2. M ATERIAL UND M ETHODEN
2.2. C HEMIKALIEN , E NZYME UND V ERBRAUCHSMATERIALIEN
2.2.1. Enzyme
BamH I Restriktionsendonuclease New England Biolabs, MA, USA
Benzonase Nuklease Novagen
Eco RI Restriktionsendonuclease New England Biolabs, MA, USA HindIII Restriktionsendonuclease MBI, Litauen
Klenow Boehringer, Mannheim
RNAse A Boehringer, Mannheim
Proteas Arrest Genotec, Montana, USA
Proteinase K Qiagen, Hilden
DNAse I Pharmacia, Freiburg
DNA-Ligase Gibco, Eggenstein
Superscript II Gibco, Eggenfelden
Taq-Polymerase Qiagen, Hilden
2.2.2. Sequenzierung und Polymerase-Kettenreaktion
DNA-Sequencing Kit ABI PRISM, Warrington, UK
dNTP Mix MBI, Litauen
MgCl-Puffer 10fach Qiagen, Hilden
Oligonukleotide MWG-Biotech, München
Oligonukleotide Metabion, Martinsried
Q-Puffer Qiagen, Hilden
5fach First Strand Puffer Gibco, Eggenstein
DTT Gibco, Eggenstein
Oligo(dT)12-18 Primer Gibco, Eggenstein 2.2.3. Elektrophorese
Acrylamidlösung Roth, Karlsruhe
Agarose Sigma, München
Agarose Promega WI, USA
APS (Ammoniumpersulfat) BioRad, München
Ethidiumbromid Sigma, München
Nitrozellulose-Membran Schleicher & Schüll, Dassel
Harnstoff Merck, Darmstadt
Marker III MBI, Litauen
Marker VIII MBI, Litauen
MOPS Sigma, München
Loading Dye MBI, Litauen
Protein Marker, Broad Range NEB, New England, USA
TEMED Sigma, München
2.2.4. Chemikalien und Puffer
BIO RAD-Reagenz BIO RAD Laboratories Kalifornien, USA
Borsäure Merck, Darmstadt
Bromphenolblau Sigma, München
BSA Sigma, München
DAPI Sigma, München
DEPC Sigma, München
Digitonin Merck, Darmstadt
DTT Sigma, München
ECL Ammersham, Freiburg
EDTA Roth, Karlsruhe
EGTA Serva, Heidelberg
Eisessig Sigma, München
Essigsäure Sigma, München
Ethanol Riedel de Haehn AG, Seelze
Formaldehyd Sigma, München
Formamid Sigma, München
Glycerin Sigma, München
HCl Merck, Darmstadt
Isopropanol Sigma, München
Magnesium-Chlorid Sigma, München
Methylenblau Sigma, München
Milchpulver Difco, Detroit, USA
MOPS Sigma, München
Natrium-Acetat Merck, Darmstadt
Natrium-Chlorid Merck, Darmstadt
Natrium-Citrat Merck, Darmstadt
Natrium-Bisulfat Sigma, München
NEB 2-Puffer New England Biolabs, MA, USA
NP-40 Calbiochem, Kalifornien, USA
PCI Biomol, Hamburg
PMSF Sigma, München
Protein Assey Bio-Rad, München
RNA Clean AGS, Heidelberg
SDS Serva, Heidelberg
SlimFast Schokolade Slim-Fast Food Company, Florida, USA
Tris-Base USB, Cleveland, USA
Tris/HCl Sigma, München
Tween 20 Fluka, Neu-Ulm
2.2.5. Radioaktive Substanzen
α[32P]dCTP (5.000 Ci/mol, 10 mCi/ml) Amersham, Braunschweig 2.2.6. Antikörper
Primärantikörper
Anti-Claudin-1
polyklonal Kaninchen IgG Zymed, Kalofornien USA Anti-Claudin-2
polyklonal Kaninchen IgG Zymed, Kalifornien, USA Anti-Claudin-4
monoklonal Maus IgG Zymed, Kalifornien, USA
Anti-Claudin-5
polyklonal Kaninchen IgG Zymed, Kalifornien, USA Anti-Occludin
polyklonal Kaninchen IgG Santa Cruz, Kalifornien, USA Anti-ZO-1
polyklonal Kaninchen IgG, Santa Cruz, Kalifornien, USA Anti ZO-2
polyklonal Ziege IgG, Santa Cruz, Kalifornien, USA Anti E-Cadherin
polyklonal Ziege IgG, Santa Cruz, Kalifornien, USA Anti-actin HRP-konjugiert
polyklonal Ziege IgG Santa Cruz, Kalifornien, USA Anti-His(C-term)-FITC-konjugiert
monoklonal Maus IgG Invitrogen, Karlsruhe Anti-myc-FITC-konjugiert
monoklonal Maus IgG Invitrogen, Karlsruhe Sekundärantikörper:
Esel anti Kaninchen, FITC-konjugiert Santa Cruz, Kalifornien, USA Esel anti Maus, FITC-konjugiert Santa Cruz, Kalifornien, USA Esel anti Ziege, FITC-konjugiert Santa Cruz, Kalifornien, USA Ziege anti Kaninchen, HRP-konjugiert Cell Signaling, MA, USA Pferd anti Maus, HRP-konjugiert Cell Signaling, MA, USA Esel anti Ziege, HRP-konjugiert Santa Cruz, Kalifornien, USA
2.2.7. Bakterienkultur
Agar Gibco, Eggenstein
Ampicillin Sigma, München
Glycerol Sigma, München
Hefeextrakt Difco, Detroit, USA
Natriumchlorid Roth, Karlsruhe
Trypton Difco, Detroit, USA
2.2.8. Zellkultur
5-Aza-2´-Deoxycytidin Sigma, München
DMSO Sigma, München
Feuchte Kammer Eigenkonstruktion
Fötales Kälberserum PAA GmbH, Linz, Österreich Gewebekulturflaschen und -schalen Greiner, Frickenhausen
HEPES Puffer Gibco, Eggenstein
Lab-Tec Chamber-slides Nalge Nunc, Illinoi, USA
Lipofektamin Invitrogen, Karlsruhe
Medium (RPMI, DMEM) Gibco, Eggenstein PD98059 (MEK1 Inhibitor) Cell Signaling, MA, USA Penicillin-Streptomycin Gibco, Eggenstein
Pferdeserum PAA GmbH, Linz, Österreich
Plus Reagenz Invitrogen, Karlsruhe
Trypsin-EDTA Gibco, Eggenstein
2.2.8.1. Pankreastumorzelllinien
Die duktalen Pankreaskarzinomzelllinien AsPC-1, Capan-2, MIAPaCa-2 und Panc-1 wurden von der American Type Culture Collection (Rockville, MD) bezogen, die Zelllinien PC-2, PC-3 und PC-44 waren von M.Bülow, Mainz freundlicherweise zur Verfügung gestellt, während PaTu 8902, PaTu8988S, PaTu8988T, HPAF und PaTu-II von H. Kern, Marburg zur Verfügung standen (Metzgar et al, 1982; Kim et al, 1989; Elsässer et al, 1992). Die duktalen Pankreaskarzinom SUIT-2 Subklone (SUIT-2 S2-007, SUIT-2 S2-013, SUIT-2
S2-020 und SUIT-2 S2-028) wurden von Iwamura, Miyazaki, Japan (Iwamura et al.,1987) zur Verfügung gestellt. Die neuroendokrinen Pankreastumorzelllinien BON I und QGP-1 wurden über Stefan Rosevicz, Berlin bezogen (Evers et al, 1992).
2.2.9. Verbrauchsmaterialien
Ambion DECAprimeII-Kit Ambion, Texas, USA
Flouprep Bio Mérieux, Marcy l´Etoile, Frankreich
Gel-Blotting-Papier Schleicher & Schüll Hybond-Nylon-Membran Amersham, Braunschweig Kodak Ektachrome 64T Filme Kodak, New York State, USA Liqud Blocker Super Pap Pen Daido Sangyo, Tokio, Japan Multiple Tissue Expression Array Clontech, Kalifornien, USA
Nitrocelulose-Membran Schleicher & Schuell, Dassel Nucleobond PC 500-Kit Marchery-Nagel, Düren
Nucleospin Plasmid-Kit Marchery-Nagel, Düren
Pipettenspitzen Eppendorf, Hamburg
Polypropylenröhrchen (15, 50 ml) Greiner, Frickenhausen QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen, Hilden
Quarzküvetten Hellma, MühlheimBaden
Reaktionsgefäße (0,5, 1,5, 2,0 ml) Eppendorf, Hamburg
Röntgenfilme Kodak, New York State, USA Whatmanpapier Whatman, Maidstone,
Großbritannien
2.2.10. Plasmide und kompetente Zellen
ElektroMAX E.coli DH10 B Gibco, Eggenstein PcDNA 3.1/V5 TOPO TA Expression Kit Invitrogen, Karlsruhe PcDNA/TO/myc-His Typ A Invitrogen, Karlsruhe
2.2.11. Oligonukleotide
Tabelle 1: In der PCR und RT-PCR eingesetzte Primer Name Primer Genbank
accession number
Exon Sequenz
Fragment-größe
ß-Aktin f NM_001101 3 5`-ATC TGG CAC CAC ACC TTC TAC AAT GAG CTG CG-3`
838 bp
ß-Aktin r NM_001101 6 5`-CGT CAT ACT CCT GCT TGC TGA TCC ACA TCT GC-3`
Claudin1f XM_036434 1 5`-ATG GAT CGG CGC CAT CGT CAG-3´
265 bp
Claudin1r 3 5´-AGT GAA GAG AGC CTG AC-3´
T47-5´-Oligo (Claudin-2)
XM_010309 5´-ATG GCC TCT CTT GGC CTC CAA CTT-3`
693 bp
T47genR (Claudin-2)
5´-AGT GGA GTC AGA GTC CGC TG-3´
Claudin3f NM_001306 1 5´-CAG CAA CAT CAT CAC GTC GCA G-3´
555 bp
Claudin3r 1 5´-TAG ACG TAG TCC TTG CGG TCG TAG-3´
Claudin4f NM_001305 1 5´-GAT GAA CTG CGT GGT GCA GAG CAC-3´
477 bp
Claudin4r 1 5´-TAC ACG TAG TTG CTG GCA GC-3´
Claudin5f XM_009839 1 5´-TGC GCG TCT CGC CTC TAG CCA TG-3´
474 bp
Claudin5r 1 5´-TCA GAC GTA GTT CTT CTT GTC G-3´
Name Primer Genbank accession
number
Exon Sequenz
Fragment-größe
Claudin7f XM_008338 1 5`-AGT GGC AGA TGA GCT CCT ATG CG-3`
357 bp
Claudin7r 3 5`-AGT CTG TGA CAA TCT GAT G-3`
Claudin7f XM_008338 1 5`-AGT GGC AGA TGA GCT CCT ATG CG-3`
257 bp
Claudin-7 r 769
2 5`-CTT CAC TTT GTC GTC TCC-3`
Claudin- 7 Exon 2 f
XM_008338 2 5´-CAT GAA GTG CAC GCG CTG TG-3`
141 bp
Claudin7r 3 5`-AGT CTG TGA CAA TCT GAT G-3`
Claudin7 HindIII f
XM_008338 1 5´-GAT GCT TGA TAT GGC CAA TTC GGG CCT GCA G-3`
636bp
Claudin7 EcoRI r
4 5`- GAT CGA ATT CCA CAT ACT CCT TGG AAG AG-3´
Claudin7 EcoRI f
XM_008338 1 5´-GAT CGA ATT CGA TAT GGC CAA TTC GGG CCT GCA G-3`
636 bp
Claudin7 HindIII r
4 5´- GAT CAA GCT TCA CAT ACT CCT TGG AAG AG-3`
Claudin12f XM_004591 1 5´-ATG TCC ACG CAG CCA CAG TC-3´
522 bp
Claudin12r 1 5´-TAG TGA CAT ACA CTG CAT AGT C- 3´
Claudin14f XM_009753 2 5´-GAG TGT GTG TGG CAC AGC AC- 3´
564 bp
Name Primer Genbank accession
number
Exon Sequenz
Fragment-größe
Claudin14r 2 5´-TCA CAC GTA GTC GTT CAG CCT GTA C- 3´
Claudin17f XM_012979 1 5´-CTC AGT GGA GAG TAT CAG C- 3´
524 bp
Claudin17r 1 5´-GTA GCC AGG CAC TGG ATA TCT GTA C- 3´