Beurteilung der Entwicklungskompetenz boviner Oozyten aus Follikeln mit unterschiedlicher Durchblutung der Follikelwand

Beurteilung der Entwicklungskompetenz boviner Oozyten aus Follikeln mit unterschiedlicher

Durchblutung der Follikelwand

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN

- Doctor medicinae veterinariae - ( Dr. med. vet. )

vorgelegt von Ana Hanstedt

Lüneburg

Klinik für Rinder)

1. Gutachterin: Prof. Dr. med. vet. C. Wrenzycki

2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. S. Meinecke-Tillmann

Tag der mündlichen Prüfung: 06. November 2009

Meinen Eltern

und meiner Oma

1 Einleitung...1

2 Literatur...4

2.1 Physiologische Grundlagen...4

2.1.1 Der Zyklus des Rindes...4

2.1.2 Die Oogenese ...6

2.1.2.1 Präpuberale Entwicklung von Eizellen ... 6

2.1.2.2 Postpuberale Entwicklung von Eizellen... 7

2.1.3 Die Follikulogenese...8

2.1.3.1 Allgemeine Follikulogenese... 8

2.1.3.2 Follikuläre Gefäßentwicklung ... 13

2.1.3.3 Follikelflüssigkeit ... 16

2.1.3.3.1 Steroidhormone in der Follikelflüssigkeit ...17

2.1.3.3.1.1 Östradiolgehalt in der Follikelflüssigkeit ... 21

2.1.3.3.1.2 Progesterongehalt in der Follikelflüssigkeit... 22

2.1.4 Die frühe Embryonalentwicklung ...24

2.1.5 Expression von mRNA in Oozyten und Embryonen...26

2.1.5.1 Messenger RNA-Expression spezifischer entwicklungsrelevanter Gene in Oozyten und Embryonen... 27

2.1.5.1.1 Heat shock protein70...27

2.1.5.1.2 Zygote arrest gene1 ...30

2.1.5.1.3 Growth and differentiation factor9...30

2.1.5.1.4 Bone morphogenic protein15 ...32

2.1.5.1.5 Glukose-Transporter...34

2.1.5.1.5.1 Glukose-Transporter1 ... 35

2.1.5.1.5.2 Glukose-Transporter3 ... 36

2.1.5.1.6 Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase ...37

2.1.5.1.7 DNA-Methyltransferasen ...40

2.1.5.1.7.1 DNA-Methyltransferase1... 40

2.1.5.1.7.2 DNA-Methyltransferase3... 42

2.1.5.1.8 Histon-Deacetylase2 ...43

2.1.5.1.9 Desmocollin2 ...44

2.2 Gewinnung von KOK für den Embryotransfer durch die transvaginale

ultraschallgeleitete Punktion von Follikeln ...46

2.2.1 Die Entwicklung des OPU...46

2.2.2 OPU im Vergleich zu anderen Methoden der Eizellgewinnung bzw. Embryonenproduktion beim Rind...47

2.2.2.1 Vergleich mit der Gewinnung von KOK aus Ovarien vom Schlachthof ... 48

2.2.2.2 Vergleich mit der Superovulation und Insemination mit anschließender Spülung des Uterus... 48

2.2.3 Einflussfaktoren auf die Ergebnisse des OPU ...50

2.2.4 Vergleich unterschiedlicher Zeitintervalle zwischen den OPU-Sitzungen ...50

2.2.4.1 Einfluss des Punktionsintervalls der OPU-Sitzungen auf die Zahl der gewonnenen KOK ... 51

2.2.4.2 Einfluss des Punktionsintervalls der OPU-Sitzungen auf die Qualität der gewonnenen KOK ... 52

2.2.5 Auswirkungen des OPU auf die Spendertiere...53

2.2.6 Auswirkungen der IVP auf das entstehende Individuum...54

2.3 Entwicklungskompetenz von KOK...57

2.3.1 Einflussfaktoren auf die Entwicklungskompetenz von Eizellen ...57

2.3.2 Parameter zur Einordnung der Entwicklungskompetenz ...60

2.4 Untersuchungen zur perifollikulären Durchblutung im Zusammenhang mit der Fertilität ...62

2.4.1 Untersuchungen am Menschen ...62

2.4.2 Untersuchungen am Pferd ...64

2.4.3 Untersuchungen am Rind ...64

3 Material und Methoden ...65

3.1 Gewinnung von bovinen Oozyten und Follikelflüssigkeit ...65

3.1.1 Tiermaterial...65

3.1.2 Ovum pick up ...65

3.1.3 Separation, Klassifizierung der gewonnenen Kumulus-Oozyten- Komplexe und Vorbereitung der Eizellen für die mRNA-Analsye ...73

3.2 Durchführung der IVP...77

3.2.1 In-vitro-Maturation...77

3.2.2 In-vitro-Fertilisation ...79

3.2.3 In-vitro-Kultivierung ...80

3.2.4 Auswertung der Teilungs- und Entwicklungsraten ...81

3.2.5 Vorbereitung der Blastozysten für die mRNA-Analyse...82

3.3 MessengerRNA-Analyse ...82

3.3.1 Aufbereitung der Proben...82

3.3.1.1 Prewash der Dynabead-Lösung... 82

3.3.1.2 Zelllyse und Extraktion der mRNA mit Hilfe der Dynabeads ... 83

3.3.2 Herstellung komplementärer DNA (cDNA) mittels reverser Transkriptase...84

3.3.3 Durchführung der quantitativen PCR ...85

3.4 Ermittlung der Konzentration von 17ß-Östradiol und Progesteron in der Follikelflüssigkeit ...88

3.4.1 Bestimmung der Progesteronkonzentration per ELISA...88

3.4.2 Bestimmung der 17ß-Östradiol-Konzentration mittels Radioimmunoassay ...90

3.5 Versuchsaufbau ...91

3.5.1 Allgemeiner Versuchsaufbau ...91

3.5.2 Versuchsanordnung...91

3.5.2.1 Etablierung von OPU und anschließender IVP ... 91

3.5.2.2 Durchführung des Hauptversuchs... 92

3.6 Statistische Auswertungen ...93

4 Ergebnisse...94

4.1.1 Ergebnisse aus dem OPU ...94

4.1.1.1 Ergebnisse zu den punktierten Follikeln... 94

4.1.1.1.1 Ergebnisse mit Fokus auf das Punktionsintervall zwischen den OPU- Sitzungen ...95

4.1.1.1.2 Ergebnisse mit Fokus auf den Durchblutungsstatus der Follikel ...98

4.1.1.1.3 Ergebnisse bezogen auf das Punktionsintervall der OPU-Sitzungen und den Durchblutungsstatus der Follikel...99

4.1.1.2 Ergebnisse zu den gewonnenen KOK ... 100

4.1.2 Ergebnisse aus der IVP ...103

4.1.3 Ergebnisse aus der Analyse der mRNA-Expression verschiedener Gene....105

4.1.3.1 Analyse der unreifen Eizellen... 105

4.1.3.2 Analyse der Blastozysten ... 112

4.1.4 Ergebnisse aus der Analyse der Steroidhormongehalte in der Follikelflüssigkeit ...114

5 Diskussion ...116

5.1 OPU ...116

5.2 IVP ...123

5.3 Messenger RNA-Expressionsmuster ...124

5.4 Follikelflüssigkeit ...130

6 Zusammenfassung...133

7 Summary...136

8 Literaturverzeichnis ...139

9 Verzeichnis der Medien und Einzeldaten ...166

9.1 Eingesetzte Medien ...166

9.1.1 Medien für das OPU ...166

9.1.2 Medien für die IVP ...167

9.1.3 Medien für die RT-PCR...172

9.1.4 Medien für den ELISA...176

9.2 Einstellungen des Ultraschallgerätes ...178

9.3 Einzeldaten aus dem Versuchsteil ...179

9.3.1 Einzeldaten aus dem OPU...179

9.3.2 Einzeldaten aus der Bestimmung der Steroidhormongehalte in der Follikelflüssigkeit ...180

9.3.3 Einzeldaten aus der RT-PCR...183

9.3.3.1 Übersicht über die mRNA-Gehalte in den untersuchten unreifen Oozyten... 183

9.3.3.2 Übersicht über die mRNA-Gehalte in den untersuchten Blastozysten ... 184

11 Verzeichnis der Abbildungen...189 12 Verzeichnis der Tabellen ...192 Danksagung

1 Einleitung

Die ursprünglich für die assistierten Reproduktionstechniken (ART) beim Menschen entwickelte ultraschallgeleitete transvaginale Follikelpunktion (Ovum pick up, OPU) wurde im Jahr 1988 erstmals für die Reproduktion beim Rind eingesetzt (PIETERSE et al. 1988). Wie bereits im Jahr 1991 vorausgesagt (KRUIP et al. 1991), ist das OPU mittlerweile zum festen Bestandteil der Reproduktionstechniken des Rindes geworden.

Das OPU wird von manchen Autoren in Kombination mit der IVP (In-vitro-Produktion) als die Methode der Wahl zur Embryonenproduktion bei großen Tieren angesehen (GALLI et al. 2001), dennoch gibt es Forderungen nach Weiterentwicklungen dieser Technik. Die Effizienz der Embryonenproduktion durch das OPU und die IVP in Bezug darauf, wie viele Eizellen für die Erzeugung eines Embryos gebraucht werden, wird als weit entfernt vom Optimum angesehen (VAN DE LEEMPUT et al. 1999).

Weiterhin wird eine Verbesserung bezüglich zeitlicher und finanzieller Effizienz (MERTON et al. 2003), sowie in Bezug auf die abnormen Trächtigkeiten und Kälber (VAN WAGTENDONK-DE LEEUW 2005) gefordert. Auch die Trächtigkeitsraten nach Transfer von IVP-Embryonen im Vergleich zu denen der in vivo generierten Embryonen aus Superovulation, Besamung und Uterusspülung (multiple ovulation and embryo transfer, MOET) sind verringert (MERTON et al. 2003).

Als Basis für eine erfolgreiche Nutzung der In-vitro-Techniken wird primär die Zugriffsmöglichkeit auf eine Population kompetenter unreifer Eizellen gesehen (MADISON et al. 1992). Demnach sind Ansätze zur Verbesserung der Entwicklungskompetenz der Eizelle eher durch Forschung mit Fokus auf die Eizelle zu erreichen, denn mit Fokus auf die Entwicklung der Eizelle zur Blastozyste (LONERGAN et al. 2003b). Diese steigende Gewissheit, dass die Eizellqualität grundlegend die Fertilisation und die weitere embryonale Entwicklung beeinflusst, führt zur anhaltenden Suche nach verlässlichen Indikatoren für die Entwicklungskompetenz der Eizelle (WANG u. SUN 2007).

Es bedarf eines Parameters für entwicklungskompetente Eizellen, der über eine einfache, nicht invasive Methode bestimmt werden kann (LONERGAN et al. 1994;

VASSENA et al. 2003a). Eine nicht invasive oder zumindest nicht zerstörende Methode zur Voraussage der Entwicklungskompetenz wäre von unschätzbarem Wert sowohl für die ART in der Humanmedizin als auch für die Nutztierproduktion und die Wissenschaft (PFEFFER et al. 2007). Ein Ansatz für die Suche nach solch einem Parameter ist es, die Veränderungen am Follikel näher zu betrachten, da sich Follikel(-zellen) und Eizelle gegenseitig beeinflussen (EPPIG 2001). Die Fähigkeit der Eizelle, ihre Umgebung über oozyten-sezernierte Faktoren zu beeinflussen, wird sogar als ein Teil ihrer Entwicklungskompetenz angesehen (GILCHRIST u.

THOMPSON 2007). Somit könnten Untersuchungen der Veränderungen in Follikeln auf molekularer Ebene dazu dienen, die Differenzierungsprozesse zu verstehen, die zu einer erhöhten Entwicklungskompetenz der Eizelle führen (SIRARD et al. 2006).

Zunächst wären invasive Techniken zur Feststellung der Entwicklungskompetenz heranzuziehen, um objektive Kriterien für die Oozytenqualität zu finden (COTICCHIO et al. 2004). Anschließend müsste eine Korrelation zwischen invasiven und nicht invasiven Markern für die Qualität ermittelt werden, um invasive und damit destruktive Prozesse zu umgehen (ANGUITA et al. 2007). Ein nicht invasiver Parameter, um gesunde Follikel zu identifizieren wäre beispielsweise die per Ultraschall festgestellte Durchblutung der Follikelwand (ACOSTA et al. 2003).

In der Humanmedizin wurden bereits Studien durchgeführt, in denen sich die Autoren mit der Follikelwanddurchblutung beschäftigt haben. Es konnte festgestellt werden, dass stark durchblutete Follikel mit einer erhöhten Schwangerschaftsrate nach Superstimulation, OPU und IVF assoziiert sind (CHUI et al. 1997). Das führte zu der Idee, die perifollikuläre Durchblutung als einen Indikator für eine erfolgreiche Schwangerschaftstherapie zu nutzen. Entsprechende Ergebnisse konnten mit signifikanten Unterschieden durch weitere Forschergruppen reproduziert werden (BORINI et al. 2001; BORINI et al. 2004; KIM et al. 2004). Es wurde schlussgefolgert, dass sowohl qualitative als auch quantitative Messungen des follikulären Blutflusses zur Vorhersage von Schwangerschaften nach Superstimulation, OPU und IVF bei der Frau genutzt werden können (COULAM et al.

1999). Für den klinischen Einsatz hingegen, wird die follikuläre Durchblutung zur

Vorhersage erfolgreicher IVF-Zyklen bei jungen infertilen Frauen als nicht geeignet angesehen (PALOMBA et al. 2006).

Ziel dieser Untersuchung war es, zu überprüfen, ob der nicht invasiv per Ultraschall gemessene qualitative Blutfluss in der Wand von Follikeln beim Rind sich als Parameter eignet, um auf eine erhöhte Entwicklungskompetenz der sich in diesen Follikeln befindlichen Eizellen zu selektieren. Die Entwicklungskompetenz wurde auf der Basis der Entwicklungsraten und des Gehaltes an messenger-RNA (mRNA) verschiedener, entwicklungsrelevanter Gene in den Eizellen und Embryonen bestimmt. Weiterhin fand eine Bestimmung der Gehalte von 17ß-Östradiol (E2) und Progesteron (P4) in der Follikelflüssigkeit statt, um den Zustand des Follikels zu ermitteln.

Die Tatsache der bei Mensch und Rind ähnlich ablaufenden Follikelentwicklung in 2-3 Follikelwellen im Zyklus (BAERWALD et al. 2003) und den Ähnlichkeiten in der präimplantatorischen Entwicklung (MENEZO u. HERUBEL 2002) nährt die Annahme, das Rind sei ein geeignetes Modell für die präimplantatorische Entwicklung des Menschen (WRENZYCKI et al. 2007). Dies und die Untersuchungen auf der Eizell- und Embryonalebene – welche in den humanmedizinischen Studien nicht möglich sind – könnten damit neben der Nutzbarkeit für die Rinderzucht auch eine Ergänzung zu den Studien in der Humanmedizin darstellen.

2 Literatur

2.1 Physiologische Grundlagen

2.1.1 Der Zyklus des Rindes

Die im Literaturteil zitierten Untersuchungen beziehen sich teilweise auf unterschiedlich definierte Zyklen: dem ovariellen und dem Brunstzyklus.

Der Brunstzyklus definiert seinen Anfang und sein Ende mit der Brunst des Tieres, während der ovarielle Zyklus mit der Ovulation beginnt und endet. Letzterer besteht beim Rind aus zwei bis drei Follikelwellen (siehe Abbildung 1).(ADAMS et al . 2008)

Abbildung 1 : Der Verlauf eines Zyklus mit zwei Follikelwellen (modifiziert nach ADAMS et al. 2008)

Zu Beginn jeder Follikelwelle kommt es zu einem Anstieg in der Konzentration von Follikel stimulierendem Hormon (FSH) im Blutserum (ADAMS et al. 1992). Dieser Anstieg ist der Auslöser für das Wachstum einer neuen Kohorte von Folllikeln Wachstumsmuster von Follikeln (CHAPPEL u. SELKER 1979). An Tag 3 des Brunstzyklus erreicht der größte Follikel der so genannten Kohorte einer Follikelwelle

wächst der größte Follikel in stärkerem Maße als die restlichen Follikel der Kohorte (GINTHER et al. 1996). Er wird als dominanter Follikel (DF) bezeichnet, da er seine Begleitfollikel in der Gruppe bzw. Kohorte in ihrer weiteren Entwicklung negativ beeinträchtigt (BAIRD u. MCNEILLY 1981; BAIRD 1983). Letztere werden auf Grund dieser Beeinträchtigung subordinate Follikel genannt.

Welche Faktoren einen Follikel dominant werden und andere zu Grunde gehen lassen, ist bisher noch nicht abschließend geklärt. Es wurden verschiedene Hypothesen aufgestellt, auf die im Kapitel 2.1.3 zur Follikulogenese näher eingegangen wird.

Der DF der ersten Welle verliert in einem Zyklus mit 2 Follikelwellen am 10. Tag des Brunstzyklus seine funktionelle Dominanz, wonach eine neue Follikelwelle beginnt (SUNDERLAND et al. 1994). Unter dem Einfluss der P4-Produktion des Gelbkörpers (Corpus luteum, Cl) fällt er wie die subordinaten Follikel der Atresie anheim (MEINECKE 2000).

Bei lutealer Regression wie am Ende des Zyklus und unter Ausschüttung von luteinisierendem Hormon (LH) kommt es zur Ovulation des DF, wobei dieser größer als sein(e) Vorgänger im selbem Zyklus ist (SAVIO et al. 1988).

2.1.2 Die Oogenese

Die Oogenese oder Eizellentwicklung findet sowohl präpuberal, also vor Erreichen der Geschlechtsreife, als auch postpuberal statt.

Einen Überblick über die Oogenese zeigt Abbildung 2:

Abbildung 2: Die Oogenese (SCHNORR u. KRESSIN 2001)

2.1.2.1 Präpuberale Entwicklung von Eizellen

Die Primordial- oder Urkeimzellen sind bereits früh in der Embryogenese als solche determiniert. Sie bewegen sich im Lauf der embryonalen Entwicklung sowohl passiv durch die Embryonalfaltung als auch aktiv in amöboider Form in Richtung der Keimdrüsenanlage. Die Vermehrung der Urkeimzellen wird beim Rind bereits pränatal beendet. In der präpuberalen Wachstumsperiode differenzieren sich die so genannten Oogonien zu primären Oozyten, welche in der Prophase der Meiose arretieren.

2.1.2.2 Postpuberale Entwicklung von Eizellen

Mit Beginn der Geschlechtsreife findet im Zusammenhang mit der Follikulogenese die weitere Entwicklung der Eizellen statt (SCHNORR u. KRESSIN 2001).

Da die Granulosa- und Kumuluszellen die primären Vermittler für das follikuläre Mikromilieu und die maternalen Signale sind, werden sie als verantwortlich für die Unterstützung des Eizellwachstums, der Entwicklung und dem allmählichen Erreichen der Entwicklungskompetenz der Eizelle betrachtet (GILCHRIST et al.

2008).

Als grundlegend für die Entwicklungskompetenz der Eizelle wird ihre Fähigkeit, durch die Sekretion von parakrin wirkenden Faktoren die Funktion der Kumuluszellen zu dirigieren, angesehen (HUSSEIN et al. 2006; GILCHRIST u. THOMPSON 2007).

Hat die Eizelle im Primordialfollikel noch einen Durchmesser von ca. 30 µm, so erreicht sie im 3 mm großen Tertiärfollikel einen Durchmesser von ca. 120 µm (FAIR et al. 1995; HYTTEL et al. 1997).

Die Transkription in den Eizellen findet bis zu einem Durchmesser von ca. 110 µm statt. Ab 110 µm wird die transkriptionelle Aktivität eingestellt (FAIR et al. 1995).

Daher müssen die Veränderungen der Proteinsynthese, die zu dieser Zeit stattfinden, weitgehend abhängig von maternalen Komponenten sein, die während des Eizellwachstums bis zur Auflösung der Kernmembran (germinal vesical break down = GVBD) angesammelt wurden (PAYNTON et al. 1988). Weiterhin erstaunt es nicht, dass sie daher ab einer solchen Größe (von 100-110 µm) graduell die Fähigkeit zur meiotischen Reifung und embryonalen Entwicklung erwerben (HYTTEL et al. 1996).

Im DF finden in der Eizelle ultrastrukturelle Veränderungen statt, sie erreicht die volle Entwicklungskompetenz in einem Prozess, der als Kapazitation bezeichnet wird (HYTTEL et al. 1997).

Ein Überblick über das Schicksal der Oozyten bezogen auf das gesamte Leben beim Menschen ist in Abbildung 3 (VASKIVUO 2002) dargestellt:

Abbildung 3: Überblick über das Schicksal von Oozyten beim Menschen (VASKUVIO 2002)

2.1.3 Die Follikulogenese

2.1.3.1 Allgemeine Follikulogenese

Als Ovarfollikel (im weiteren „Follikel“ genannt) wird die funktionelle Einheit aus der Oozyte und den sie umgebenden Schichten somatischer Zellen bezeichnet (KNIGHT u. GLISTER 2006).

Die Follikulogenese ist der Entwicklungsprozess, in dem sich ein präovulatorischer Follikel aus einem Pool von Primordialfollikeln entwickelt (SPICER u.

ECHTERNKAMP 1986). Diese Entwicklung geht mit der Differenzierung der Eizelle und der sie umgebenden Zellen einher.

In Abbildung 4 ist die Follikulogenese beispielhaft am Rinderovar im Diöstrus dargestellt. Nicht abgebildet auf Grund des Zyklusstadiums ist der frisch ovulierte

Abbildung 4: Schematische Darstellung der Funktionsgebilde im Ovar des Rindes im Stadium des Diöstrus

(RÜSSE u. SINOWATZ 1998)(RÜSSE u. SINO WATZ 1998)

1= Primordialfollikel, 2= Primärfollikel, 3= junger Sekundärfollikel, 4= reifer Sekundärfollikel, 5= Antrumbildung im jungen Tertiärfollikel, 6= großer Tertiärfollikel, 7= Cumulus oophorus, 8= Eizelle, 9= Follikelzellen, 10= Theka folliculi, 11= atretischer Follikel, 12= Corpus luteum

im Blütestadium, 13= Arteria ovarica, 14= Vena ovarica, 15= Lymphgefäße, 16= Nervenfasern des vegetativen Nervensystems

Je nach Erscheinungsbild werden verschiedene Follikelstadien unterschieden. Der Primordialfollikel ist das erste Stadium in der Follikelentwicklung. Er entsteht beim Rind bereits pränatal und besteht aus der Oozyte und dem sie umgebenden

Im Primärfollikel ist das Wachstum der Eizelle bereits aktiviert, das Follikelepithel hat eine isoprismatische Form (RÜSSE u. SINOWATZ 1998).

Der Sekundärfollikel besteht aus der Eizelle und der sie umgebenden Zona pellucida.

Die die Zona pellucida umgebende Zellschicht ist nun kubisch und mehrschichtig und wird als Stratum granulosum oder Granulosazellschicht bezeichnet. Darauf folgt zentrifugal eine Basalmembran und eine zweischichtige Theka folliculi oder Thekazellschicht. Diese wird unterteilt in die Theca interna, die vornehmlich aus Kapillarnetzen und epitheloiden Zellen besteht und die Theca externa, die sich aus kollagenen Fasern und Stromafibrozyten aufbaut (RÜSSE u. SINOWATZ 1998).

Der Tertiärfollikel zeichnet sich durch die Follikelhöhle aus, die durch Granulosazellsekretion entsteht. Die Eizelle befindet sich in der Follikelhöhle randständig und ist ferner von (Kumulus-) Zellen des so genannten Cumulus oophorus oder Eihügels umgeben. Die zunächst breitflächige Verbindung des Cumulus oophorus zur Follikelwand wird zur Ovulation hin bis auf einen dünnen Stiel reduziert (SCHNORR u. KRESSIN 2001).

Frühe Stadien des Follikelwachstums werden reguliert von intrafollikulären [z.B. FSH (follikelstimulierendes Hormon) und Östrogene] und ovariellen Faktoren (BODENSTEINER et al. 1999).

Es wird grundsätzlich davon ausgegangen, dass alle wachsenden und gesunden Follikel die theoretische Fähigkeit besitzen, dominant zu werden (GINTHER et al.

1996). Die Follikel jedoch, die die kompetente Phase passieren, ohne dabei eine Stimulation zu erfahren, werden atretisch und durch eine Serie kleiner Follikel ersetzt (MARION et al. 1968).

Der spätere DF befindet sich wahrscheinlich durch seine Größe oder vermehrte Blutversorgung im Vorteil gegenüber den anderen Follikeln und kann vermutlich besser auf den Anstieg von FSH im Blut mit erhöhter E2-Produktion reagieren.

Anerkannt ist die Hypothese, dass E2 sich negativ auf die FSH-Konzentration im Blut auswirkt (GINTHER et al. 1996) und dass die erhöhte E2-Produktion des DF die zunächst erhöhte Konzentration an FSH im Blut auf ein basales Niveau zurückgeführt (FORTUNE et al. 2001).

Aufzufinden per Ultraschall ist der spätere DF bereits mit einer Größe von 1 mm und 6-12 Stunden vor den später subordinaten Follikel der gleichen Welle (JAISWAL et al. 2004). Er ist meist schon nach Tag 2 des Ovarzyklus der größte Follikel (SUNDERLAND et al. 1994) und besitzt durchschnittlich an Tag 2,8 eine Größe von 8,5 mm (GINTHER et al. 1996). Die subordinaten Follikel erreichen ihre maximale Größe von 6-8 mm an Tag drei bis vier des Ovarzyklus, erhalten sie noch für ca. drei Tage und verkleinern sich danach wieder (ASSEY et al. 1994).

Das Größenwachstum des DF der 1. Follikelwelle ist ab dem zweiten Tag des Ovarzyklus und der Stillstand des Wachstums an Tag 10 mit der Konzentration von E2 in der Follikelflüssigkeit assoziiert (BODENSTEINER et al. 1996). Teilweise konnte die gesteigerte Fähigkeit zur E2-Produktion sogar als erste intrafollikuläre Veränderung beobachtet werden, mit der sich der DF von der Kohorte abhebt (AUSTIN et al. 2001), wohingegen die reine Expression von Aromatasen zur Steroidhormonproduktion nicht mit der Selektion des DF assoziiert sein muss (XU et al. 1995). Eine weitere Fähigkeit eines Follikels, die für das fortschreitende Wachstum und die Dominanz benötigt wird, ist die Forcierung der Aromatase- Aktivität in der Steroidhormonproduktion als Reaktion auf FSH und LH (JOLLY et al.

1994).

Daher scheint die Forderung durchaus berechtigt, dass die Größe nicht das einzige Kriterium für Dominanz sein, sondern auch das Verhältnis von E2 und P4 in der Follikelflüssigkeit für die Bestimmung herangezogen werden sollte (SUNDERLAND et al. 1994). Diese Forschergruppe definiert den Abschluss der Selektion oder Dominanzbildung mit dem Zeitpunkt, an dem ein östrogenaktiver Follikel sein eigenes Wachstum unterstützt und das der anderen unterdrückt.

Die Unterdrückung des Wachstums kleinerer Follikel und die Einleitung der Atresie jener im Rind wurde bereits 1981 erkannt (MATTON et al. 1981). Die bisher unbekannten Substanzen, die diese Unterdrückung bewirken, sind anscheinend in der Follikelflüssigkeit vorhanden. Steroide und Inhibin konnten als alleinige Ursache ausgeschlossen werden (LAW et al. 1992).

Die eingeschränkten physiologischen Fähigkeiten der subordinaten Follikel zeigen sich unter anderem an Tag vier des Ovarzyklus in einer geringeren Zahl an

Granulosa-Zellen, LH- und FSH-Rezeptoren und einer geringeren E2-Konzentration in der Follikelflüssigkeit (BODENSTEINER et al. 1996).

Die Atresie, der die subordinaten Follikel anheim fallen, wird als ein limitierender Faktor für die Anzahl ovulierender Follikel in jedem Zyklus angesehen (GOUGEON 1986). Allgemein kann die Follikelatresie in jedem Stadium der Follikelentwicklung einsetzen (MARION et al. 1968; MARKSTROM et al. 2002). Während in Primordial- und präantralen Follikeln die Eizelle als erste Struktur der Atresie anheim fällt (DRIANCOURT u. THUEL 1998), ist sie im Antralfollikel hingegen als letzte Struktur von der Atresie betroffen (HAY et al. 1976).

Da alle Stadien des Follikelwachstums mit Atresie assoziiert sind (HSUEH et al.

1994), ist auf dem bovinen Ovar zu jedem Zeitpunkt ein gewisser Anteil der Follikeln atretisch (SILVÁN et al. 1993). Auch auf Basis der einzelnen Follikel gesehen, zeigen 76% der morphologisch als nicht atretisch klassifizierten Follikel apoptotische Granulosazellen (JOLLY et al. 1994).

Die durch die Atresie bedingten strukturellen Veränderungen am Follikel während einer Follikelwelle können bereits ab dem dritten Tag jener Welle gesehen werden, sie manifestieren sich aber erst ab dem fünften Tag (ASSEY et al. 1994). Die Elimination atretischer Follikel braucht mindestens ein bis zwei Wochen (HENDRIKSEN et al. 2000).

Kruip und Dieleman führten in ihren Untersuchungen eine graduelle Einteilung der Atresie ein. Nach dieser sind im so genannten frühen oder primären Stadium die Veränderungen auf die Granulosazellen beschränkt. Veränderungen an der Theka interna, der Basallamina, dem Kumulus und der Eizelle traten erst in den sekundären und tertiären Atresie-Stadien auf (KRUIP u. DIELEMAN 1982).

Zwischen der Erscheinung eines Follikels und der aus ihm post mortem herausgelösten Eizelle konnte folgender Zusammenhang gefunden werden: Oozyten mit kompaktem und kompletten Kumulus stammen aus gesunden oder gering atretischen Follikeln und jene mit inkomplettem oder expandierten Kumulus aus atretischen Follikeln (BLONDIN u. SIRARD 1995). Zu den degenerativen Veränderungen an den Kumulus-Oozyten-Komplexen (KOK) führten Assey et al.

zwischen den strukturellen Veränderungen während der Degeneration der Eizelle und jenen, die vor und während der Reifung des DF auftreten. Andere Autoren äußern jedoch, dass eine morphologische Selektion nicht ausreicht, um auf nicht apoptotische KOK zu selektieren (ANGUITA et al. 2007). (ASSEY et al. 1994)

In Untersuchungen an Ratten-KOK wurde festgestellt, dass an KOK aus ovulatorischen Follikeln bis zur Fertilisation größtenteils gesunde Kumuluszellen vorhanden sind (SZOLTYS et al. 2000).

Weitere Untersuchungen zur Atresie an Rinder-KOK konnten in den Oozyten nach der IVM keine Hinweise auf eine vorliegende Atresie feststellen (IKEDA et al. 2003).

2.1.3.2 Follikuläre Gefäßentwicklung

Eine adäquate Blutversorgung ist wichtig für die Regulation des Sauerstoffgehaltes im Follikel, das Angebot von Wachstumsfaktoren, Nährstoffen und Gonadotropinen und die Voraussetzung für gute Oozytenqualität (MONTELEONE et al. 2008). Die Gesundheit des Follikels wird beim Pferd als abhängig von der Präsenz eines ausgeprägten Gefäßnetzwerkes in der Theka interna angesehen (WATSON u. AL- ZI'ABI 2002), Untersuchungen am Rind (s.u.) unterstützen diese Hypothese. Die Qualität und Reife einer Oozyte wird beeinflusst vom Gehalt an intrafollikulärem Sauerstoff, welcher proportional ist zur Durchblutung des Follikels (MONTELEONE et al. 2008).

Die Entwicklung von Follikeln vom Primordial- zum Tertiärfollikel ist begleitet von qualitativen und quantitativen Veränderungen im mikrovaskulären Gefäßbett (PLENDL 2000). So nimmt beispielsweise auch die aktive Angiogenese des Rinderfollikels mit dessen Wachstum zu (JIANG et al. 2003).

Die einzelnen Primordialfollikel sind umgeben von einem Gefäßnetz (HERRMANN u.

SPANEL-BOROWSKI 1998; PLENDL 2000), welches aus einem Sektorast der Arteria ovarica stammt (KÖNIG et al. 1988). Eine Hypothese für die Initiierung des Wachstum von Primordialfollikeln ist, dass sie durch das weitere Einspriessen von Gefäßen in Follikelnähe bedingt sein könnte (HERRMANN u. SPANEL-BOROWSKI 1998).

Die Primär- und Sekundärfollikel werden ebenfalls von diesen Sektorgefäßen

Erst im Tertiärfollikel mit einer Größe von mehr als 3 mm findet eine Differenzierung einzelner Gefäße aus dem Gefäßnetz statt. Nur eine der zuführenden Arterien nimmt an Größe zu, verzweigt sich in der Theka externa in ein korbartiges Netz von Arteriolen (äußeres Gefäßnetz), die ein dichtes, der Basalmembran anliegendes Kapillarnetz in der Theka interna (inneres Gefäßnetz) speisen (KÖNIG et al. 1988).

Während des Wachstums des Tertiärfollikels ist eine Angiogenese hauptsächlich im inneren Plexus erkennbar (JIANG et al. 2003), in dem auch die vor der Ovulation erkennbaren mikrovaskulären Veränderungen stattfinden (YAMADA et al. 1994).

Die Gefäßversorgung eines Antralfollikels ist in Abbildung 5 in einer elektronenmikroskopischen Aufnahme dargestellt.

Nicht nur für das initiale Wachstum, sondern auch für die Selektion des DF und für dessen Gesundheit könnte die Etablierung eines Gefäßnetzes um den sich entwickelnden Follikel ein wichtiger Schritt sein (GRAZUL-BILSKA et al. 2007). Nach Untersuchungen der Durchblutung an Follikeln kamen ACOSTA et al. 2005 zu dem Schluss, dass eine erhöhte Blutzufuhr individueller Follikel mit erhöhten Wachstumsraten und der Fähigkeit zur Dominanz einherzugehen scheint.

Auch beim Rhesusaffen wurden Untersuchungen zu Gefäßen am dominanten Follikel durchgeführt. Dabei wurde im DF eine prozentual signifikant höhere Gefäßdichte als in den kleineren Follikeln nachgewiesen (ZELEZNIK et al. 1981). Die Autoren hypothetisierten, dass eine verstärkte Durchblutung individueller Follikel eine verbesserte Zufuhr von Gonadotropinen bedingt und damit eine wichtige Rolle in der selektiven Reifung präovulatorischer Follikel spielen könnte.

Beim Rind zeigen präovulatorische Follikel in ultrasonographischen Untersuchungen eine starke Durchblutung, die parallel zum Gehalt von E2 im Blutplasma ansteigt und bis zur Ovulation auf einem hohen Niveau bleibt (ACOSTA et al. 2003).

In anovulatorischen Follikeln konnte per Ultraschall keine Durchblutung sichtbar gemacht werden und sie zeigten im zeitlichen Verlauf eine Abnahme ihrer Größe (ACOSTA et al. 2003).

Abbildung 5: Elektronenenmikroskopische Darstellung des äußeren Gefäßnetztes eines großen Antralfollikels (Durchmesser 12 mm) eines Rindes

(JIANG et al. 2003)

A = Arterie, V = Vene; der Skalierungsbalken repräsentiert eine Länge von 1,38 mm

Als an der Atresie beteiligt werden degenerative Gefäßnetze eingestuft (JIANG et al.

2003). Bereits 1968 wurde erkannt, dass schon die frühe Atresie mit einer Reduktion der Kapillaren der Theka interna einher geht (MARION et al. 1968).

In morphologisch als gesund klassifizierten Antralfollikeln lassen sich apoptotische Strukturen nur im äußeren Gefäßnetz, in als atretisch klassifizierten Follikeln sowohl

können in atretischen Rinderfollikeln neben einer erhöhten Menge von apoptotischen Zellen in der Theka interna auch viele Kapillaren, die von Zelldebris blockiert sind, gefunden werden (O'SHEA et al. 1978). Auch zeigen sich große gefäßlose Areale in der Theka interna von atretischen Follikeln ab einem Durchmesser von 3 mm (JIANG et al. 2003).

Nicht nur in Untersuchungen am Rind wurde in atretischen Follikeln mit einem Durchmesser von 3 mm und mehr eine verringerte Gesamtfläche der Gefäße in der Theka interna beobachtet, auch bei Schwein (CRAN et al. 1983) und Schaf (HAY et al. 1976) fiel der selbe Sachverhalt auf. Beim Wasserbüffel wird angenommen, dass die Atresie mit gealterten Blutgefäßen in der Theka interna einhergeht (FERANIL et al. 2005).

Blutflussmessungen in Schaf-Follikeln zeigten, dass der Blutfluss in der Wand atretischer Follikel im Vergleich zu gesunden Follikeln um den Faktor 8 - 10 herabgesetzt war (BROWN u. DRIANCOURT 1989). Das Versagen der Zirkulation könnte theoretisch kausal der Atresie vorausgehen, jedoch wurde sie in den meisten Fällen anderen histologischen Anzeichen von Atresie in Rinderfollikeln, wie der Lockerung der apikalen Granulosazellen, dem Verlust der Basalmembran und anderem, folgend beobachtet (MARION et al. 1968).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein enger Zusammenhang zwischen Follikelwachstum, Dominanzbildung und Atresie und den Veränderungen in der Blutzufuhr individueller Follikel vermutet wird (MATSUI u. MIYAMOTO 2009).

2.1.3.3 Follikelflüssigkeit

Die Follikelflüssigkeit ist die Flüssigkeit, die das Antrum eines Follikels füllt. Sie ist unter anderem das Produkt von Granulosazellsekretion (SCHNORR u. KRESSIN 2001) und besteht zum einen aus Sekreten des Follikels, zum anderen aus Transsudaten des Blutplasmas (EDWARDS 1974). Die Komposition der Follikelflüssigkeit reflektiert Veränderungen in den sekretorischen Prozessen der Granulosazellen und der Theka interna und Veränderungen in den Komponenten des Blutplasmas (EDWARDS 1974).

Die follikuläre Umgebung ist wichtig für die normale Entwicklung der weiblichen Gameten (HARTSHORNE 1989). Sie könnte Einfluss haben auf die Qualität und Fertilisierbarkeit der Eizellen in vivo und in vitro (GREVE et al. 1989).

Unterschiedliche Forschergruppen widmeten sich der Aufgabe, die Komponenten der Follikelflüssigkeit mit der Entwicklungskompetenz von Rinder-KOK aus demselben Follikel zu korrelieren (HAZELEGER et al. 1995; SINCLAIR et al. 2008). Eine Studie bezog als Parameter die Morphologie der KOK und die Gehalte von P4, E2 und IGF-1 in die Suche nach einem Parameter für eine gute Entwicklungskompetenz mit ein. Es konnte festgestellt werden, dass die Morphologie der KOK einen signifikanten Einfluss auf die Entwicklungskompetenz hatte und der P4-Gehalt in der Follikelflüssigkeit eine signifikante negative Korrelation zur Entwicklungskompetenz aufwies (HAZELEGER et al. 1995). Das Ziel eines anderen Projekts war der Versuch die Entwicklungskompetenz der KOK über die Aminosäuren in der Follikelflüssigkeit vorauszusagen. In dieser Studie wurden die Aminosäuren Alanin und Glycin als gute zusätzliche Marker für die Bestimmung der KOK-Qualität befunden (SINCLAIR et al.

2008)

2.1.3.3.1 Steroidhormone in der Follikelflüssigkeit

Im Rahmen des Einflusses der follikulären Umgebung auf die Eizelle scheinen auch entsprechende Steroidhormongehalte in der Follikelflüssigkeit wichtig für die Qualität der sich im Follikel befindlichen Eizelle zu sein (DRIANCOURT u. THUEL 1998) und könnten ein Index für das endokrine Verhalten von Follikeln sein (WISE 1986).

Hormonelle Imbalanzen im Follikel stehen beispielsweise auch im Mittelpunkt einer Hypothese zu einer Form der Entstehung des Down-Syndroms beim Menschen.

Diese sollen eine gestörte Mikrovaskularisierung nach sich ziehen und damit einen herabgesetzten O2-Gehalt, der den pH-Wert verändert und über diesen zu Aneuploidie führt (GAULDEN 1992).

Abbildung 6 zeigt eine Übersicht über die Steroidsynthese im Follikel.

Gesunde nicht präovulatorische Follikel zeigen erhöhte Konzentrationen an E2 und geringe an P4, bei den atretischen Follikeln verhält es sich anders herum (BELLIN u.

AX 1984). Je mehr ein Follikel degeneriert ist, desto weniger E2 und Androgene und

1985). So überrascht es nicht, dass Granulosa- und Thekazellen atretischer Follikel unter In-vitro-Bedingungen geringere Mengen an E2 und höhere Mengen an P4 im Vergleich zu Zellen aus nicht atretischen Follikeln produzieren (HENDERSON et al.

1987).

Thekazelle

Cholesterol

Pregnenolon Progesteron

17-Hydroxy- 17-Hydroxy-

Pregnenolon Progesteron

Dehhydroepiandrosteron Androstenedion

Testosteron

Granulosazelle

Östron Östradiol

P450-17α-Aromatase Cytochrom P450scc

17α-Hydroxylase

17, 20-Lyase 17, 20-Lyase

17α-Hydroxylase 3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase

3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase

3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase

17β-Hydroxysteroid- Dehydrogenase

17β-Hydroxysteroid- Dehydrogenase 17β-Reduktase

Abbildung 6: Steroidhormonproduktion in den Follikelzellen (modifiziert nach KOIVUNEN 2001)(KOIVUN EN 2001)

IRELAND und ROCHE veröffentlichten 1982 als erste Forschergruppe eine Untersuchung beim Rind, in der sie sich mit dem Quotienten aus P4 und E2 aus der Follikelflüssigkeit von Follikel mit einem Durchmesser 6 mm und mehr beschäftigten.

Sie prägten den Begriff der Östrogenaktivität, der den Zustand beschreibt, dass sich in der Flüssigkeit eines Follikels mehr E2 findet als P4. Sie verglichen diese mit der Atresie in Follikeln und schlossen aus ihren Ergebnissen, dass Follikel ohne Östrogenaktivität atretisch und mit Östrogenaktivität potentiell ovulatorische Follikel seien. (IRELAND u. R OCHE 1982)

Tabelle 1: Übersicht über Arbeiten, die das Verhältnis aus 17ß-Östradiol und Progesteron in der Follikelflüssigkeit zur Bestimmung der Atresie nutzten

Referenz Untersuchte

Follikel Ratio

Kriterium gegeben, wenn Quotient

von…

Bemerkung

GRIMES et al.

(1987)

(GRIMES et al. 1987)

≥ 5 mm P4 : E2 EI ≥ 10

Wert mit

Sicherheit von 90 % für Atresie GRAZUL-BILSKA

et al. (2007)(GRAZUL- BI LSKA et al . 2007)

≥ 3 mm E2 : P4 EA ≥ 1

Ratio tendentiell positiv korreliert mit Vaskula- risierung des Follikels GRIMES u.

IRELAND (1986)(GRIMES u. IRELAND 1986)

≥ 5 mm P4 : E2

keine Korrelation zu Ergebnissen in der IVM

IRELAND u.

ROCHE (1982) ≥ 6 mm E2 : P4 EA > 1

Ratio nutzbar als Indikator für Atresie JOLLY et al.

(1994)(JOLLY et al. 1994)

8-14 mm E2 : P4 EA > 1 PRICE et al.

(1995)(PRICE et al. 1995)

≥ 5 mm P4 : E2

Ratio genutzt als Kriterium für Wachstum / Regression SUNDERLAND et

al. (1994)(SUNDERLAND et al. 1994)

≥ 5 mm E2 : P4 EA > 1

Ratio genutzt als Kriterium für Dominanz / Atresie (EA = Östrogenaktivität, EI = Östrogeninaktivität)

Einige Forschergruppen sehen allerdings Einschränkungen bezüglich der Nutzbarkeit des E2-P4-Verhältnisses in der Follikelflüssigkeit. Bei einem Durchmesser von über 11 mm ist der Quotient nicht einsetzbar, da in der Flüssigkeit dieser Follikel trotz etwaiger Atresie ein erhöhter E2-Gehalt herrschen kann (KRUIP u. DIELEMAN 1985). Ferner treten wie bereits 1983 durch DIELEMAN et al. bemerkt, nach dem LH-Peak in präovulatorischen Follikeln Veränderungen im Steroidhormongehalt in

Steroidhormonsynthese auf die Produktion von P4 ausgerichtet (DIELEMAN et al.

1984).(DIELEM AN et al. 1983)

Auch in Bezug auf kleine Follikel wird ein Problem mit der Nutzung der E2-P4-Ratio zur Atresiebestimmung gesehen. Die Argumentation basiert darauf, dass die Thekazellen früher auf LH reagieren und Androgene produzieren, als die Granulosazellen die Androgene zu Östrogenen aromatisieren können (DE LOS REYES et al. 2006). Als Alternative könnte in kleinen Follikeln (≤ 5 mm) statt der E2- P4-Ratio zur Bestimmung des Gesundheitsstatus das Verhältnis von Androstendion zu E2 herangezogen werden (ROBERTS et al. 2006). Diese Gruppe ermittelte auch starke individuelle und tierspezifische Schwankungen bis zum Faktor 500 in den Steroidhormongehalten dieser Follikel.

In Untersuchungen bei der Frau wurde festgestellt, dass es eine Korrelation zwischen dem Verhältnis von E2 zu Testosteron bzw. P4 in der Follikelflüssigkeit und zytoplasmatischen Einschlüssen in der Eizelle, einem morphologischen Qualitätsparameter, gibt (XIA u. YOUNGLAI 2000).

Der zeitliche Verlauf des Nebeneinanders von histologischer und – bezogen auf die Steroidhormonproduktion – funktioneller Atresie wird kontrovers diskutiert.

Einige Autoren konnten histologische Veränderungen vor den Veränderungen der Steroidhormongehalte in der Follikelflüssigkeit in Schafen (CARSON et al. 1981) und Kühen (GRIMES et al. 1987; TAKAGI et al. 1993) beobachten. Andere hingegen stellten vor den funktionellen zunächst histologische Veränderungen fest, sowohl was die Kuh (IRELAND u. ROCHE 1982; KRUIP u. DIELEMAN 1982; XU et al. 1995) als auch das Pferd (KENNEY et al. 1979) und den Hamster betraf (BILL u.

GREENWALD 1981).

Im Zusammenhang mit der Durchblutung am Follikel wurden ebenfalls Untersuchungen zum Steroidhormongehalt in der Follikelflüssigkeit durchgeführt. In diesen zeigte sich die Durchblutung von Follikeln positiv korreliert mit dem Quotienten aus E2 und P4 in der Follikelflüssigkeit und tendentiell negativ korreliert mit dem Gehalt an P4 in der Follikelflüssigkeit (GRAZUL-BILSKA et al. 2007).

2.1.3.3.1.1 Östradiolgehalt in der Follikelflüssigkeit

Der E2-Gehalt in der Flüssigkeit von Follikeln mit einem Durchmesser von mehr als 3 mm steigt mit deren Wachstum und sinkt mit der Degeneration, sowohl in vivo (CARSON et al. 1981; KRUIP u. DIELEMAN 1982; WISE u. MAURER 1994) als auch nach artifiziell provozierter Atresie in präovulatorischen Follikeln (OUSSAID et al. 2000) und unter In-vitro-Bedingungen (HENDERSON et al. 1987).

Im DF ist während der Dominanz die Pregnenolon-Versorgung der wichtigste Regulationsfaktor für die E2-Produktion, nach Verlust der Dominanz jedoch sind die Aromatase-Aktivität und die 3ß-Hydroxysteroid-Dehydrogenase entscheidend (CARRIERE et al. 1996).

In subordinaten Follikeln konnten Veränderungen im E2-Gehalt und im Durchmesser vor apoptotischen Veränderungen festgestellt werden (AUSTIN et al. 2001).

In degenerierenden Follikeln ist der verringerte Gehalt von E2 durch eine herabgesetzte Aromataseaktivität bedingt (CARSON et al. 1981; VALDEZ et al.

2005; BURKE et al. 2007). Diese bewirkt ebenfalls einen erhöhten Androgengehalt in atretisierenden Follikeln. Die Korrelation des E2 mit der Atresie spiegelt sich auch in Untersuchungen wieder, die sich mit den Gehalten an E2 in der Follikelflüssigkeit und der Dominanzphase beschäftigt haben. So konnte bei Follikeln mit einem Durchmesser von 2-7 mm vor der Dominanz eines anderen Follikels signifikant mehr E2 nachgewiesen werden als danach (SMITH et al. 1996)

Analysen der E2-Gehalte in der Follikelflüssigkeit zeigen – wie in Tabelle 2 dargestellt – starke Schwankungen in den Werten innerhalb gleicher Klassifizierungen (KRUIP u. DIELEMAN 1982; KRUIP u. DIELEMAN 1985; SKYER et al. 1987; SUNDERLAND et al. 1994; DE LOS REYES et al. 2006).

Tabelle 2: Übersicht über Messwerte und deren Standardfehler bei der Bestimmung von Steroidhormongehalten in der Follikelflüssigkeit

Referenz Untersuchter Parameter

Beispiele für

detektierte Werte ± SEM

Anzahl Werte

(n)

Min 3,3 nmol/l 1,2 k.A.

17ß-Östradiol

Max 204,1 nmol/l 4,2 k.A.

Min 135,9 nmol/l 41,4 k.A.

DE LOS REYES et al. (2006)

(DE LOS REYES et al. 2006)

Progesteron

Max 475,6 nmol/l 62,8 k.A.

Min 21,7 pmol/ml 3,7 7

KRUIP u. DIELE-

MAN (1982) 17ß-Östradiol

Max 145,3 pmol/ml 40,4 5

17ß-Östradiol KRUIP u. DIELE-

MAN (1985)

(KRUIP u. DI ELEMAN 1985) Progesteron

keine Angabe von Werten, siehe Abbildungen in den Veröffentlichungen

Min 4 ng/ml 11 8

17ß-Östradiol

Max 126 ng/ml 740 2

Min 3 ng/ml 22 18

SKYER et al.

(1987)

(SKYER et al. 1987)

Progesteron

Max 256 ng/ml 116 6

17ß-Östradiol SUNDERLAND

et al. (1994)

(SUNDER LAND et al . 1994) Progesteron

keine Angabe von Werten, siehe Abbildungen in den Veröffentlichungen

(Min / Max = Werte aus dem Minimal- bzw. Maximalbereich der Messungen k.A. = keine Aussage)

Allgemein schwankten die ermittelten E2-Werte in den Untersuchungen zwischen 4,7 pmol/ml - was einem Gehalt 1,3 pg/ml entspricht - (KRUIP u. DIELEMAN 1982) und 1100 ng/ml (BADINGA et al. 1992; BIGELOW u. FORTUNE 1998).

2.1.3.3.1.2 Progesterongehalt in der Follikelflüssigkeit

Die P4-Konzentration im Follikel steigt mit seinem Atresiegrad und mit seiner Reife prae ovulationem an (WISE u. MAURER 1994). Damit ist der P4-Gehalt in der

Follikelflüssigkeit nicht präovulatorischer Follikel ein Parameter für Atresie (KRUIP u.

DIELEMAN 1985).

Unter In-vitro-Bedingungen wurde beobachtet, dass die P4-Produktion in Zellen aus der Theka interna über den Zusatz von E2 inhibiert werden kann (FORTUNE u.

HANSEL 1979). Neben E2 bewirken auch Östron, Testosteron, Androstendion und 5α-Dihydrotestosteron eine dosisabhängige Unterdrückung der P4-Produktion (HENDERSON et al. 1987).

Weiterhin konnte festgestellt werden, dass der P4-Gehalt in der Flüssigkeit von Follikeln aus Schlachthofovarien, die entwicklungskompetentere Eizellen tragen signifikant niedriger ist als jener der Follikelflüssigkeit aus Follikeln mit weniger entwicklungskompetenteren Eizellen (HAZELEGER et al. 1995).

In den jeweiligen Untersuchungen schwankten die Werte zwischen 0,3 ng/ml (WISE 1986) und ca. 1400 ng/ml (SUNDERLAND et al. 1994).

2.1.4 Die frühe Embryonalentwicklung

Nach der in der Eileiterampulle stattfindenden Fertilisation (RÜSSE 1967) entwickeln sich in vivo rund 80 % der ovulierten Eizellen zu Embryonen (MERTON et al. 2003).

Die frühe embryonale Entwicklung und deren physiologischer Ort beim Säuger sind in Abbildung 7 zur Übersicht dargestellt.

Abbildung 7: Die frühe Embryonalentwicklung im Menschen (modifiziert nach SCHNORR u. KRESSIN 2001)

Primärfollikel

Sekundärfollikel Tertiärfollikel

Spermien

Vorkern- bildung

Vorkernver- schmelzung

Amphimixis

Vierzell- stadium

Zweizell- stadium

Morula

Blastozyste Ampulla

tubae

Ovar

Isthmus tubae

Uterus Ovulierte Eizelle Gelbkörper

Nach der Fertilisation beginnt die Zygote sich zu teilen in jeweils gleich große Zellen zu furchen, was im weiteren als Teilung bezeichnet werden soll (SCHNORR u.

KRESSIN 2001). Die Bildung der kompaktierten Morula findet im Rind im 32- Zellstadium des Embryos statt (VAN SOOM et al. 1997). Im weiteren Verlauf der Teilungen kommt es zur Bildung von Flüssigkeit zwischen den äußeren und inneren Zellen, es wird das Blastocoel gebildet. In der Blastozyste sind das so genannte Trophektoderm und der Embryonalknoten (Embryoblast, Innere Zellmasse, ICM) morphologisch gut voneinander abgrenzbar. Letztere bildet im weiteren Verlauf unter anderem den Embryo, erstere wird zu den Fruchthüllen (SCHNORR u. KRESSIN 2001).

Es ist allgemein akzeptiert, dass die während des Wachstums und der Reifung der Eizelle produzierte mRNA und Proteine an der Embryonalentwicklung vor der MET (maternal embryonic transition = Übergang von der maternalen Kontrolle der Embryonalentwicklung zur embryonalen Kontrolle) beteiligt sind (TELFORD et al.

1990). Die Aktivierung der Transkription des embryonalen Genoms nach der Fertilisation ist ein Prozess, der eine gut koordinierte Folge von nukleären und zytoplasmatischen Geschehnissen erfordert, die zusammen sicherstellen, dass die beiden elterlichen Genome normal reprogrammiert und rekonstruiert werden, bevor die Transkription beginnt (LATHAM 1999).

Der Beginn der MET ist speziesspezifisch (TELFORD et al. 1990).

Es wurden im Laufe der Jahre mehrere Untersuchungen durchgeführt, die zeigten, dass die Genomaktivierung in Embryonen des Rindes schon ab dem Ein- bis Zweizellstadium statt findet (PLANTE et al. 1994; HYTTEL et al. 1996; MEMILI et al.

1998). Diese geringgradige Genomaktivierung wird als „minor gene activation“

bezeichnet (MEMILI u. FIRST 1999).

Diese Beobachtungen unterlegen die Hypothese, dass die Genomaktivierung in den meisten Spezies schrittweise geschieht (LATHAM 1999).

Die MET ist für die Entwicklung bis zum vierten Zellzyklus beim Rind nicht entscheidend. Wurde in Untersuchungen die Transkription per α-Amanitin blockiert, so wirkte sich dieser Eingriff in den ersten vier Zellzyklen nicht inhibierend oder blockierend auf die Embryonalentwicklung aus (PLANTE et al. 1994).

Vor den oben genannten Untersuchungen, die mit Hilfe fortschrittlicher Untersuchungsmethoden möglich waren, konnte die Umwandlung des Nukleolus in einen funktionellen Zustand im Achtzellstadium von Rinderembryonen beobachtet und diese in den Zusammenhang mit der MET gebracht werden (CAMOUS et al.

1986). Diese Genomaktivierung während des 8-16-Zellstadiums bei Rinderembryonen wird als „major genome activation“ oder Hauptaktivierung bezeichnet.

2.1.5 Expression von mRNA in Oozyten und Embryonen

Die Transkription ist die durch verschiedene Regulationsmechanismen gesteuerte Synthese von RNA nach Vorlage der DNA. Die entstehende mRNA wird als Matrize für die Proteinsynthese benötigt.

Für die meisten Gene hat die jeweilige mRNA ihre eigenen, speziesspezifischen Expressionsmuster. Sie wird nicht nur abhängig vom Wachstumsstadium und dem zeitlichen Verlauf exprimiert (NIEMANN u. WRENZYCKI 2000), sie unterliegt auch Veränderungen bezüglich der Länge der polyadenylierten Enden und einem Abbau (PAYNTON et al. 1988).

Mittlerweile ist ebenfalls für den Menschen (OSTERMEIER et al. 2004), das Rind (GILBERT et al. 2007) und das Schwein (YANG et al. 2009) nachgewiesen, dass bei der Befruchtung der Eizelle paternale mRNA in die Eizelle verbracht wird.

Die Veränderungen während der Entwicklung von KOK bzw. Embryonen benötigen eine gut aufeinander abgestimmte Expression maternaler bzw. maternaler und embryonaler Gene (KIDDER 1992).

In Mäusen ist untersucht, dass beispielsweise die Ausschaltung nur eines wichtigen Gens genügt (z.B. E-Cadherin, Fibronektin etc.), um den Tod von Embryonen und frühen Feten herbeizuführen (COPP 1995). Eine Übersicht zu den ausgeschalteten Genen und dem Zeitpunkt der Letalität findet sich in der zitierten Veröffentlichung.

Weitere Untersuchungen an Mäusen ergaben auch Hinweise, dass suboptimale Bedingungen bei der IVP von Mäuseembryonen zu irreversiblen Langzeitschäden (bezüglich der postnatalen Entwicklung, dem Wachstum, der allgemeinen

Die derzeitig gebräuchlichen In-vitro-Systeme beim Rind könnten dauerhafte Änderungen in den Genexpressionsmustern während der embryonalen und fetalen Entwicklung bedingen (WRENZYCKI et al. 2004), was zu einer verringerten Qualität der Embryonen führen und sogar die Überlebensfähigkeit der Nachkommen nach einem Transfer beeinflussen könnte (WRENZYCKI et al. 2007). Es wäre möglich, dass sie ein kausaler Mechanismus sind, der am häufigen Auftreten des „large offspring syndrome“ (LOS) beim Rind beteiligt ist (WALKER et al. 1992; WALKER et al. 1996).

Daher ist die Analyse der mRNA-Gehalte von Genen, die für die embryonale Entwicklung wichtig sind, ein nützliches Werkzeug, um die Normalität der Embryonen zu messen (NIEMANN u. WRENZYCKI 2000). Sie könnte dazu beitragen, für die Zukunft fundierte Klassifikationskriterien für die Selektion bezüglich einer guten Entwicklungskompetenz finden (COTICCHIO et al. 2004; PATEL et al. 2007).

2.1.5.1 Messenger RNA-Expression spezifischer entwicklungsrelevanter Gene in Oozyten und Embryonen

Die mRNA-Gehalte der folgend beschriebenen Gene sind beteiligt an der Follikulogenese (GDF9 und BMP15), Stressprotektion (HSP70, G6PD), der Umwandlung von der Eizelle zum Embryo (ZAR1), dem Glukosestoffwechsel (SLC2A1, SLC2A3 und G6PD), dem allgemeinen Metabolismus (G6PD), den Zellkontakten (DSC2) und epigenetischen Prozessen wie der DNA-Methylierung (DNMT1A, DNMT1b und DNMT3A) und der Histondeacetylierung (HDAC2).

Sie haben sich in unterschiedlichen Untersuchungen von verschiedenen äußeren Faktoren beeinflusst gezeigt (eine tabellarische Übersicht dazu findet sich in einem Übersichtsartikel von WRENZYCKI et al. aus dem Jahr 2007). Daher werden sie als Markergene zur Einschätzung der Qualität bezüglich der Herkunft bzw. der angewandten biotechnischen Verfahren herangezogen.

2.1.5.1.1 Heat shock protein70

Die erste Beschreibung von Hitzeschockproteinen erfolgte im Jahre 1962 durch Ritossa (Zitat nach DAUGAARD et al. 2007). Er stellte nach Einwirkung von Hitze ein

verändertes Genexpressionsmuster in den Speicheldrüsen von Drosophila-Larven fest. (DAUGAARD et al. 2007)

Die Mitglieder der Gruppe der Hitzeschockproteine werden benannt nach ihrer Masse in Kilo-Dalton (kDa). Das Hitzeschockprotein70 oder HSP70 hat demnach eine Masse von 70kDa.

Die Funktionen dieser Proteine bestehen in der Faltung von neu synthetisierten und nicht richtig gefalteten Proteinen und der Erhaltung von Strukturproteinen. Ferner sind sie beteiligt an der Protein-Translokation, der Verhinderung von Aggregatbildung von Proteinen und dem Abbau von instabilen Proteinen (KREGEL 2002).

Im Bereich der bovinen Reproduktion konnte für die HSP70-Proteine die Funktion als Spermienantigen in der Spermien-Oozyten-Interaktion nachgewiesen werden (MATWEE et al. 2001). Weiterhin agieren sie protektiv in der frühen Embryonalentwicklung (MATWEE et al. 2001).

Beim Rind kann mRNA für HSP70 in unreifen Eizellen und präimplantatorischen Embryonen detektiert werden (WRENZYCKI et al. 1998). Es unterliegt somit sowohl maternaler als auch embryonaler Transkription.

Die Fähigkeit, auf eine Hitzeeinwirkung mit erhöhter Transkription von HSP70 zu reagieren, ist ab dem 2-Zell-Stadium vorhanden (CHANDOLIA et al. 1999).

Eine Übersicht über Untersuchungen, die sich mit dem Einfluss verschiedener Parameter auf den HSP70-mRNA-Gehalt in Oozyten und präimplantatorischen Embryonen beschäftigen, findet sich in Tabelle 3. Weiterhin wurden Untersuchungen an verschiedenen Geweben nach der Geburt gestorbene Kälber aus SCNT und IVP durchgeführt, die im Vergleich zu gesund geborenen Tieren Veränderungen im Transkriptgehalt von HSP70 aufwiesen (LI et al. 2005).

Tabelle 3: Untersuchungen zu Einflussfaktoren auf den mRNA-Gehalt von HSP70 in Oozyten und frühen Embryonalstadien des Rindes

Referenz Untersuchte

Stadien Versuchsbedingungen Ergeb-

nis BALASUBRAMA-

NIAN et al.

(2007)(BALASUBR AMAN IAN et al. 2007)

Blastozysten In vivo-Embryonen im Vergleich

zu Embryonen aus IVP

↓

DE OLIVEIRA et al. (2005)(DE OLIVEIR A et al. 2005)

Blastozysten

an Tag 7 Embryonendichte in der IVC

↑

HUMBLOT et al.

(2005)(HUMBLOT et al. 2005)

Reife Eizellen

Vollständige In-vivo-Reifung im Vergleich zu keiner bzw. partieller Reifung

↓

KNIJN et al.

(2005)

(KNIJN et al. 2005)

Blastozysten

Wechsel von In-vivo-Kultur auf IVC nach 45 h im Vergleich zur IVC und vollständiger In-vivo- Reifung

↑

LAZZARI et al (2002)(LAZZARI et al . 2002)

Blastozysten

Serumzusatz im SOF in der IVC im Vergleich zur Reifung in vivo und im Schafovidukt

↑*

MORTON et al.

(2007)(MORTON et al. 2007)

Blastozysten Weibliches im Vergleich zum

männlichen Geschlecht

↑

NIEMANN u.

WRENZYCKI et al. (2000)(NIEMANN u. WR ENZYC KI 2000)

Blastozysten In vivo-Embryonen im Vergleich

zu Embryonen aus IVP

↓

PARK et al.

(2006)

(PARK et al. 2006)

Blastozysten Kryokonservierung

↑

RIEF et al.

(2002)(RIEF et al. 2002)

Expandierte

Blastozysten Kokultur mit Epithelzellen

↑

RUSSEL et al.

(2006)(RUSSELL et al. 2006)

Blastozysten Serumzusatz im SOF in der IVC

↑

WARZYCH et al.

(2007)(WARZYCH et al. 2007)

Geschlüpfte

Blastozysten Serumzusatz in der IVM

↑

WRENZYCKI et al. (1999)(WRENZYC KI et al . 1999)

Reife Eizellen bis Blasto- zysten

Serumzusatz in der IVM / IVC

↑

WRENZYCKI et al. (2001b)(WRENZYC KI et al. 2001b)

Blastozysten SCNT

↓**

→

↑

↓

↓↑

unterschiedlich verändert; * parallel zu einer erhöhten Zellzahl in den Blastozysten; ** keine HSP70-mRNA detektierbar

2.1.5.1.2 Zygote arrest gene1

Das zygote arrest gene1 oder ZAR1 ist evolutionär hoch konserviert, was auf eine zentrale physiologische Bedeutung hinweist (UZBEKOVA et al. 2006).

Das zugehörige Protein besitzt eine Zinkfinger-Domäne an seinem C-Terminus, was darauf schließen lässt, dass es an der transkriptionalen Regulation beteiligt ist (WU et al. 2003b).

Es konnte gezeigt werden, dass Zar1 wichtig für die Prozesse während des Übergangs von der Eizelle zum Embryo und die MET ist. So wurde in Versuchen mit Knockout-Mäusen bezüglich Zar1 beobachtet, dass die meisten Embryonen im Einzellstadium arretieren und sich keiner bis zum Vierzellstadium entwickelt (WU et al. 2003a).

Beim Rind konnten Transkripte von ZAR1 in Hypothalamus, Hypophyse, Hoden und Ovarien, insbesondere in den Eizellen und teilweise auch in den Kumuluszellen gefunden werden (UZBEKOVA et al. 2006).

Die Expression von ZAR1 ist beim Rind bereits in der unreifen Eizelle gegeben (PENNETIER et al. 2004). Die Ergebnisse einer Untersuchung zeigen einen starken Anstieg des Gehaltes im Vierzellstadium und einen Erhalt dieser Menge bis zur Blastozysten-Formierung (BREVINI et al. 2004), während in anderen Untersuchungen eine stetige Abnahme nach der Reifung in der Transkriptmenge bis hin zum Unterschreiten der Detektionsgrenze ab dem Morula-Stadium festgestellt wurde (UZBEKOVA et al. 2006; THELIE et al. 2007; NOWAK-IMIALEK et al. 2008).

Letzteres weist auf eine rein maternale Expression hin.

Ein signifikanter Zusammenhang zwischen dem relativen Gehalt an mRNA von ZAR1 und dem Stadium der meiotischen Reifung in vitro konnte in Oozyten nachgewiesen werden (NOWAK-IMIALEK et al. 2008).

Weiterhin gibt es Hinweise darauf, dass die ZAR1-Expression durch die Applikation von P4 beeinflusst wird (LINGENFELTER et al. 2007).

2.1.5.1.3 Growth and differentiation factor9

Die Sequenz für den growth and differentiation factor9 oder Gdf9 wurde zuerst in der

TGF-ß-Superfamilie, welches sich durch Unterschiede im COOH-Terminus von den anderen Mitgliedern dieser Familie differenzieren lässt (MCPHERRON u. LEE 1993).

Ferner unterscheidet es sich von vielen der anderen Familien-Mitglieder durch das Fehlen des vierten und siebten der sieben Cysteine im Bereich des COOH-Endes (MCPHERRON u. LEE 1993). Ersteres ist für die kovalente Bindung in Dimeren verantwortlich (DUBE et al. 1998).

GDF9 wird ausschließlich von Eizellen sezerniert (ERICKSON u. SHIMASAKI 2000).

Es reguliert verschiedene Schlüsselfunktionen der Granulosazellen, die an der Proliferation von Granulosazellen beteiligt (SPICER et al. 2006) und für die Kumuluszell-Expansion und die Erhaltung des optimalen Mikromilieus der Eizelle verantwortlich sind (ELVIN et al. 1999).

In ausgewachsenen Eizellen der Maus nimmt Gdf9 Einfluss auf die Expression von Kit Ligand-mRNA in Granulosazellen (JOYCE et al. 2000). In In-vitro-Versuchen zeigten Maus-Oozyten unter Zusatz von rekombinanten Kit-Liganden einen vorübergehenden Meioseblock (ISMAIL et al. 1996). Weiterhin werden wachstumsfördernde Wirkungen von Gonadotropinen unter anderem über die Kit- Liganden vermittelt (PARROTT u. SKINNER 1998).

In Mäusen mit Gdf9-Knockout findet eine Follikelentwicklung nur bis zum Primärfollikel statt und führt zu kompletter Infertilität der Weibchen (DONG et al.

1996). Des weiteren konnte bei diesen Mäusen keine Follikelatresie beobachtet werden, was als Block der Follikelentwicklung vor Erlangung der Atresie-Fähigkeit interpretiert wurde (DONG et al. 1996).

Die Immunisierung von Rindern gegen GDF9 (oder/und BMP15) führt zu einer veränderten Follikelentwicklung (verringerte Anzahl und Größe der Follikel) und teilweise erhöhter, teils aber auch verringerter Ovulationsrate (JUENGEL et al.

2009).

In In-vitro-Versuchen wurde gezeigt, dass der Zusatz von GDF9 zum Reifungsmedium tendentiell und in Kombination mit BMP15 signifikant die Blastozystenraten erhöht (HUSSEIN et al. 2006).

Die Expression von GDF9 im Rind ist oozytenspezifisch (BODENSTEINER et al.

1999). Seine mRNA ist erstmals im Primordialfollikel nachzuweisen

(BODENSTEINER et al. 1999). Seine Transkripte bleiben während der Reifung, Befruchtung und in der Kultur bis zum 5-8-Zellstadium erhalten (SENDAI et al. 2001;

PENNETIER et al. 2004).

Untersuchungen, die sich mit den Einflüssen auf den mRNA-Gehalt von GDF9 in Oozyten und Embryonen beim Rind befasst haben, sind in Tabelle 4 dargestellt.

Tabelle 4: Untersuchungen zu Einflussfaktoren auf den mRNA-Gehalt von GDF9 in Oozyten und frühen Embryonalstadien des Rindes

Referenz Untersuchte

Stadien Versuchsbedingungen Ergebnis DONNISON u.

PFEFFER (2004)(DONNISON u. PF EFFER 2004)

Oozyten Follikelgröße > 5 mm im Ver- gleich zu < 2 mm

↑

al. (2003a)(LONERG AN et al. 2003a)

Reife Oozyten IVM im Vergleich zur In-vivo-

Reifung

↓

MOUROT et al.

(2006)(MOUROT et al. 2006)

Reife Oozyten, Ein- und Zwei- zeller

Follikelgröße unter Einbeziehung des Teilungszeitpunktes

→

→

↑

↓

2.1.5.1.4 Bone morphogenic protein15

Die DNA-Sequenz für das bone morphogenic protein15 (Bmp15) oder auch Gdf9b wurde erstmals für die Maus identifiziert (LAITINEN et al. 1998). Im Vergleich zwischen Maus und Mensch zeigte sich, dass es sich um ein hochkonserviertes Gen handelt, welches sich auf dem X-Chromosom befindet (DUBE et al. 1998).

Das Protein BMP15 gehört zur TGF-ß-Superfamilie, ihm fehlt im Vergleich zu vielen Proteinen dieser Familie jedoch das vierte der sieben Cysteine in der COOH- terminalen Region, welches die kovalente Bindung in Dimeren bedingt (DUBE et al.

1998).

In der Maus wird das Bmp15 nur in der Oozyte und beginnend vom Primärfollikel bis über die Ovulation hinaus exprimiert (DUBE et al. 1998).

In Versuchen mit Bmp15-knockout-Mäusen (KO) ergab sich, dass männliche KO-

Ovulationen und geringere Fertilisationsraten zu beobachten (YAN et al. 2001).

Wurde in den Mäusen zusätzlich das Gdf9 partiell ausgeschaltet, zeigten sich weitere Veränderungen, wie etwa eine geschwächte Bindung zwischen Kumuluszellen und Eizelle und Verbleib der Eizelle im Follikel nach Ovulation. Bei völliger zusätzlicher Ausschaltung von Gdf9 kam es häufig zu ein- oder beidseitiger Bildung von Zysten (YAN et al. 2001).

Bei Schafen bewirkt eine kurzzeitige Immunisierung gegen BMP15 und GDF9 eine Erhöhung der Ovulationsrate, scheinbar ohne negativen Effekt auf die Fertilisation, die embryonale und fetale Entwicklung oder die Trächtigkeitserhaltung (JUENGEL et al. 2004). Bei natürlichen Mutationen des BMP15-Gens wurde abhängig von der Dosis eine erhöhte Ovulationsrate bzw. infertile Phänotypen beobachtet (GALLOWAY et al. 2000).

Der Zusatz von BMP15 zum Medium in der In-vitro-Maturation setzt die Kumuluszell- Apoptose herab. Daraus entstand die Hypothese, dass BMP15 in vivo eventuell als ein für die Follikel antiatretischer Faktor wirkt. Weiterhin wird durch den Zusatz die Entwicklungskompetenz der KOK verbessert (HUSSEIN et al. 2006). Der Zusatz eines Antagonisten in der Maturation setzt die Entwicklungskompetenz hingegen herab.

Untersuchungen beim Rind, die sich mit den Einflüssen auf den mRNA-Gehalt von BMP15 in Oozyten und Embryonen beschäftigt haben, sind in Tabelle 5 aufgelistet.

Da die Transkripte für BMP15 bis inklusive ins Blastozysten-Stadium nachgewiesen werden können, ist von einer sowohl maternalen als auch embryonalen Expression auszugehen.