Gewebe‐, tumor‐ und entwicklungsspezifische Expression von

Zur Bestimmung der Expressionsqualität und -quantität von Claudin-7 in verschiedenen humanen Geweben und Karzinomzellen wurde ein Multiple Tissue Expression (MTE) Array (Clontech) angewandt. Dieser Array ist ein RNA Dot Blot mit 76 RNA-Proben aus verschiedenen fetalen und adulten humanen Geweben, Karzinomzelllinien und Kontroll-RNAs. Für die Hybridisierung des Blots wurde die für den Northern-Blot eingesetzte cDNA-Sonde angewandt.

Die Ergebnisse der Autoradiographie sind in Abbildung 17 dargestellt. Claudin-7 wurde in zahlreichen Organen in unterschiedlicher Stärke transkribiert. Die Autoradiographie zeigte eine Claudin-7 Expression in fast allen Geweben des Zentralnervensystems in unterschiedlicher Stärke (Spalten 1 und 2, A bis H, sowie Spalte 3, A bis E). Claudin-7 wurde prominenter in der Hypophyse (Spalte 3, D), dagegen schwächer in der Substantia nigra, Nucleus accumbens und Thalamus exprimiert (Spalte 3, A-C). Auch in den unterschiedlichen Abschnitten des Herzens fand sich Claudin-7 Expression (Spalte 4). Besonders deutlich wurde Claudin-7 in den Organen des Gastrointestinaltraktes exprimiert (Spalten 5 und 6), wobei die Expression von proximal nach distal zunahm und insbesondere im Bereich des Kolons und Rektums, aber auch in der kolorektalen Adenokarzinomzelllinie SW480 (Spalte 10, G) prominent war. Eine ebenso starke Expression von Claudin-7 wurde in Trachea (Spalte 7, H) beobachtet. Eine mittelstarke Expression von Claudin-7 zeigte fetale und adulte Niere, fetale und adulte Lunge, fetale und adulte Leber, Schilddrüse, Plazenta und Prostata. Claudin-7 wurde ebenso mittelstark im normalen Pankreas exprimiert. Während die Expression in fetaler Lunge und adulter Lunge etwa gleich stark war, zeigte die Lungenkarzinomzelllinie A549 eine geringe Claudin-7 Expression (Spalte 10, H). In fetaler Milz und Thymus schien die Claudin-Claudin-7 Expression etwas stärker als in den korrespondierenden adulten Organen (Spalten 7C, 11E und Spalten 7D, 11F). Eine eher geringe Claudin-7 Transkription zeigten Gewebe des Immunsystems, Leukämiezellen, Lymphomzellen sowie Uterus und Ovarien. Die Autoradiographie zeigte ein

möglicherweise durch Crosshybridisierung bedingtes minimales Signal in E.coli DNA und humaner genomischer DNA (Spalte 12D, Spalte 12H).

Abbildung 17. Genetisches Expressionsprofil von Claudin-7 in humanen Geweben und Tumorzelllinien.

(a) Multiple Tissue Expression Array (Clontech) Autoradiographie nach Hybridisierung mit einer radioaktivmarkierten humanen Claudin-7 Sonde für 2 Tage. Gewebe mit starker Claudin-7 Expression sind mit Pfeilen markiert. (b) Schematische Lokalisation der RNA-Dots der verschiedenen Gewebe und Zelllinien. P.g.*, parazentraler Gyrus der Großhirnrinde.

Zusammenfassend wurde Claudin-7 in den meisten adulten Geweben des menschlichen Körpers und in einzelnen Organen während der Fetalzeit in unterschiedlicher Stärke exprimiert. Die stärkste Claudin-7 Expression wiesen die adulten Organe des Gastrointestinaltraktes und die Trachea auf. Das Ergebnis des MTE Arrays ist in Abbildung 17 dargestellt.

3.5.3. Subzelluläre Lokalisation von Claudin-7 Fusionsprotein in PaTu8988T Pankreastumorzellen

Aufgrund der differentiellen Expression von Claudin-7 im Pankreaskarzinommodell PaTu8988S/T mit fehlendem Nachweis der Claudin-7 Expression in den nicht metastasierenden PaTu8988T Zellen war von Interesse, ob Claudin-7 als Tight Junction Komponente einen Einfluss auf die Zellmorphologie hat. Zudem war die subzelluläre Lokalisation von Claudin-7 von Interesse, die bisher unbekannt war, da kein spezifischer Antikörper zur Verfügung stand.

Anhand der unter www.pubmed.gov zugänglichen Daten über die Claudin-7 cDNA (Gen-Accession-Number XM_008338) und der genomischen Claudin-7 Sequenz wurden für die weiteren Untersuchnungen Primersequenzen zur Amplifikation abgeleitet. Wie schematisch dargestellt liegt Claudin-7 auf Chromosom 17p13 und die kodierende Sequenz mit 3 Exons und 4 Introns umfasst 636 Basenpaare. Zur Orientierung hinsichtlich der Lokalisation der für

die folgenden Untersuchungen angewandten Primersequenzen wurden diese in Abbildung 18 dargestellt.

Abbildung 18. Claudin-7 Gensequenz und Lokalisation im humanen Genom.

(a) cDNA Sequenz von Claudin-7 mit Lokalisation der angewandten Primersequenzen (blau markiert). Rot sind Start und Stoppkodon markiert (Genbank-Accession-Number XM_008338).

Die Pfeile geben die Lokalisation der angewandten forward (>) und reversen (<) Primer an. (b) Übersicht über die Lokalisation der kodierenden Claudin-7 Genabschnitte (blaue Balken) auf Chromosom 17p13 (Genbank-Accession-Number XM_008338) und der angewandten Primerpaare (nach unten gerichtete senkrechte Pfeile). Die cDNA Nukleotidposition wird durch nach obern gerichtete Pfeile, die genomische Nukleotidposition in der untersten Zeile angegeben (Genbank-Accession_Number XM_008338). Nn, Nukleotide; CH, Chromosom; Start, Startkodon;

Stop, Stoppcodon; blaue Balken, Exon; grüne Balken, Intron

Da zum Zeitpunkt der Untersuchungen kein kommerzieller Claudin-7 Antikörper zur Verfügung stand, wurde der Expressionsvektor pcDNA/TO/myc-HIS zur Klonierung der humanen Claudin-7 cDNA gewählt. Hierbei wird die Claudin-7 cDNA Sequenz so kloniert, dass ein Fusionsprotein von Claudin-7 mit einem COOH terminalen Myc Epitop und einer anschließenden Poly-HIS-Sequenz generiert wird. Dadurch kann ein gegen das Myc-Epitop oder die Poly-HIS-Sequenz gerichteter Antikörper als Hinweis für die Claudin-7 Expression angewandt werden. (Abbildung 19).

Abbildung 19. Herstellung eines Expressionsvektors zur Claudin-7 Expression in Pankreaskarzinomzellen PaTu8988T.

Die Claudin-7 cDNA Sequenz wurde mithilfe der RT-PCR amplifiziert und in Transkriptionsrichtung in den Expressionsvektor pcDNA/TO/myc-HIS Plasmids ligiert (a) Karte des Cl-7/pcDNA/TO/myc-HIS Expressionsplasmids (Invitrogen). Das myc-Epitop oder poly-HIS dienen dem immunfluoreszenzmikroskopischen Nachweis der 7 Expression. (b) Claudin-7 cDNA Amplifikat (636 bp, Nn 336 bis 9Claudin-71, durch Sequenzierung bestätigt) nach PCR mit Primern Claudin7HindIIIf und Claudin7EcoRIr vor Ligation. (c) Restriktionsanalyse mit HindIII und EcoRI des pcDNA/TO/myc-HIS Plasmids. (d) Restriktionsanalyse des Cl-7/pcDNA/TO/myc-HIS Plasmids. M3, λDNA/EcoRI+HindIII Marker 3; M8, pUC Mix Marker 8; bp, Basenpaar; HindIII, EcoRI Restriktionsenzyme; Cl-7, Claudin-7.

Hierzu wurde zunächst die Claudin-7 cDNA (Nukleotid 336 bis 971) unter Einsatz der PaTu8988S cDNA als Template durch RT-PCR mithilfe des Primerpaars Claudin-7HindIIIf und Claudin-7EcoRIr amplifiziert.

Interessanterweise wurden bei der Amplifikation immer zwei Amplifikate generiert: Zum Einen das erwartete Claudin-7 cDNA Fragment mit 636 Basenpaaren und zum Anderen ein cDNA Fragment von etwa 1000 Basenpaaren das bei der bisherigen Amplifikation kürzerer Sequenzabschnitte nicht nachweisbar war. Das 636 bp Fragment wurde durch Sequenzanalyse als Claudin-7 identifiziert, das größere Transkript wurde zunächst nicht weiter charakterisiert. Das 636 bp Claudin-7 Amplifikat wurde nach Restriktion mit HindIII und EcoRI in den durch Restriktion (HindIII, EcoRI) vorbereiteten Expressionsvektor pcDNA/TO/myc-HIS ligiert (Abbildung 19). Dieses Plasmid wurde im Folgenden als Cl-7/pcDNA/TO/myc-HIS bezeichnet und zur transienten Transfektion mithilfe von Lipofektamin in die kein Claudin-7 exprimierende Zelllinie PaTu8988T eingesetzt.

Mutationen im K-ras Gen liegen in fast allen duktalen Adenokarzinomen des Pankreas vor und einer der Effektorwege von Ras ist der Raf-MEK-ERK-Signaltransduktionsweg. Da die Zelllinie PaTu8988T eine K-ras Genmutation aufweist (He et al., 2005), sollte im Folgenden auch gleichzeitig der Effekt des MEK1-Inhibitors PD98059 nach Transfektion von Cl-7/pcDNA/TO/myc-HIS auf die Claudin-7 Expression und Lokalisation in PaTu8988T Zellen untersucht werden.

Die PaTu8988T Zellen wurden dazu entweder nicht oder mit dem Plasmid pcDNA/TO/myc-HIS transfiziert und nach 48 h für weitere 24 h in Kontrollmedium (Nährmedium mit DMSO, 0,1%, v/v) kultiviert. Mit Cl-7/pcDNA/TO/myc-HIS transfizierte PaTu8988T Zellen wurden entweder in Kontrollmedium (Nährmedium mit DMSO, 0,1 %, v/v) oder in PD98059 (50 µM in Nährmedium mit DMSO, 0,1 %, v/v) für 24 h kultiviert.

Die Transfektionseffizienz in den PaTu8988T Zellen war wie bekannt und erwartet sehr gering, sodass sich anhand der Immunfluoreszenz nach

exprimierende Zellen sowohl in der DMSO-Kontrollgruppe als auch in den mit PD98059 behandelten PaTu8988T Zellen zeigten (Abbildung 20).

Abbildung 20. Immunfluoreszenzmikroskopischer Nachweis der Claudin-7 Expression nach transienter Transfektion in PaTu8988T Zellen.

(1) Nichttransfizierte PaTu8988T Zellen in Medium mit DMSO (0,1%,v/v) (2) pcDNA/TO/myc-HIS transfizierte PaTu8988T Zellen in Medium mit DMSO (0,1%,v/v) (3) Cl-7/pcDNA/TO/myc-HIS transfizierte PaTu8988T Zellen wurden entweder nur in DMSO (0,1%,v/v) oder (4) mit in DMSO (0,1%,v/v) gelösten 50 µM PD98059 kultiviert. Obere Reihe: Immunfluoreszenz 24 Stunden nach Transfektion und 24 Stunden PD98059 Behandlung oder nur DMSO Behandlung nach Poly-His Antikörper Färbung. Untere Reihe: DAPI-Kernfärbung. Vergrößerung: Okular 10x; Objektiv 40x.

Das Fusionsprotein Claudin-7/myc/PolyHIS erschien in den PaTu8988T Zellen membranständig aber auch diffus im Zytoplasma mit teilweiser Aussparung des Nukleus lokalisiert, wobei berücksichtigt werden muss, dass es sich um ein Fusionsprotein handelt und eine andere subzelluläre Lokalisation des nativen

7 nicht auszuschließen ist. Im Gegensatz zu den Claudin-7/myc/PolyHIS exprimierenden PaTu8988T Zellen wurde keine Claudin-7 Expression in den mit pcDNA/TO/myc-HIS transfizierten PaTu8988T Zellen nachgewiesen. Aufgrund der vereinzelten Lage der Claudin-7/myc/PolyHIS exprimierenden Zellen war eine durch Claudin-7 Expression bedingte Veränderung von Zell-Zell-Kontakten nicht beurteilbar.

Zusammenfassend konnte anhand der transienten Transfektion eines Claudin-7/myc/PolyHIS Konstruktes erstmals die Lokalisation von Claudin-7 nachgewiesen werden, wobei jedoch die subzelluläre Lokalisation aufgrund des Fusionsproteins und die Zellmorphologie aufgrund der geringen Transfektionseffizienz nur eingeschränkt beurteilbar sind. Zur weiteren Klärung müsste nun dieses Cl-7/pcDNA/TO/myc-HIS Plasmid stabil transfiziert werden.

3.6. Expression und subzelluläre Lokalisation von Tight Junction-, Tight Junction-assoziierten und Adherens Junction Proteinen nach Inhibition des Raf-MEK-ERK-Signaltransduktionweges in Pankreaskarzinom-zellen

Adhärenzverbindungen spielen im Prozess der Metastasierung eine wichtige Rolle. Um zu untersuchen, ob die K-ras Mutation in den SUIT-2 und PaTu8988S/T (He et al., 2005; Kainuma et al., 1997) Metastasierungsmodellen bei der Expression und subzellulären Lokalisation von Tight Junction und -assoziierten Proteinen sowie Adherens Junction Proteinen eine Rolle spielt, wurde die Wirkung der Inhibition des Raf-MEK-ERK-Signaltransduktionsweges mithilfe des selektiven MEK-1 Inhibitors PD98059, der zu einer Blockade der mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) Kaskade führt, untersucht.

3.6.1. Wirkung der Inhibition des Raf-MEK-ERK-Signal-transduktionsweges auf Tight Junction und -assoziierte Proteine im PaTu8988S/T Pankreaskarzinom Metastasierungsmodell

Im Folgenden wurde die Wirkung der MAPK/ERK Inhibition durch den MEK1-Inhibitor PD98059 auf die Proteinexpression der Tight Junction Proteine Claudin-1, Claudin-2, Claudin-4 und der Tight Junction-assoziierten Proteine ZO-1 und ZO-2 im PaTu8988S/T Metastasierungsmodell untersucht. Die Expressionsanalyse von Claudin-7 war aufgrund des zum Zeitpunkt der Untersuchungen nicht zur Verfügung stehenden kommerziellen Antikörpers nicht möglich.

Hierzu wurden die Pankreaskarzinomzellen PaTu8988S und PaTu8988T entweder nur in Nährmedium, mit DMSO (0,1% v/v) oder in DMSO gelöstem MEK1-Inhibitor PD98059 (Endkonzentration 50µM im Nährmedium) für 24 Stunden kultiviert. In der Literatur ist der Effekt von PD98059 uneinheitlich im Hinblick auf die Kontrollzellen untersucht worden, indem entweder native oder in DMSO behandelte Zellen als Kontrollen zur Beurteilung des Effektes von PD98059 herangezogen wurden (Grände et al., 2002; Medici et al., 2006;

Nguyen et al., 2004; Wheadon and Welham, 2003). Daher erfolgte in der vorliegenden Arbeit die Kultivierung nativer als auch mit DMSO behandelter Zellen als Kontrollen. Anschließend wurden Proteinextrakte hergestellt und die Untersuchung der Expression der Tight Junction Proteine Claudin-1, Claudin-2, Claudin-4 und Occludin sowie der Tight Junction-assoziierten Proteine ZO-1 und ZO-2 anhand einer Western Blot Analyse durchgeführt. Die Untersuchung der Expression des Aktinproteins diente der Ladekontrolle.

Die Western Blot Analyse zeigte für Claudin-1 zwischen den mit DMSO und den mit dem MEK1-Inhibitor PD98059 behandelten PaTu8988S Zellen keinen Expressionsunterschied, im Vergleich zu den unbehandelten Zellen jedoch eine stärkere Expression. Die PaTu8988T Zellen zeigten in der nativen Kontrolle, der DMSO Kontrolle und den PD98059 behandelten Zellen in Anbetracht der Aktin-Kontrolle eine vergleichbar starke Claudin-1 Expression. Claudin-2 wurde in

den nativen PaTu8988S Zellen stark und etwas weniger stark in den DMSO-Kontrollzellen exprimiert, dagegen war es in den mit PD98059 behandelten Zellen kaum nachweisbar. Die Claudin-4 Expression nahm in den PaTu8988S Zellen vergleichbar nach DMSO und PD98059 Behandlung leicht zu. Die fehlende Expression von Claudin-2 und Claudin-4 in den PaTu8988T Zellen veränderte sich unter DMSO oder PD98059 Behandlung nicht. Die Tight Junction-assoziierten Proteine ZO-1 und ZO-2 wurden in den PaTu8988S Zellen nach PD98059 Behandlung schwächer, und noch schwächer nach DMSO Behandlung im Vergleich zu den unbehandelten Zellen exprimiert.

Dagegen zeigten die PaTu8988T Zellen keine relevanten ZO-1 Expressionsunterschiede in den unbehandelten, mit DMSO oder PD98059 behandelten Zellen. ZO-2 wurde in den PaTu8988S Zellen kaum exprimiert. In den nativen PaTu8988T Zellen war ZO-2 schwach, etwas stärker in den DMSO behandelten und kaum in den mit PD98059 behandelten Zellen nachweisbar.

Occludin wurde in den nativen PaTu8988S Zellen leicht, und nach DMSO und PD98059 ansteigend vermehrt exprimiert, während die PaTu8988T Zellen eine unveränderte Occludinexpression aufwiesen.

Zusammenfassend zeigte sich im Western Blot nach Behandlung mit dem MEK1-Inhibitor PD98059 in der Zelllinie PaTu8988S im Vergleich zu den DMSO-behandelten Zellen eine deutliche Expressionsabnahme von Claudin-2, eine leichte Zunahme von ZO-1, eine Zunahme von Occludin bei unverändertem Expressionsprofil von Claudin-1, Claudin-4 und ZO-2. Nach Behandlung der Zelllinie PaTu8988T mit PD98059 zeigte sich im Vergleich zu den mit DMSO behandelten Zellen eine Reduktion der ZO-2 Expression bei ansonsten unverändertem Expressionsprofil für 1, 2, Claudin-4, Occludin und ZO-1. Die Ergebnisse zeigen weiter, dass DMSO im Vergleich zu den nativen PaTu8988S Zellen zu Veränderungen hinsichtlich der Expression von Claudin-1, Claudin-2, Claudin-4, ZO-1 und Occludin führte und daher native als auch DMSO Kontrollen zur Interpretation der Wirkung von PD98059 berücksichtigt werden müssen. Die Ergebnisse der Western Blot Analyse sind in Abbildung 21 dargestellt.

Abbildung 21. Wirkung der MEK-1 Inhibition auf die Expression von Tight Junction- und Tight-Junction-assoziierten Proteinen im Metastasierungsmodell der Pankreaskarzinomzellen PaTu8988S / -T.

Repräsentative Western Blot Analyse mit Proteinextraken aus den 24 Stunden in Nährmedium (N), mit DMSO (0,1%, v/v; DMSO) oder 50 µM PD98059 (0,1% DMSO v/v; PD) behandelten Zellen. Die Proteinextrakte wurden elektrophoretisch im SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt, auf eine Nylonmembran geblottet und die Tight Junction-Proteine Claudin-1, -2, -4 und Occludin sowie die Tight Junction-assoziierten Proteine ZO-1 und ZO-2 mithilfe spezifischer primärer Antikörper anhand der ECL-Methode visualisiert. Aktin diente der Ladungskontrolle (repräsentativer Blot). kD, Kilodalton

3.6.2. Wirkung der Inhibition des Raf-MEK-ERK-Signal-transduktionsweges auf die Expression von Tight Junction und Tight Junction -assoziierten Proteinen im humanen SUIT-2 Pankreaskarzinom-Metastasierungsmodell

Aufgrund der bekannten K-ras Mutation in den SUIT-2 Zellen (Kainuma et al., 1997) wurde die Inhibition des Raf-MEK-ERK-Signaltransduktionsweges mithilfe des selektiven MEK-1 Inhibitor PD98059, der zu einer Blockade der mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) Kaskade führt, zur Behandlung der SUIT-2 Pankreastumorzellen eingesetzt, um die Wirkung auf Tight Junction- und Tight Junction-assoziierte Proteine mittels Western Blot Analyse zu untersuchen.

Hierzu wurden die vier SUIT-2 Pankreaskarzinom Subzelllinien SUIT-2 S2-007, SUIT-2 S2-020, SUIT-2 S2-013 und SUIT-2 S2-028 entweder nur in Nährmedium, mit DMSO (0,1%,v/v) oder in DMSO gelöstem MEK1-Inhibitor PD98059 (Endkonzentration 50 µM im Nährmedium) für 24 Stunden kultiviert.

In der vorliegenden Arbeit wurde sowohl die Untersuchung nativer als auch in DMSO kultivierter Zellen als Kontrollen durchgeführt, um einen möglichen Effekt durch DMSO, in dem PD98059 gelöst wird, festzustellen. Anschließend wurden Proteinextrakte hergestellt und die Expression der Tight Junction Proteine Claudin-1, Claudin-2, Claudin-4 und Occludin sowie der Tight Junction-assoziierten Proteine ZO-1 und ZO-2 anhand einer Western Blot Analyse analysiert. Die Expressionsanalyse von Claudin-7 war aufgrund des zum Zeitpunkt der Untersuchungen nicht zur Verfügung stehenden kommerziellen Antikörpers nicht möglich. Die Untersuchung der Expression des Aktinproteins diente der Ladekontrolle.

Die Zelllinie SUIT-2 S2-007 (mittelmäßig differenziert, stark metastasierend) zeigte anhand der Western Blot Analyse keine wesentliche Veränderung der Claudin-1 und Occludin Expression in den 24-stündig mit dem MEK-1 Inhibitor PD98059 behandelten Zellen im Vergleich zu den unbehandelten oder den mit DMSO behandelten Kontrollzellen. ZO-1 zeigte nach PD98059 Behandlung keine Veränderung zu den DMSO behandelten Zellen, und eine geringe

Reduktion der Expression im Vergleich zu den nativen Zellen. In den SUIT-2 S2-007 Zellen führte bereits die 24-stündige DMSO Behandlung alleine zu einer starken Reduktion der Claudin-2 Proteinexpression, die nach PD98059 Behandlung nur wenig geringer ausfiel, sodass Claudin-2 nur noch schwach nachweisbar war. Ebenso war die Expression von ZO-2 in den mit DMSO und mit PD98059 behandelten Zellen im Vergleich zu den unbehandelten Zellen gleichstark reduziert. Während Claudin-4 in den unbehandelten und den mit PD98059 behandelten Zellen keinen Expressionsunterschied aufwies, war die Claudin-4 Proteinexpression in den mit DMSO behandelten Zellen verringert.

Die Ergebnisse der Western Blot Analyse für die Zelllinie SUIT-2 S2-007 sind in Abbildung 22 dargestellt.

In der Zelllinie SUIT-2 S2-020 (wenig differenziert und mittelmäßig metastasierend) wurde für die Proteine Claudin-1 und Occludin keine wesentliche Veränderung der Proteinexpression nach Behandlung der Zellen mit dem MEK-1 Inhibitor PD98059 im Vergleich zu den nativen oder in DMSO kultivierten Kontrollzellen beobachtet. Die 24-stündige PD98059 Behandlung führte dagegen im Vergleich zu den DMSO Kontrollzellen zu einer deutlichen Reduktion der Claudin-2 und ZO-2 Proteinexpression, wobei die DMSO behandelten Zellen die gleiche Expressionsstärke aufwiesen wie die nativen Kontrollzellen. Claudin-4 und ZO-1 waren in den 24-stündig mit DMSO oder PD98059 behandelten SUIT-2 S2-020 Zellen gleichstark exprimiert und leicht reduziert im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollzellen, wobei auch Aktin ein ähnliches Expressionsmuster aufwies. Die Ergebnisse der Western Blot Analyse für die Zelllinie SUIT-2 S2-020 sind in Abbildung 22 dargestellt.

In der Zelllinie SUIT-2 S2-013 (gut differenziert und mittelmäßig metastasierend) war für die Proteine Occludin und Aktin keine wesentliche Veränderung der Proteinexpression nach Behandlung der Zellen mit dem MEK-1 Inhibitor PD98059 im Vergleich zu den nativen oder in DMSO kultivierten Kontrollzellen nachweisbar. Claudin-1 und Claudin-4 waren in den mit dem MEK-1 Inhibitor behandelten SUIT-2 S2-013 Zellen stärker exprimiert als in den in DMSO kultivierten Kontrollzellen, aber gleichstark wie in den unbehandelten

SUIT-2 S2-013 Zellen. Das Proteinextrakt aus der Zelllinie zeigte bereits unbehandelt eine schwache Claudin-2 Expression, die nach 24-stündiger Kultur in PD98059 und in den DMSO kultivierten Kontrollzellen kaum mehr nachweisbar war. Ein vergleichbares Expressionsprofil wies ZO-2 auf. ZO-1 zeigte nach PD98059 Behandlung keine wesentliche Veränderung zu den DMSO behandelten Zellen, und eine geringe Reduktion der Expression im Vergleich zu den nativen Zellen. Die Ergebnisse der Western Blot Analyse für die Zelllinie SUIT-2 S2-013 sind in Abbildung 22 dargestellt.

In der Zelllinie SUIT-2 S2-028 (gut differenziert, wenig metastasierend) war für die stark exprimierten Proteine Claudin-1, Occludin und Claudin-4, sowie für das schwächer exprimierte ZO-1 und für das noch schwächer exprimierte ZO-2 keine wesentliche Veränderung der Expression nach Behandlung der Zellen mit dem MEK-1 Inhibitor PD98059 im Vergleich zu den nativen und in DMSO kultivierten Kontrollzellen nachweisbar. Die 24-stündige PD98059 Behandlung führte dagegen in den SUIT-2 S2-028 Zellen zu einer deutlichen Reduktion der starken Claudin-2 Expression im Vergleich zu den DMSO behandelten und den unbehandelten Zellen. Die Ergebnisse der Western Blot Analyse für die Zelllinie SUIT-2 S2-028 sind in Abbildung 22 dargestellt.

Zusammenfassend zeigte die Western Blot Analyse, dass der MEK-1 Inhibitor auf die Expression der verschiedenen untersuchten Tight Junction Proteine und Tight Junction assoziierten Proteine eine heterogene Wirkung hinsichtlich ihrer Proteinexpression hatte. Zudem zeigte sich für ein bestimmtes Tight Junction oder –assoziiertes Protein ein unterschiedliches Expressionsverhalten in den 4 SUIT-2 Subzelllinien nach Behandlung mit dem MEK1-Inhibitor PD98059. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass DMSO Behandlung in einer Endkonzentration, die der der PD98059 behandelten Zellen entsprach, im Vergleich zu den nativen Zellen subzelllinienspezifisch zu Veränderungen hinsichtlich der Expression von Claudin-1, Claudin-2, Claudin-4, ZO-1 und ZO-2 führte und daher native als auch DMSO Kontrollen zur Interpretation der Wirkung von PD98059 berücksichtigt werden müssen.

Abbildung 22. Wirkung der MEK-1 Inhibition auf die Expression von Tight Junction und Tight Junction-assoziierten Proteinen in den Subzelllinien des humanen SUIT-2 Pankreaskarzinom Metastasierungsmodells.

Repräsentative Western Blot Analyse mit Proteinextraken aus den 24 h in Nährmedium (N), mit DMSO (0,1%, v/v; DMSO) oder 50 µM PD98059 (0,1% DMSO v/v; PD) behandelten 4 SUIT-2 Subzelllinien SUIT-2 S2-007 (mittelmäßig differenziert, stark metastasierend), SUIT-2 S2-020 (wenig differenziert und mittelmäßig metastasierend), SUIT-2 S2-013 (gut differenziert und mittelmäßig metastasierend), SUIT-2 S2-028 (gut differenziert, wenig metastasierend). Die Proteinextrakte wurden elektrophoretisch im SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt, auf eine Nylonmembran geblottet und die Tight Junction-Proteine Claudin-1, -2, -4 und Occludin sowie die Tight Junction-assoziierten Proteine ZO-1 und ZO-2 mithilfe spezifischer primärer Antikörper anhand der ECL-Methode visualisiert. Aktin diente der Ladungskontrolle (repräsentativer Blot).

kD, Kilodalton.

3.6.3. Subzelluläre Lokalisation und Redistribution von Tight Junction, Tight Junction-assoziierten und Adherens Junction Proteinen nach Inhibition des Raf-MEK-ERK-Signaltransduktionsweges in SUIT-2 Subzelllinien

In den folgenden Untersuchungen sollte zum Einen die Expression und subzelluläre Lokalisation von Tight Junction und Tight Junction-assoziierten sowie Adherens Junction Proteine in den SUIT-2 Pankreaskarzinom Subzelllinien mittels Immunfluoreszenzmikroskopie untersucht werden. Zum Anderen sollte die Wirkung der Inhibition des Raf-MEK-ERK-Signaltransduktionsweges mithilfe des selektiven MEK-1 Inhibitor PD98059, der zu einer Blockade der mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) Kaskade führt, auf die subzelluläre Lokalisation analysiert werden. Immunzytochemische Untersuchungen hatten zuvor gezeigt, dass Claudin-2 durch Inhibition der MAPK Kaskade durch den MEK-1 Inhibitor PD98059 in SUIT-2 S2-028 Pankreaskarzinomzellen in Tight Junctions rekrutiert werden kann (Hoormann, 2007).

Für die Untersuchungen wurden die vier SUIT-2 Subzelllinien SUIT-2 S2-007, SUIT-2 S2-020, SUIT-2 S2-013 und SUIT-2 S2-028 auf 8 Kammer-Objektträgern ausgesät und für 24 - 72 Stunden kultiviert. Die weitere Kultur wurde entweder nur in Nährmedium, mit DMSO (0,1%,v/v) oder in DMSO gelöstem MEK1-Inhibitor PD98059 (Endkonzentration 50 µM im Nährmedium) für 24 Stunden fortgesetzt. Anschließend erfolgte die immunfluoreszenzmikroskopische Untersuchung der Expression der Tight Junction Proteine Claudin-1, Claudin-2 und Occludin und der Tight Junction-assoziierten Proteine ZO-1 und ZO-2 sowie des Adherens Junction-Proteins E-Cadherin. Dazu wurden die Zellen auf den Objektträgern fixiert und es folgte die Immunfluoreszenzfärbung mithilfe eines spezifischen Primärantikörpers und eines fluoreszierenden Sekundärantikörpers. Das Sichtbarmachen der Zellkerne im Fluoreszenzmikroskop erfolgte mit dem DNA-spezifischen Fluoreszenzfarbstoff DAPI (4´6´-Diamidino-2-Phenylindol) (siehe Material und Methoden 2.6.8.). Die Ergebnisse sind in Abbildungen 23 bis 26 dargestellt.

In den SUIT-2 S2-007 Zellen (mittelmäßig differenziert, stark metastasierend) waren Claudin-1 und Claudin-2 immunfluoreszenzmikroskopisch in den unbehandelten Kontrollzellen nur schwach diffus zytoplasmatisch lokalisiert, nach 24-stündiger DMSO (0,1%, v/v) Behandlung zytoplasmatisch etwas stärker und auch vereinzelt fragmentär membrangebunden an Zell-Zellkontakten exprimiert nachweisbar. Nach 24-stündiger MEK-1 Inhibitorbehandlung (50 µM PD98059) wurde eine deutliche Rekrutierung von Claudin-1 und Claudin-2 in Tight Junctions verzeichnet, wobei eine Netzstruktur zur Darstellung kam. Occludin wurde in den nativen Zellen schwach zytoplasmatisch exprimiert und nach MEK-1 Inhibitorbehandlung (50 µM PD98059) vermehrt aber schwach membranassoziiert beobachtet. Das Tight Junction assoziierte Protein ZO-1, das in den unbehandelten Zellen vorwiegend schwach diffus im Zytoplasma nachweisbar war, wurde durch 24-stündige DMSO Behandlung bereits etwas vermehrt membrangebunden und nach 24-stündiger MEK-1 Inhibitorbehandlung (50 µM PD98059) deutlich wabenartig membranassoziiert exprimiert. Dagegen zeigte das Tight Junction assoziierte Protein ZO-2, das in den unbehandelten und mit DMSO behandelten Zellen nur schwach zytoplasmatisch exprimiert wurde nach MEK-1 Inhibitorbehandlung (50 µM PD98059) nur eine Zunahme der diffusen zytoplasmatischen Expression. Das Adherens Junction Protein E-Cadherin war in den nativen unbehandelten Zellen schwach zytoplasmatisch und in Vesikeln mit Aussparung des Zellkerns nachweisbar, nach MEK-1 Inhibitor Behandlung (50 µM PD98059) fragmentär membranassoziiert, möglicherweise im Bereich von Zell-Zellkontakten lokalisiert.

Zusammenfassend zeigten die SUIT-2 S2-007 Zellen nach 24–stündiger MEK-1 Inhibitorbehandlung mit 50 µM PD98059 eine Veränderung der subzellulären Lokalisation der untersuchten Tight Junction Proteine Claudin-1, Claudin-2, Occludin, sowie dem Tight Junction -assoziierten Protein ZO-1 und in geringem Ausmaß des Adherens Junction Protein E-Cadherin im Vergleich zu den nativen Tumorzellen und auch teilweise zu den DMSO-behandelten Zellen. Die Wirkung von PD98059 auf die subzelluläre Lokalisation bestand in der Rekrutierung zytoplasmatisch lokalisierter Tight Junction Proteine oder

-assoziierter Proteine in die Zell-Zellkontakte. Interessanterweise führte auch die DMSO Behandlung bereits zur diskreten Redistribution der subzellulären Lokalisation der untersuchten Proteine Claudin-1, Claudin-2 und ZO-1. Die Ergebnisse sind in Abbildung 23 dargestellt.

Abbildung 23. MEK-1 abhängige Redistribution subzellulärer Lokalisation von Tight Junction und –assoziierten sowie Adherens Junction Proteinen in SUIT-2 S2-007 Pankreaskarzinomzellen.

Immunfluoreszenzmikroskopischer Nachweis der Expression der Tight Junction Proteine Claudin-1, -2 und Occludin, der Tight Junction-assoziierten Proteine ZO-1 und ZO-2, und des Adherens Junction Proteins E-Cadherin in SUIT-2 S2-007 Zellen (mittelmäßig differenziert, stark metastasierend). (A+B) Dargestellt sind in der linken Spalte die für 24h im Nährmedium inkubierten, unbehandelten Kontrollzellen, in der Mitte die Kontrollzellen nach 24h Kultur in DMSO (0,1%, v/v), und in der rechten Spalte die 24h mit 50 µM PD98059 (in 0,1%, v/v DMSO) behandelten Zellen. (C) Die linke Spalte zeigt unbehandelte Kontrollzellen, die rechte Spalte die mit 50 µM PD98059 (in 0,1%, v/v DMSO) behandelten Zellen. DAPI, Zellkern-Färbung;

Vergrößerung: Okular 10x; Objektiv 63x.

In den SUIT-2 S2-020 Zellen (wenig differenziert und mittelmäßig metastasierend) führte die MEK-1 Inhibitorbehandlung (50 µM PD98059) von einem eher fibroblastoiden zu einem eher epitheloiden Zellbild. In den unbehandelten SUIT-2 S2-020 Zellen wurde das Tight Junction Protein Claudin-1 diffus zytoplasmatisch und vereinzelt unregelmäßig membranassoziiert exprimiert, letzteres war etwas vermehrt nach 24 Stunden DMSO Behandlung (0,1% v/v). MEK-1 Inhibitorbehandlung (50 µM PD98059) führte zur Zunahme der Claudin-1 Membranassoziation bei gleichzeitiger Abnahme der zytoplasmatischen Expression. Claudin-2 wurde in den meisten der unbehandelten Zellen sowohl im Zytoplasma als auch membranassoziiert in den Tight Junctions exprimiert, während die Membranassoziation nach 24-stündiger alleiniger DMSO Behandlung geringer war. Nach 24-24-stündiger 50 µM PD98059 Behandlung war die zytoplasmatische Claudin-2 Expression reduziert und Claudin-2 in den Zellzellkontakten vermehrt nachweisbar. Während Occludin in den unbehandelten Zellen immunfluoreszenzmikroskopisch kaum zytoplasmatisch nachweisbar war, führte die DMSO (0,1%, v/v) Behandlung zu einer Zunahme der diffusen zytoplasmatischen Occludinexpression, während die Behandlung der Zellen mit PD98059 zu einer Verlagerung der Expression in Tight Junctions führte. Während das Tight Junction-assoziierte Protein ZO-1 in unbehandelten Zellen vorwiegend schwach diffus im Zytoplasma lokalisiert war, wurde durch DMSO Behandlung ZO-1 bereits vermehrt und nach PD98059 Behandlung deutlicher membranassoziiert exprimiert. Dagegen zeigte das Tight Junction-assoziierte Protein ZO-2, das in den unbehandelten und DMSO behandelten Zellen nur schwach zytoplasmatisch exprimiert wurde nach PD98059 Behandlung nur eine Zunahme der diffusen zytoplasmatischen Expression, während DMSO zusätzlich interessanterweise zur fragmentaren Membranassoziation führte. Das Adherens Junction Protein E-Cadherin war in den unbehandelten und 24-stündig mit 50 µM PD98059 behandelten Zellen weitgehend unverändert schwach zytoplasmatisch lokalisiert, wobei die PD98059 Behandlung zu einer geringen Rekrutierung in die Zell-Zellkontakte führte.

Abbildung 24. MEK-1 abhängige Redistribution subzellulärer Lokalisation von Tight Junction und –assoziierten sowie Adherens Junction Proteinen in SUIT-2 S2-020 Pankreaskarzinomzellen.

Immunfluoreszenzmikroskopischer Nachweis der Expression der (A) Tight Junction Proteine Claudin-1, -2 und Occludin, sowie (B) der Tight Junction-assoziierten Proteine ZO-1 und ZO-2, und des Adherens Junction Proteins E-Cadherin in SUIT-2 S2-020 Zellen (wenig differenziert, mittelmäßig metastasierend). Dargestellt sind in der linken Spalte die für 24h im Nährmedium inkubierten, unbehandelten Kontrollzellen, in der Mitte die Kontrollzellen nach 24h Kultur in DMSO (0,1%, v/v), und in der rechten Spalte die 24h mit 50 µM PD98059 (in 0,1%, v/v DMSO) behandelten Zellen. DAPI, Zellkern-Färbung. Vergrößerung: Okular 10x; Objektiv 63x.

Zusammenfassend zeigten die SUIT-2 S2-020 Zellen nach 24–stündiger MEK-1 Inhibitorbehandlung mit 50 µM PD98059 eine Veränderung der subzellulären Lokalisation der untersuchten Tight Junction Proteine Claudin-1, Claudin-2, Occludin, sowie des Tight Junction-assoziierten Proteins ZO-1 und sehr vereinzelt des Adherens Junction Protein E-Cadherin im Vergleich zu den nativen Tumorzellen und teilweise den DMSO behandelten Zellen. Die Wirkung von PD98059 auf die subzelluläre Lokalisation bestand in der Rekrutierung zytoplasmatisch lokalisierter Tight Junction Proteine oder -assoziierter Proteine in die Zell-Zellkontakte. Interessanterweise führte auch die DMSO Behandlung bereits zu diskreteren Veränderungen der subzellulären Lokalisation der untersuchten Proteine Claudin-1, Claudin-2 und ZO-1, sowie zur deutlichen Rekrutierung von ZO-2 in die Membran. Die Ergebnisse sind in Abbildung 24 dargestellt.

Bei den SUIT-2 S2-013 Zellen (gut differenziert und mittelmäßig metastasierend) führte die 24-stündige MEK-1 Inhibitorbehandlung (50 µM PD98059) zu einer Veränderung des Wachstumsverhaltens im Vergleich zu den unbehandelten Zellen mit einem geordneteren Zellbild und deutlich stärkerer Ausbildung von Zell-Zelladhärenzen. In den unbehandelten und mit DMSO (0,1%, v/v) behandelten SUIT-2 S2-013 Zellen waren die Tight Junction Proteine Claudin-1 und Claudin-2 diffus zytoplasmatisch und vesikulär lokalisiert und nur gelegentlich in Tight Junctions nachweisbar. Nach 24-stündiger Behandlung mit dem MEK-1 Inhibitor PD98059 wurde Claudin-1 deutlich Tight Junction assoziiert nachweisbar. Auch Claudin-2 zeigte Rekrutierung in Tight Junctions, jedoch lediglich in einigen Zellgruppen. Das Tight Junction-Protein Occludin war in den unbehandelten und in 24-stündig mit DMSO (0,1%, v/v) behandelten Kontrollzellen weitgehend zytoplasmatisch lokalisiert, während die MEK-1 Inhibition durch 24-stündige 50 µM PD98059 Behandlung zu einer deutlichen Rekrutierung in Tight Junctions und zur Ausbildung einer Netzstruktur führte. Die Tight-Junction-assoziierten Proteine ZO-1 und ZO-2 wurden zwar bei überwiegend schwacher zytoplasmatischer Expression in den nativen Zellen und mit DMSO (0,1%, v/v) behandelten Zellen vereinzelt in Adhärenzverbindungen nachgewiesen, zeigten jedoch erst nach 24-stündiger 50 µM PD98059 Behandlung eine deutlich wabenartige Netzstruktur. Das Adherens Junction Protein E-Cadherin befand sich in den nativen Zellen in Vesikeln im Zytoplasma. Nach 24 Stunden DMSO (0,1%, v/v) Behandlung war die E-Cadherin Expression im Zytoplasma deutlich reduziert und vereinzelt im Bereich der Zellmembran nachweisbar. Nach 24-stündiger Behandlung mit 50 µM PD98059 kam es zu einer, jedoch nicht alle Zellen betreffenden deutlichen Verlagerung in die Adhärenzverbindungen mit Netzstruktur.

Abbildung 25. MEK-1 abhängige Redistribution subzellulärer Lokalisation von Tight Junction und –assoziierten sowie Adherens Junction Proteinen in SUIT-2 S2-013 Pankreaskarzinomzellen.

Immunfluoreszenzmikroskopischer Nachweis der Expression der (A) Tight Junction Proteine Claudin-1, -2 und Occludin, sowie der (B) Tight Junction-assoziierten Proteine ZO-1 und ZO-2, und des Adherens Junction Proteins E-Cadherin in SUIT-2 S2-013 Zellen (gut differenziert, mittelmäßig metastasierend). Dargestellt sind in der linken Spalte die für 24h im Nährmedium inkubierten, unbehandelten Kontrollzellen, in der Mitte die Kontrollzellen nach 24h Kultur in DMSO (0,1%, v/v), und in der rechten Spalte die 24 h mit 50 µM PD98059 (in 0,1%, v/v DMSO) behandelten Zellen. DAPI, Zellkern-Färbung; Vergrößerung: Okular 10x; Objektiv 63x.

Zusammenfassend zeigten die SUIT-2 S2-013 Zellen nach 24–stündiger MEK-1 Inhibitorbehandlung mit 50 µM PD98059 eine Rekrutierung der untersuchten Tight Junction Proteine Claudin-1, Claudin-2, Occludin, sowie der Tight Junction-assoziierten Proteine ZO-1 und ZO-2 vom Zytoplasma in die Tight Junctions. Auch wurde das Adherens Junction Protein E-Cadherin im Vergleich zu den nativen Tumorzellen in die Adhärensverbindungen rekrutiert.

Interessanterweise führte auch die DMSO Behandlung zu diskreten Veränderungen der subzellulären Lokalisation der untersuchten Proteine Claudin-1, Claudin-2, ZO-1, ZO-2 und E-Cadherin. Die Ergebnisse sind in Abbildung 25 dargestellt.

Bei den SUIT-2 S2-028 Zellen (gut differenziert, wenig metastasierend) konnte nach der MEK-1 Inhibitorbehandlung (50 µM PD98059) eine Veränderungen der Zellmorphologie und des Wachstumverhaltens beobachtet werden. Die Zellen wuchsen adhärenter und flächiger als die nativen oder die 24-stündig mit DMSO (0,1%, v/v) behandelten Kontrollzellen. In den unbehandelten SUIT-2 S2-028 Zellen wurde das Tight Junction Protein Claudin-1 in wenigen Zellen schwach zytoplasmatisch exprimiert. Nach 24 Stunden DMSO Behandlung (0,1%, v/v) wurde Claudin-1 schwach diffus in Vesikeln im Zytoplasma

Im Dokument Expression, Regulation und subzelluäre Lokalisation von Tight Junction-Komponenten in Metastasierungsmodellen humaner duktaler Pankreaskarzinomzellen (Seite 83-145)