Klonierung von cDNA‐Fragmenten

Zur Expression von Claudin-7 in Pankreastumorzelllinien wurde zunächst ein Konstrukt hergestellt, bei dem das durch RT-PCR amplifizierte Insert Claudin-7 sense (Nn 1312296 bis 1310640) sowie antisense (Nn 1310640 bis 1312296) in den Expressionsvektor PcDNA/TO/myc-His Typ A ligiert wurde. Dazu wurden die beiden Inserts jeweils mithilfe des PcDNA 3.1/V5-His TOPO TA Expression KIT zunächst in den Vektor PcDNA 3.1/V5-His TOPO ligiert und nach Transformation im Heat-shock-Verfahren durch die kompetenten Zellen TOP 10 amplifiziert. Unter Nutzung des Nucleospin-Kits wurden das Plasmid aus der Bakteriensuspension isoliert und die Inserts durch einen Verdau mit Eco RI und HindIII wieder herausgeschnitten. Nun war es möglich, die DNA Fragmente

Claudin-7 sense und antisense nach Verdau derselben in den Vektor PcDNA/TO/myc-His Typ A zu ligieren und mittels Elektroporation in die kompetenten Zellen DH 10B zu transformieren. Das Ergebnis wurde nach Isolierung mittels Nucleospin-Kit und erneutem Verdau mit Eco RI und HindIII durch Sequenzanalyse gesichert und das Konstrukt in größerer Menge mithilfe des Nucleobond-Kits aus Bakteriensuspension isoliert.

2.4.12.2. Ligation und Transformation

Die in den Vektor PcDNA 3.1/V5 TOPO einzufügenden Fragmente umfassten jeweils die gesamte cDNA für Claudin-7 mit (sense) und entgegen (antisense) der Transkriptionsrichtung. Sie wurden durch RT-PCR amplifiziert, durch Gelelektrophorese isoliert und aus dem Agarosegel eluiert. 4 µl dieses PCR-Produkts wurden in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß gegeben. 1 µl Salt-Solution und 1 µl PcDNA 3.1/V5 TOPO aus dem Kit wurden zugegeben und bei Raumtemperatur 10 min inkubiert. Es folgte die Transformation nach dem HeatshockVerfahren. Hierzu wurden zu 2 µl der PlasmidLösung 50µl Top10 -Zellen gegeben und 10 min auf Eis inkubiert. Dann erfolgte ein kurzes Erwärmen im Heizblock auf 42°C für 30 sec und erneutes Abkühlen für 1min auf Eis. Nun wurden 250 µl SOC-Medium beigefügt und die Bakteriensuspension 1 h bei 37°C inkubiert. Auf 2 mit Ampicillin in einer Endkonzentration von 100 µg/ml versetzte LB-Agar-Platten wurden 100 bzw.

200 µl der Suspension ausgestrichen und über Nacht bei 37°C gelagert. Da der Vektor den transformierten Bakterienzellen eine Ampicillinresistenz verleiht, waren nur die Zellen zum Wachstum befähigt, die das Plasmid aufgenommen hatten. Bei erfolgreichem Versuch hatten sich am nächsten Tag einzelne Klone auf den Platten vermehrt. Isoliert stehende Klone wurden mit einer Pipettenspitze aufgenommen, mit der Spitze in ca. 5 ml LB-Nährmedium mit 100 µg/ml Ampicillin gegeben und über Nacht bei 37°C geschüttelt. Mit dem Nucleospin-Kit wurde der Vektor aus der Bakteriensuspension isoliert und nach einem Verdau mit Eco RI und HindIII sequenzanalytisch gesichert.

2.4.12.3. Restriktion mit HindIII, Eco RI und BamH I

Verdaut wurden sowohl der Vektor PcDNA 3.1/V5 TOPO nach Einfügen der DNA Fragmente aus der RT-PCR, als auch der Vektor PcDNA/TO/myc-His Typ A vor und nach der Ligation. Der Verdau des Vektors PcDNA 3.1/V5 TOPO diente dem Herausschneiden der zuvor eingefügten cDNA von Claudin-7 sense und antisense mit den Restriktionsendonucleasen HindIII und Eco RI, um enzymspezifische Schnittstellen zu erhalten. Da diese Fragmente in das Plasmid PcDNA/TO/myc-His Typ A ligiert werden sollten, war der Verdau dieses Vektors mit HindIII und Eco RI ebenfalls nötig zum Erhalt der entsprechenden Schnittstellen. Um die Religation des offenen Plasmidrings mit dem herausgeschnittenen Fragment zu erschweren, wurde zusätzlich eine Restriktion mit BamH I durchgeführt, der dieses Fragment nochmals zerteilte.

2.4.12.4. Restriktion PcDNA 3.1/V5 TOPO mit HindIII und Eco RI

In ein 1,5ml Eppendorf-Reaktionsgefäß wurden 3 µl Puffer NEB 2, 0,3 µl BSA, 5 µl der Plasmid-DNA und je 10 U der Restriktionsendonucleasen HindIII und Eco RI gegeben und mit Aqua bidest. auf ein Gesamtvolumen von 25 µl aufgefüllt.

Es folgte eine Inkubation von 30 min bei 37°C im Heizblock, während der Verdau stattfand. Die anschließende 10minütige Inkubation bei 65°C diente der Inaktivierung der Restriktionsendonucleasen. Das Produkt des Verdaus wurde gelelektrophoretisch aufgetrennt und die herausgeschnittenen Fragmente mithilfe des ”QIAquick Gel Extraction Kit” zur sequenzanalytischen Erfolgskontrolle und zur Ligation mit PcDNA/TO/myc-His eluiert.

2.4.12.5. Restriktion PcDNA/TO/myc-His mit HindIII, Eco RI und BamH I In ein 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß wurden 6 µl Y+Tango 10x-Puffer, 2 µl Plasmid-DNA (1 µg/µl) und je 10 U der Restriktionsendonucleasen HindIII und Eco RI gegeben und mit Aqua bidest. auf ein Gesamtvolumen von 30 µl aufgefüllt. Es folgte eine Inkubation von 30 min bei 37°C im Heizblock, dann wurden 10 U der Restriktionsendonuclease BamH I zugegeben und nochmals 10 min bei 37°C inkubiert. Die anschließende 10minütige Inkubation bei 65°C diente der Inaktivierung der Restriktionsendonucleasen. Beim Kontrollverdau

nach erfolgter Ligation entfiel der Verdau mit BamH I. Das Produkt des Verdaus wurde gelelektrophoretisch aufgetrennt und der nun offene Plasmidring anhand der Bandengröße identifiziert und zur Ligation mithilfe des ”QIAquick Gel Extraction Kit” eluiert. Beim Kontrollverdau wurde das jeweils herausgeschnittene DNA-Fragment nach gelelektrophoretischer Auftrennung des Verdaus und Elution seqenzanalytisch als cDNA von Claudin-7 sense und antisense identifiziert.

2.4.12.6. Ligation

Für die Ligation des geschnittenen Plasmids PcDNA/TO/myc-His Typ A mit dem aus dem Plasmid PcDNA 3.1/V5 TOPO herausgeschnittenen Inserts, der cDNA von Claudin-7 sense und antisense, wurden 2 µl der Plasmid-DNA, 2 bzw. 5 µl des Inserts sense oder antisense, 2 µl 10fach-Puffer und 1 µl Ligase in ein 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß gegeben und mit Aqua bidest. auf ein Gesamtvolumen von 20 µl aufgefüllt. Es folgte eine Inkubation bei 16°C über Nacht, dann ein 10minütiges Erwärmen auf 37°C. Die Ligation wurde nun durch Zugabe von 140 µl Ethanol 100%, 20 µl Ammonium-Acetat und 20 µ Aqua bidest. gefällt und 15 min bei 13000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und das Pellet durch Zugabe von 100 µl Ethanol 70% und Zentrifugation 5 min bei 13000 UpM gewaschen. Nach Abnehmen des Überstands wurde das Pellet in 5 µl Aqua bidest. gelöst und für die Transformation mittels Elektroporation weiterverwendet.

2.4.12.7. Transformation Verwendete Nährmedien:

LB-Medium:

1l: 10 g Trypton/Pepton aus Casein

5g Yeast Extrak

10g Natrium-Chlorid

mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 1l auffüllen und autoklavieren LB-Agar-Medium

1l: 10 g Trypton/Pepton aus Casein

5g Yeast Extrak

10g Natrium-Chlorid

15g Agar

mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 1l auffüllen und autoklavieren, auf 60°C abkühlen lassen und in Kulturschalen mit einem Durchmesser von 10 cm gießen und aushärten lassen

Für die Elektroporation wurde der Ligationsansatz auf Eis vorgekühlt und die kompetenten Zellen DH10B auf Eis aufgetaut. 1µl des Ligationsansatzes und 25 µl kompetente Zellen wurden in eine vorgekühlte Transporations-Küvette gegeben und 1 min auf Eis inkubiert. Die Transporation fand bei 2,5 kV, 250 µF und niedrigem Widerstand statt. Danach wurde 1 ml antibiotikafreies LB-Medium zugegeben und die Bakteriensuspension 30-60 min bei 37°C inkubiert.

Es folgte das Ausplattieren der Bakterien auf LB-Platten mit 100µg/ml Ampicillin, wobei 50, 100 und 400 µl der Bakteriensuspension genutzt wurden, um möglichem dichteren bzw. weniger dichtem Wachstum von Klonen gerecht zu werden. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C im Brutschrank aufbewahrt.