenhausen

2.2.

Chemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterialien

2.2.1. Enzyme

BamH I Restriktionsendonuclease New England Biolabs, MA, USA

Benzonase Nuklease Novagen

Eco RI Restriktionsendonuclease New England Biolabs, MA, USA HindIII Restriktionsendonuclease MBI, Litauen

Klenow Boehringer, Mannheim

RNAse A Boehringer, Mannheim

Proteas Arrest Genotec, Montana, USA

Proteinase K Qiagen, Hilden

DNAse I Pharmacia, Freiburg

DNA-Ligase Gibco, Eggenstein

Superscript II Gibco, Eggenfelden

Taq-Polymerase Qiagen, Hilden

2.2.2. Sequenzierung und Polymerase-Kettenreaktion

DNA-Sequencing Kit ABI PRISM, Warrington, UK

dNTP Mix MBI, Litauen

MgCl-Puffer 10fach Qiagen, Hilden

Oligonukleotide MWG-Biotech, München

Oligonukleotide Metabion, Martinsried

Q-Puffer Qiagen, Hilden

5fach First Strand Puffer Gibco, Eggenstein

DTT Gibco, Eggenstein

Oligo(dT)12-18 Primer Gibco, Eggenstein 2.2.3. Elektrophorese

Acrylamidlösung Roth, Karlsruhe

Agarose Sigma, München

Agarose Promega WI, USA

Ethidiumbromid Sigma, München

Nitrozellulose-Membran Schleicher & Schüll, Dassel

Harnstoff Merck, Darmstadt

Marker III MBI, Litauen

Marker VIII MBI, Litauen

MOPS Sigma, München

Loading Dye MBI, Litauen

Protein Marker, Broad Range NEB, New England, USA

TEMED Sigma, München

2.2.4. Chemikalien und Puffer

BIO RAD-Reagenz BIO RAD Laboratories

Kalifornien, USA

Borsäure Merck, Darmstadt

Bromphenolblau Sigma, München

BSA Sigma, München

DAPI Sigma, München

DEPC Sigma, München

Digitonin Merck, Darmstadt

DTT Sigma, München

ECL Ammersham, Freiburg

EDTA Roth, Karlsruhe

EGTA Serva, Heidelberg

Eisessig Sigma, München

Essigsäure Sigma, München

Ethanol Riedel de Haehn AG, Seelze

Formaldehyd Sigma, München

Formamid Sigma, München

Glycerin Sigma, München

HCl Merck, Darmstadt

Isopropanol Sigma, München

Methylenblau Sigma, München

Milchpulver Difco, Detroit, USA

MOPS Sigma, München

Natrium-Acetat Merck, Darmstadt

Natrium-Chlorid Merck, Darmstadt

Natrium-Citrat Merck, Darmstadt

Natrium-Bisulfat Sigma, München

NEB 2-Puffer New England Biolabs, MA, USA

NP-40 Calbiochem, Kalifornien, USA

PCI Biomol, Hamburg

PMSF Sigma, München

Protein Assey Bio-Rad, München

RNA Clean AGS, Heidelberg

SDS Serva, Heidelberg

SlimFast Schokolade Slim-Fast Food Company, Florida, USA

Tris-Base USB, Cleveland, USA

Tris/HCl Sigma, München

Tween 20 Fluka, Neu-Ulm

2.2.5. Radioaktive Substanzen

α[32P]dCTP (5.000 Ci/mol, 10 mCi/ml) Amersham, Braunschweig

2.2.6. Antikörper

Primärantikörper

Anti-Claudin-1

polyklonal Kaninchen IgG Zymed, Kalofornien USA Anti-Claudin-2

polyklonal Kaninchen IgG Zymed, Kalifornien, USA Anti-Claudin-4

Anti-Claudin-5

polyklonal Kaninchen IgG Zymed, Kalifornien, USA Anti-Occludin

polyklonal Kaninchen IgG Santa Cruz, Kalifornien, USA Anti-ZO-1

polyklonal Kaninchen IgG, Santa Cruz, Kalifornien, USA Anti ZO-2

polyklonal Ziege IgG, Santa Cruz, Kalifornien, USA Anti E-Cadherin

polyklonal Ziege IgG, Santa Cruz, Kalifornien, USA Anti-actin HRP-konjugiert

polyklonal Ziege IgG Santa Cruz, Kalifornien, USA Anti-His(C-term)-FITC-konjugiert

monoklonal Maus IgG Invitrogen, Karlsruhe Anti-myc-FITC-konjugiert

monoklonal Maus IgG Invitrogen, Karlsruhe

Sekundärantikörper:

Esel anti Kaninchen, FITC-konjugiert Santa Cruz, Kalifornien, USA Esel anti Maus, FITC-konjugiert Santa Cruz, Kalifornien, USA Esel anti Ziege, FITC-konjugiert Santa Cruz, Kalifornien, USA Ziege anti Kaninchen, HRP-konjugiert Cell Signaling, MA, USA Pferd anti Maus, HRP-konjugiert Cell Signaling, MA, USA Esel anti Ziege, HRP-konjugiert Santa Cruz, Kalifornien, USA

2.2.7. Bakterienkultur

Agar Gibco, Eggenstein

Ampicillin Sigma, München

Glycerol Sigma, München

Hefeextrakt Difco, Detroit, USA

Natriumchlorid Roth, Karlsruhe

Trypton Difco, Detroit, USA

2.2.8. Zellkultur

5-Aza-2´-Deoxycytidin Sigma, München

DMSO Sigma, München

Feuchte Kammer Eigenkonstruktion

Fötales Kälberserum PAA GmbH, Linz, Österreich Gewebekulturflaschen und -schalen Greiner, Frickenhausen

HEPES Puffer Gibco, Eggenstein

Lab-Tec Chamber-slides Nalge Nunc, Illinoi, USA

Lipofektamin Invitrogen, Karlsruhe

Medium (RPMI, DMEM) Gibco, Eggenstein PD98059 (MEK1 Inhibitor) Cell Signaling, MA, USA Penicillin-Streptomycin Gibco, Eggenstein

Pferdeserum PAA GmbH, Linz, Österreich

Plus Reagenz Invitrogen, Karlsruhe

Trypsin-EDTA Gibco, Eggenstein

2.2.8.1. Pankreastumorzelllinien

Die duktalen Pankreaskarzinomzelllinien AsPC-1, Capan-2, MIAPaCa-2 und Panc-1 wurden von der American Type Culture Collection (Rockville, MD) bezogen, die Zelllinien PC-2, PC-3 und PC-44 waren von M.Bülow, Mainz freundlicherweise zur Verfügung gestellt, während PaTu 8902, PaTu8988S, PaTu8988T, HPAF und PaTu-II von H. Kern, Marburg zur Verfügung standen (Metzgar et al, 1982; Kim et al, 1989; Elsässer et al, 1992). Die duktalen Pankreaskarzinom SUIT-2 Subklone (SUIT-2 S2-007, SUIT-2 S2-013, SUIT-2

S2-020 und SUIT-2 S2-028) wurden von Iwamura, Miyazaki, Japan (Iwamura et al.,1987) zur Verfügung gestellt. Die neuroendokrinen Pankreastumorzelllinien BON I und QGP-1 wurden über Stefan Rosevicz, Berlin bezogen (Evers et al, 1992).

2.2.9. Verbrauchsmaterialien

Ambion DECAprimeII-Kit Ambion, Texas, USA

Flouprep Bio Mérieux, Marcy l´Etoile,

Frankreich

Gel-Blotting-Papier Schleicher & Schüll Hybond-Nylon-Membran Amersham, Braunschweig Kodak Ektachrome 64T Filme Kodak, New York State, USA Liqud Blocker Super Pap Pen Daido Sangyo, Tokio, Japan Multiple Tissue Expression Array Clontech, Kalifornien, USA

Nitrocelulose-Membran Schleicher & Schuell, Dassel Nucleobond PC 500-Kit Marchery-Nagel, Düren

Nucleospin Plasmid-Kit Marchery-Nagel, Düren

Pipettenspitzen Eppendorf, Hamburg

Polypropylenröhrchen (15, 50 ml) Greiner, Frickenhausen QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen, Hilden

Quarzküvetten Hellma, MühlheimBaden

Reaktionsgefäße (0,5, 1,5, 2,0 ml) Eppendorf, Hamburg

Röntgenfilme Kodak, New York State, USA

Whatmanpapier Whatman, Maidstone,

Großbritannien

2.2.10. Plasmide und kompetente Zellen

ElektroMAX E.coli DH10 B Gibco, Eggenstein PcDNA 3.1/V5 TOPO TA Expression Kit Invitrogen, Karlsruhe PcDNA/TO/myc-His Typ A Invitrogen, Karlsruhe

2.2.11. Oligonukleotide

Tabelle 1: In der PCR und RT-PCR eingesetzte Primer

Name Primer Genbank accession

number

Exon Sequenz Fragment-größe

ß-Aktin f NM_001101 3 5`-ATC TGG CAC CAC ACC TTC TAC AAT GAG CTG CG-3`

838 bp

ß-Aktin r NM_001101 6 5`-CGT CAT ACT CCT GCT TGC TGA TCC ACA TCT GC-3`

Claudin1f XM_036434 1 5`-ATG GAT CGG CGC CAT CGT CAG-3´

265 bp

Claudin1r 3 5´-AGT GAA GAG AGC CTG

AC-3´ T47-5´-Oligo (Claudin-2) XM_010309 5´-ATG GCC TCT CTT GGC CTC CAA CTT-3` 693 bp T47genR (Claudin-2)

5´-AGT GGA GTC AGA GTC CGC TG-3´

Claudin3f NM_001306 1 5´-CAG CAA CAT CAT CAC GTC GCA G-3´

555 bp

Claudin3r 1 5´-TAG ACG TAG TCC TTG CGG TCG TAG-3´

Claudin4f NM_001305 1 5´-GAT GAA CTG CGT GGT GCA GAG CAC-3´

477 bp

Claudin4r 1 5´-TAC ACG TAG TTG CTG

GCA GC-3´

Claudin5f XM_009839 1 5´-TGC GCG TCT CGC CTC TAG CCA TG-3´

474 bp

Claudin5r 1 5´-TCA GAC GTA GTT CTT

Name Primer Genbank accession

number

Exon Sequenz Fragment-größe

Claudin7f XM_008338 1 5`-AGT GGC AGA TGA GCT CCT ATG CG-3`

357 bp

Claudin7r 3 5`-AGT CTG TGA CAA TCT

GAT G-3`

Claudin7f XM_008338 1 5`-AGT GGC AGA TGA GCT CCT ATG CG-3` 257 bp Claudin-7 r 769 2 5`-CTT CAC TTT GTC GTC TCC-3` Claudin- 7 Exon 2 f

XM_008338 2 5´-CAT GAA GTG CAC GCG CTG TG-3`

141 bp

Claudin7r 3 5`-AGT CTG TGA CAA TCT

GAT G-3` Claudin7

HindIII f

XM_008338 1 5´-GAT GCT TGA TAT GGC CAA TTC GGG CCT GCA G-3`

636bp

Claudin7 EcoRI r

4 5`- GAT CGA ATT CCA CAT ACT CCT TGG AAG AG-3´ Claudin7

EcoRI f

XM_008338 1 5´-GAT CGA ATT CGA TAT GGC CAA TTC GGG CCT GCA G-3`

636 bp

Claudin7 HindIII r

4 5´- GAT CAA GCT TCA CAT ACT CCT TGG AAG AG-3` Claudin12f XM_004591 1 5´-ATG TCC ACG CAG CCA

CAG TC-3´

522 bp

Claudin12r 1 5´-TAG TGA CAT ACA CTG

CAT AGT C- 3´

Claudin14f XM_009753 2 5´-GAG TGT GTG TGG CAC AGC AC- 3´

Name Primer Genbank accession

number

Exon Sequenz Fragment-größe

Claudin14r 2 5´-TCA CAC GTA GTC GTT

CAG CCT GTA C- 3´

Claudin17f XM_012979 1 5´-CTC AGT GGA GAG TAT CAG C- 3´

524 bp

Claudin17r 1 5´-GTA GCC AGG CAC TGG

ATA TCT GTA C- 3´

2.3. Sicherheitsvorkehrungen und Abfallbeseitigung

Gentechnische Arbeiten wurden gemäß den Richtlinien des Gentechnikgesetzes und der Gentechniksicherheitsverordnung nur in zugelassenen Räumen der Sicherheitsstufe S1 durchgeführt. Der Umgang mit radioaktiven Substanzen erfolgte entsprechend den gesetzlichen Bestimmungen. Zum Schutz gegen Kontamination von Haut und Kleidung wurden Einweghandschuhe und Laborkittel getragen. Die individuelle Strahlenbelastung wurde mit einer Dosimeterplakette gemessen. Radioaktiver Abfall sowie Lösungsmittelreste und giftige Feststoffe wurden getrennt in entsprechenden Behältern gesammelt und der vorgeschriebenen Beseitigung zugeführt.

2.4. Molekularbiologische

Methoden

2.4.1. Isolierung von Gesamt-RNA aus Zellen

Das Nährmedium wurde aus der Zellkulturflasche entfernt und die Zellen mit 1x PBS gewaschen. Nach Zugabe von 4 ml RNA Clean wurde die Flasche 5 min bei Raumtemperatur niedrigfrequent geschüttelt und der Inhalt anschließend in

ein Zentrifugenröhrchen überführt. Nach Zugabe von 1/10 Volumen Chloroform stand die Probe 15 min auf Eis, um anschließend bei 4°C mit 5.000 UpM für 20 min zentrifugiert zu werden. Die obere Phase wurde daraufhin mit einem gleichen Volumen Isopropanol versetzt und erneut 15 min auf Eis gestellt. Danach erfolgte eine weitere Zentrifugation bei 4°C mit 14.000 UpM für 15 min. Nach Abnahme der Flüssigkeit wurde das Pellet in 200 µl DNAse I Puffer aufgenommen und mit 20 U DNAse I für 30 min bei 37°C inkubiert. Die Entfernung der Proteine nach der enzymatischen Reaktion erfolgte durch Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (PCI) (25:24:1) -Extraktion. Die Probe wurde bei 4°C mit 14.000 UpM 10 min zenrifugiert und die obere Phase anschließend zur Präzipitation der RNA mit 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat und der 3-fachen Menge 100%igen Ethanols versetzt. Nach 2 h Kühlung bei -80°C und Zentrifugation bei 4°C mit 14.000 UpM für 15 min erfolgte die Abnahme des Überstandes und ein Waschvorgang mit 70% Ethanol. Nach kurzer Zentrifugation und Entfernen des Alkohols folgte die Trocknung des Pellets bei 37°C im Heizblock. Das Pellet wurde anschließend in 400 µl TE-Puffer aufgenommen. Die Isolation von RNA für die Experimente mit und ohne 5-Aza-CdR Behandlung erfolgte durch Verwendung des ”RNeasy Mini Kit” unter Beachtung des Herstellerprotokolls.

2.4.2. Isolierung von DNA aus Zellen

Nach Entfernung des Nährmediums aus der Zellkulturflasche wurden die Zellen mit 1x PBS gewaschen und anschließend 2 ml denaturierende DNAse Stop-Lösung 5x und 8 ml 1x PBS hinzugefügt. Dann wurde die Probe mit 250 µg RNAse A versetzt und anschließend 1 h bei 37°C inkubiert. Es folgte die Zugabe von 400 µg Proteinase K. Die Probe wurde über Nacht langsam geschwenkt und dann in ein Probenröhrchen überführt. Die Entfernung der Enzyme erfolgte durch einmalige Phenol- und zweimalige PCI-Extraktion. Die DNA wurde präzipitiert durch Zugabe von 1/10 Volumen Natriumacetat und einer 3-fachen Menge 100% Ethanols, anschließender Kühlung bei -80° C für 2 h und Zentrifugation bei 4°C mit 14.000 UpM für 15 min. Anschließend erfolgte ein Waschvorgang mit 70% Ethanol und die Aufnahme des Pellets in 500 µl TE-Puffer.

2.4.3. Quantifizierung von DNA und RNA

Die Bestimmung der Konzentration einer RNA- oder DNA-Lösung erfolgte photometrisch bei 260 nm. Die Ausgangslösung wurde abhängig von der vermuteten Konzentration 1:100 auf ein Volumen von 500 µl verdünnt und in eine Quarzküvette gegeben. Die gemessene optische Dichte sollte im Bereich von 0,1 bis 1,0 liegen. Der DNA-Gehalt konnte so annähernd errechnet werden: doppelsträngige DNA: 1 _{OD260 = 50 µg/ml}

einzelsträngige DNA bzw. RNA: _{1 OD260 = 40 µg/ml}

Die Bestimmung der Reinheit errechnet sich aus dem Quotienten OD260/OD280. Er sollte im Bereich von 1,8 bis 2,0 liegen.

2.4.4. Northern-Blot -Analyse Verwendete Lösungen:

DEPC-Wasser:

1 ml DEPC in 1 l Aqua bidest.

Nach Inkubation bei Raumtemperatur über Nacht autoklavieren 10 x MOPS: 1 l 41,9 g MOPS 6,8 g Natrium-Acetat 3,8 g EDTA 12 ml Eisessig 1 ml DEPC

mit Aqua bidest. auf ein Gesamtvolumen von 1l auffüllen

pH 5,5-7,0

Nach Inkubation bei Raumtemperatur über Nacht mindestens 30 min autoklavieren, im Dunkeln lagern.

20x SSC:

1 l 175,32 g Natrium-Chlorid

88,23 g Natrium-Citrat

mit Aqua bidest. auf ein Gesamtvolumen von 1 l auffüllen Probenpuffer: 250 µl Formamid 83 µl Formaldehyd (37%) 50 µl 10x MOPS 0,1% Bromophenolblau Methylenblau: 1 l 24 ml Eisessig 65,6 g Natrium-Acetat 400 mg Methylenblau

mit DEPC-Wasser auf ein Gesamtvolumen von 1 l auffüllen Waschlösung 1:

1 l 100 ml 20fach SSC 2,5 ml 20% SDS

mit DEPC-Wasser auf ein Gesamtvolumen von 1 l auffüllen Waschlösung 2:

1 l 5 ml 20fach SSC

5 ml 20% SDS

mit DEPC-Wasser auf ein Gesamtvolumen von 1 l auffüllen

2.4.4.1. Formaldehyd-Gelelektrophorese

Zur elektrophoretischen Auftrennung der RNA wurde ein 1,6 %iges Agarosegel mit 2% Formaldehyd (37%) in 1x MOPS genutzt. Jeweils 10 ng der aus PaTu8988S und PaTu8988T Zelllinien isolierte RNA wurden in 25 µl Probenpuffer und 37,5 µl DEPC-Wasser resuspendiert. 3 µl des RNA-Markers wurden mit 4 µl DEPC-Wasser und 14 µl Probenpuffer vorbereitet. Nach 5-minütiger Denaturierung bei 100oC und anschließender Zugabe von 3 ml

Ladepuffer wurden die Proben aufgetragen. Die RNA wurde bei 80 Volt 2-3 h in 1xMOPS -Laufpuffer aufgetrennt und unter UV-Licht betrachtet, um deren Integrität und die gleichmäßige Beladung des Gels zu überprüfen.

2.4.4.2. Northern Blotting

Um die RNA nach elektrophoretischer Auftrennung auf eine Nylonmembran zu transferieren, wurde ein Kunststoffblock in eine mit 20fach SSC gefüllte Schale gelegt und mit in 20x SSC getränktem Whatmanpapier bedeckt, sodass dieses Flüssigkeit aus der Schale nach oben saugen konnte. Das Gel wurde mit der Oberseite nach unten auf den Block gelegt und mit einer entsprechend zurechtgeschnittenen Hybond-Nylon-Membran bedeckt. Es war darauf zu achten, dass sich zwischen Gel und Whatmanpapier bzw. Membran keine Luftblasen befanden. Nun wurde die Membran von weiteren 4 Lagen Whatmanpapier und einem ca. 5 cm hohen Stapel Papiertücher bedeckt. Unter durch ein auf den Papierstapel aufgesetztes Gewicht hervorgerufenem Druck von oben erfolgte der Transfer der RNA auf die Hybond-Nylon-Membran über Nacht. Anschließend wurde die Membran 2 min in 2x SSC geschüttelt und danach auf ein Whatmanpapier gelegt. Nach Fixierung der RNA auf der Membran durch einen UV-Crosslinker (120.000 mj/cm2) wurde diese lichtgeschützt in einem Hybridisierungsbeutel gelagert.

2.4.4.3. Synthese von cDNA

Isolierte Gesamt-RNA wurde mithilfe der reversen Transkriptase Superscript II in ”komplementäre” DNA (cDNA) umgeschrieben. Dies erfolgte mithilfe des ”SuperScript Choice System for cDNA Synthesis”. 5 µg Total-RNA wurden in ein Endvolumen von 22 µl gegeben. Nach Zugabe von 1 µl Oligo(dt)_12-18 -Primern (50 µM) erfolgte Erhitzen auf 70°C für 10 min. Die Proben wurden dann für 1 min auf Eis gekühlt, es folgte die Zugabe von 10 µl 5x First Strand Puffer, 4 µl 0,1 M DTT, 2 µl 10 mM dNTP Mix sowie 1 µl Superscript II, der reversen Transcriptase. Die Mischung wurde 50 min bei 42°C inkubiert. Die Synthese wurde durch Erhitzen der Probe auf 70°C für 10 min beendet.

2.4.4.4. Herstellung einer radioaktiv markierten cDNA-Sonde

Zur Detektion der auf der Membran fixierten RNA wurde eine cDNA-Sonde mithilfe der RT-PCR hergestellt. Hierzu wurde ein 257 Basenpaar cDNA-Fragment des Tight Junction-Proteins Claudin-7 radioaktiv markiert. Zu diesem Zweck wurden ca. 50 ng cDNA, 2,5 µl 10x Decamers und Aqua bidest. bis zu einem Gesamtvolumen von 13,5 µl in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß gegeben, 5 min bei 95°C denaturiert und dann auf Eis gelegt. Es folgten die Zugabe von 5 µl 5x Puffer-dCTP, 5 µl α[32P]dCTP, 1,5 µl Klenow und eine einstündige Inkubation bei 37°C. Zur Aufreinigung wurden 70 µl STE-Puffer auf eine „Nuc Tap Probe Purification“- Säule gegeben und durchgedrückt. Nach Zentrifugation der Probe erfolgte das Laden von 25 µl derselben auf die Säule. Die Probe sowie danach nochmals 70 µl STE-Puffer wurden ebenfalls durch den Filter der Säule gedrückt und aufgefangen. Die Lagerung erfolgte bei 20°C.

2.4.4.5. Hybridisierung des Northern- Blot

Die Hybridisierung erfolgte mithilfe des Ambion DECAprimeII –Kit. Die UV-bestrahlte Membran wurde in eine silikonisierte, verschließbare Glasröhre mit 10 ml 68°C warme Prähybridisierungslösung gegeben und im Hybridisierungsofen bei langsamer Rotation 30 min bei 68°C inkubiert. Die radioaktiv markierte Sonde wurde auf Eis aufgetaut, 5 min auf 96°C im Heizblock denaturiert und auf Eis gelegt. Anschließend wurde die Prähybridisierungslösung aus der Flasche entfernt und es erfolgte die Zugabe von mit 8 µl der radioaktiv markierten cDNA Sonde versetzter 10 ml Hybridisierungslösung und eine erneute Inkubation für 1 h bei 68°C. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde die Membran 2x 10 min bei Raumtemperatur in 100 ml Waschlösung 1 geschüttelt und nachfolgend 2x 20 min bei 50°C im Hybridisierungsofen mit Waschlösung 2 gewaschen. Die in Folie eingeschweißte Membran wurde autoradiographiert (Exposition 1-2 Tage bei -80°C).

2.4.5. Multiple Tissue Expression Array

Der Multiple Tissue Expression Array von Clontech besteht aus einer Nylon-Membran, auf der 76 unterschiedliche RNA-Proben aus verschiedenen menschlichen Geweben und Karzinom-Zelllinien fixiert wurden. Nach Bestätigung der Sequenz-Spezifität der radioaktiv markierten cDNA-Sonde durch das Ergebnis des Northern-Blots, wurde diese zur Hybridisierung des Multiple Tissue Expression Array zur Feststellung der Expression in den auf der Membran berücksichtigten menschlichen Geweben eingesetzt.

Verwendete Lösungen: DEPC-Wasser:

1 ml DEPC in 1 l Aqua bidest.

nach Inkubation bei Raumtemperatur über Nacht autoklavieren 20x SSC:

1 l 175,32 g Natrium-Chlorid

88,23 g Natrium-Citrat

mit Aqua bidest. auf ein Gesamtvolumen von 1 l auffüllen Waschlösung 1:

1 l 100 ml 20x SSC 2,5 ml 20% SDS

mit DEPC-Wasser auf ein Gesamtvolumen von 1 l auffüllen Waschlösung 2:

1 l 5 ml 20x SSC

5 ml 20% SDS

mit DEPC-Wasser auf ein Gesamtvolumen von 1 l auffüllen

Zur Hybridisierung wurde zunächst die Hybridisierungslösung hergestellt. Hierzu erfolgte die Denaturierung von 150 µl Sheared salmon testes DNA (10mg/ml) durch 5-minütiges Erhitzen im Heizblock auf 95°C und nachfolgendes Abkühlen auf Eis. Die denaturierte DNA wurde mit 15 ml 65°C

ExpressHyb-Hybridisierungslösung (Multiple Tissue Expression Array-Kit) gemischt und 10 ml davon mit der Multiple Tissue Expression Array-Nylon-Membran in eine silikonisierte Hybridisierungs-Glasflasche gegeben. Es folgte eine 30-minütige Prähybridisierung bei 65°C. Für die anschließende Hybridisierung wurden 25 µl der durch RT-PCR amplifizierten und radioaktiv markierten cDNA-Sonde (siehe 2.4.4.4.) zuvor 30 µl Cot-1 DNA, 15 µl sheared salmon testes DNA (10 mg/ml), 50 µl 20x SSC und 80 µl DEPC-Wasser und im Heizblock 5 min bei 95°C denaturiert und mit den restlichen 5 ml der Hybridisierungslösung gemischt. Die Prähybridisierungslösung wurde entfernt und die nun mit der cDNA-Sonde versetzte Hybridisierungslösung in die silikonisierte Hybridisierungs-Glasflasche zugegeben. Die Hybridisierung erfolgte bei 65°C über Nacht. Anschließend wurde die Membran bei 65°C 4x 20 min mit je 100 ml Waschlösung 1 und 2x 20 min mit je 100 ml Waschlösung 2 im Hybridisierungsofen gewaschen. Nach Einschweißen der Membran im Hybridisierungsbeutel erfolgte die Autoradiographie.

2.4.6. Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Die Polymerase-Ketten-Reaktion (engl.: Polymerase-Chain-Reaction, PCR) diente dem Nachweis bekannter DNA-Sequenzen durch Amplifikation sowie in modifizierter Form der Sequenzierung von DNA-Strängen. Ihr zugrunde liegt das Prinzip, einzelsträngige DNA als Vorlage für die Synthese eines komplementären Stranges zu gebrauchen und diesen ebenfalls wieder als Vorlage zur Herstellung einer Kopie des ersten Einzelstrangs einzusetzen. Dies gelingt in zyklisch ablaufenden Synthese-Schritten unter Verwendung des Enzyms DNA-Polymerase, freien Desoxynukleotiden und den sog. Primern, ca. 20 Basenpaare langen Oligonukleotiden mit genspezifischer Sequenz. Der Ablauf einer Amplifikation gestaltet sich mithilfe eines Temperaturwechselgerätes (Thermal Cycler) wie folgt: durch Erhitzen des Reaktionsgemisches auf 95°C trennen sich DNA-Doppelstränge in Einzelstränge. Eine Abkühlung auf Temperaturen zwischen 50° und 70°C je nach verwendeten Primern ermöglicht ein Anlagern der Oligonukleotide an ihre genspezifisch komplementären Orte auf der DNA. Das 3`-Ende des

angelagerten Primers stellt den Startpunkt für die Verlängerung des komplementären Stranges durch die DNA-Polymerase dar, deren Temperatur-Optimum bei 72°C liegt. Die so entstehenden DNA-Doppelstränge werden durch erneutes Erhitzen auf 95°C voneinander getrennt. In der zweiten Amplifikation entstehen nun die ersten identischen Kopien der Vorlage hinsichtlich Länge und Sequenz. Da jeder neu synthetisierte DNA-Strang als Vorlage in der folgenden Amplifikation dienen kann, kommt es optimalerweise zu einer exponentiellen Vervielfältigung des Ausgangsmaterials. So sind bei einer Menge von nur 2 doppelsträngigen DNA-Molekülen des gesuchten Gens im Reaktionsgemisch theoretisch nach 20 Zyklen gut eine Million Kopien vorhanden. Eine PCR benötigt so je nach eingesetzter Menge DNA und ”Funktion” der Primer etwa 25-35 Amplifikationszyklen, um die Darstellung der Fragmente in der Gelelektrophorese sicher zu ermöglichen.

2.4.7. Synthese von cDNA

Isolierte Gesamt-RNA wurde mithilfe der reversen Transkriptase Superscript II in ”komplementäre” DNA (cDNA) umgeschrieben. Dies erfolgte mithilfe des ”SuperScript Choice System for cDNA Synthesis”. 5 µg Total-RNA wurden in ein Endvolumen von 22 µl gegeben. Nach Zugabe von 1 µl Oligo(dt)_12-18 -Primern (50 µM) erfolgte Erhitzen auf 70°C für 10 min. Die Proben wurden dann für 1 min auf Eis gekühlt, es folgte die Zugabe von 10 µl 5x First Strand Puffer, 4 µl 0,1 M DTT, 2 µl 10 mM dNTP Mix sowie 1 µl Superscript II, der reversen Transcriptase. Die Mischung wurde 50 min bei 42°C inkubiert. Die Synthese wurde durch Erhitzen der Probe auf 70°C für 10 min beendet.

2.4.8. PCR mit Reverser Transkriptase (RT-PCR)

Zur Untersuchung der Genexpression verschiedener Tight Junction-Proteine der Claudin-Familie in den duktalen Pankreaskarzinomzelllinien PaTu8988T, PaTu8988S, SUIT-2 S2-007, SUIT-2 S2-013, SUIT-2 S2-020, SUIT-2 S2-028, 8902, PC3, PC 44, PC2, MiaPaCa, Panc1, ASPC1, PaTu2, HPAF und CaPan2 wurde 1 µl cDNA-Lösung entsprechend etwa 4.5 ng cDNA in ein auf Eis gekühltes Reaktionsgefäß gegeben. Bei einem 25 µl Ansatz folgte die Zugabe