Z ELLBIOLOGISCHE  M ETHODEN

2.5.5. Strippen von Nitrocellulosemembranen Strippinglösung: 1mM Glycin-Lösung pH 2,9

Die Nitrocellulosemembran wurde 3x10 min in 1xTBS gewaschen und danach in die Strippinglösung gegeben. Nach einstündigem Schütteln bei Raumtemperatur wurde die Membran erneut 3x10 min in 1xTBS gewaschen.

Bei der Zellinie SUIT-2 S2-007 handelt es sich um eine humane duktale Pankreaskarzinomzellinie, die aus Lebermetastasen gewonnen wurde und nach subkutaner Injektion im Nacktmausmodell eine spontane Metastasierung in Lunge und Leber zeigt. Der Zelllinie entstammen 28 klonale Subzelllinien mit unterschiedlichem Metastasierungs- und Differenzierungsgrad (Iwamura et al., 1997). Zur Untersuchung des Zusammenhangs zwischen dem Metastasierungsgrad der Zellen und der Expression verschiedener Tight Junction-Proteine wurden 4 Subzelllinen ausgewählt, SUIT-2 S2-007, ein mäßig differenziertes duktales Adenokarzinom mit hohem Metastasierungsgrad, SUIT-02 SUIT-020, ein gering differenziertes duktales Adenokarzinom mit mäßigem Metastasierungsgrad, SUIT-02 013, ein gut differenziertes duktales Adenokarzinom mit mäßigem Metastasierungsgrad und SUIT-02 028, ein papillo-duktales Adenokarzinom mit geringem Metastasierungsgrad. Die Zelllinien wurden in DMEM-Medium mit 10% fetalem Kälberserum und 1%

Penicillin/Steptomycin kultiviert.

Die Zellen wurden routinemäßig in 75cm3 Gewebekulturschalen kultiviert. Die Kultur erfolgte in wassergesättigter Atmosphäre bei 37°C unter Begasung mit 5% CO2 und 95% Luft in einem Brutschrank. Die Passagierung erfolgte 1-2 x wöchentlich. Hierzu wurden die annähernd konfluent bewachsenen Kulturflaschen in der sterilen Werkbank von Medium befreit und anschließend mit 1x PBS gewaschen. Mit 4 ml Trypsin-EDTA-Lösung wurden die Zellen vom Boden gelöst, danach bewirkte die Zugabe von Medium die Inaktivierung des Trypsins. Mit der Neubauer-Zählkammer erfolgte die Ermittlung der Zellzahl/ml Medium, um in gewünschter Dichte wieder aussähen zu können.

2.6.2. Einfrieren und Auftauen von Zellen

Zellen, die nicht für Experimente benötigt wurden, lagerten eingefroren in flüssigem Stickstoff. Hierfür erfolgte zunächst das Ernten der Zellen wie oben beschrieben. Mit 2000 UpM wurde die Zellsuspension anschließend 5 min zentrifugiert, danach gewaschen und erneut zentrifugiert. Das Pellet wurde vorsichtig in 2 ml Medium und 10% DMSO resuspendiert und in ein Kryogefäß gefüllt. Das Einfrieren erfolgte zunächst in der -80°C Kühltruhe für einige

Stunden, bevor das Kryoröhrchen in Flüssigstickstoff gelagert wurde. Zum Auftauen wurde warmes Wasser verwendet und der Inhalt des Röhrchens nach Flüssigwerden sofort in eine Zellkulturflasche gegeben, die vorgewärmtes Medium enthielt.

2.6.3. Fixierung von Zellen auf Objektträgern

Für die Immunfluoreszenz-Untersuchungen wurden Zellen auf einem Objektträger oder Chamber-Slide kultiviert, wobei vor der Fixierung die Plastikabtrennung und die Silikonstränge des Chamberslides entfernt wurden.

Die Zellen wurden durch dreimaliges Eintauchen der Objektträger in 1x PBS gewaschen. Es erfolgte nun die Fixierung bei -20°C, zunächst 5 min mit Methanol, dann 1 min mit Aceton. Es bestand die Möglichkeit, die Zellen nach diesem Schritt trocknen zu lassen und bei -20°C einzufrieren oder sie erneut 3x in 1x PBS zu waschen, um sie sofort weiterzuverwenden. Das Auftauen der Zellen erfolgte durch dreimaliges Waschen der gefrorenen Objektträger in 1x PBS bei Raumtemperatur.

2.6.4. Kollagenbeschichtung von Objektträgern

Da nicht alle Zelllinien auf den Glasobjektträgern ein vergleichbar gutes Wachstumsverhalten zeigten, war insbesondere bei der Zelllinie PaTu8988T die Aussaat auf kollagenbeschichteten Objektträgern nötig. Für die Beschichtung wurden 5mg Kollagen zunächst in Ethanol gewaschen, dann eventuell. unter leichtem Erwärmen in 0,01 M Essigsäure gelöst. Nach vollständigem Lösen des Kollagens wurden 45 ml 60%iges Ethanol zugegeben und die Lösung über Nacht bei 4°C inkubiert. Am nächsten Tag wurden auf sterile Öbjektträger je 600 µl der Flüssigkeit gegeben, die Objektträger wurden dann über Nacht in wasserdampfgesättigter Atmosphäre bei 37°C gelagert. Nach Absaugen der restlichen Kollagenlösung erfolgte am nächsten Tag die Trocknung der Objektträger bei 37°C.

2.6.5. Transiente Transfektion mit Lipofektamin

Zellen der Pankreaskarzinomzelllinie PaTu8988T wurden auf kollagenbeschichteten Objektträgern ausgesät. Nach 24 h wurde zunächst das Nährmedium abgenommen. Die Zellen wurden mit FCS-freiem Medium gewaschen, dann wurden 1,6 ml FCS-freies Medium zugegeben. Für die Transfektionslösung wurden 4 µl der Plasmid-DNA pcDNA/TO/myc-His Typ A mit der nach der Transformation im Verfahren der Elektroporation enthaltenen DNA von Claudin-7 sense und antisense (Negativkontrollen: 4 µl reines Plasmid bzw. 4 µl Aqua dest.), 184 µl FCS-freies Medium und 6 µl Plus-Reagenz in ein Reaktionsgefäß gegeben und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

Danach wurden 8 µl Lipofektamin und weitere 192 µl FCS-freies Medium zugegeben und die fertige Transfektionslösung auf die Zellen gegeben. Es folgte eine 3-stündige Inkubationszeit bei 37°C in wasserdampfgesättigter Atmosphäre, dann wurden 2 ml normales FCS-haltiges Nährmedium zugegeben. Am nächsten Tag erfolgte ein Mediumwechsel und anschließend die Behandlung mit PD98059 für 24 h, bevor die Zellen für die Immunfluoreszenzfärbung auf den Objektträgern fixiert wurden.

2.6.6. PD98059 Behandlung von Zellen

Die Behandlung erfolgte an Zellen der Pankreaskarzinomzelllinien PaTu8988S, PaTu8988T, SUIT-2 007, SUIT-2 013, SUIT-2 020 und SUIT-2 S2-028. PD98059 wurde nach Herstellerprotokoll in DMSO gelöst und dem Nährmedium in einer Endkonzentration von 50 µM zugesetzt. Für die Behandlung waren die Zellen zu 70-80% konfluent. Beim Mediumwechsel wurde nach dem Waschen der Zellen mit 1xPBS das entsprechende Nährmedium mit 50 µM PD98059 auf die Zellen gegeben und für 24 h unter normalen Wachstumsbedingungen inkubiert. Zur Negativkontrolle erfolgte die Inkubation der Zellen sowohl mit dem jeweiligen Nährmedium als auch mit 14 mM DMSO Nährmedium entsprechend der Konzentration von DMSO im Nährmedium der PD98059 -behandelten Zellen. Nach der Behandlung wurden die Zellen für die Immunfluoreszenzfärbung fixiert oder Proteine zur Verwendung im Western-Blot extrahiert.

2.6.7. 5-Aza-2´-Deoxycytidin (5-Aza-CdR) Behandlung

Die Identifizierung der durch Methylierung differentiell exprimierten Gene setzte voraus, dass QGP-1 Zellen mit oder ohne Zugabe des Methyltransferase-Hemmstoffs 5-Aza-2´-Deoxycytidin kultiviert wurde. Dafür wurden die Zellen ausgesät und zunächst 24 h unter Normalbedingungen gezüchtet. Es erfolgte ein Mediumwechsel und die Zugabe von 5-Aza-2´-Deoxycytidin in einer Konzentration von 1µM. Im Verlauf von weiteren 72 h wurde alle 24 h das Medium gewechselt und 5-Aza-2´-Deoxycytidin hinzugefügt. Danach erfolgte die Isolation von Gesamt-RNA. Als Kontrolle dienten gleichzeitig kultivierte Zellen der QGP-1 Linie, die nicht mit 5-Aza-2´-Deoxycytidin behandelt wurden.

2.6.8. Immunfluoreszenz und DAPI-Färbung

Die auf Objektträgern fixierten Zellen wurden in 0,2%iges Triton X-100 in 1x PBS gegeben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um ein besseres Eindringen der Antikörper in die Zellen zu ermöglichen. Danach wurde die Morphologie der Zellen unter dem Mikroskop kontrolliert und die anzufärbenden Bereiche mit einem Fettstift umrandet. Es folgte dreimaliges 10minütiges Waschen in 1x PBS, danach wurden die Objektträger zum Blockieren kurz in 1%iges BSA in 1x PBS getaucht, bevor einer der Primärantikörper (Tabelle 3) in einer Verdünnung zwischen 1:100 und 1:200 in 1x PBS auf den entsprechenden Bereich gegeben wurde. Die Objektträger wurden für 1 Stunde in eine feuchte Kammer gelegt. Es erfolgte erneut drei mal 10minütiges Waschen in 1x PBS, dann wurden die entsprechenden Sekundärantikörper in einer Verdünnung von 1:100 oder 1:200 auf die anzufärbenden Bereiche gegeben und die Objektträger für weitere 30 Minuten in die feuchte Kammer gelegt. Mit Zugabe der Sekundärantikörper (Tabelle 3) war darauf zu achten, dass die Lichtexponation der Objektträger auf ein Minimum beschränkt wurde.

Anschließend wurden die Zellen drei mal 10 Minuten in 1x PBS gewaschen, darauf folgte die DAPI-Kernfärbung. Die DAPI-Stammlösung wurde hierzu in einem Verhältnis von 1:1.0000 verdünnt und für 2 Minuten auf die entsprechenden Abschnitte gegeben. Nach abschließendem Waschen der Objektträger in 1x PBS wurden die Zellen in Fluopräp eingebettet. Die

Präparate wurden lichtgeschützt bei 4C° gelagert, bis das Ergebnis der Färbung fotografisch dokumentiert war.

Tabelle 3: Verdünnungen der eingesetzten Antikörper in der Western Blot Analyse

Primärantikörper Hersteller Verdünnung Anti-Claudin-1, polyklonal Kaninchen

IgG

Zymed, Kalofornien USA 1: 100 Anti-Claudin-2, polyklonal Kaninchen

IgG

1: 100 Anti-Claudin-4, monoklonal Maus IgG 1: 100 Anti E-Cadherin, polyklonal Ziege IgG Santa Cruz, Kalifornien,

USA

1:200 Anti-Occludin, polyklonal Kaninchen

IgG

Invitrogen, Karlsruhe

Invitrogen, Karlsruhe

1:100 Anti-ZO-1, polyklonal Kaninchen IgG 1:200 Anti ZO-2, polyklonal Ziege IgG 1:200 Anti-His(C-term)-FITC-konjugiert,

monoklonal Maus IgG

1:100

Anti-myc-FITC-konjugiert, monoklonal Maus IgG

1:100

Sekundärantikörper Hersteller Verdünnung Esel Anti Kaninchen, FITC-konjugiert Santa Cruz, Kalifornien,

USA

1:200 Esel Anti Maus, FITC-konjugiert 1:200 Esel Anti Ziege, FITC-konjugiert 1:200