3 Material und Methoden
3.3 MessengerRNA-Analyse
3.3.3 Durchführung der quantitativen PCR
Die Zusammensetzung der verschiedenen Ansätze für die quantitative PCR befindet sich in Kapitel 9.1.
Jeder Ansatz bestand aus einem Reaktions- oder Mastermix, den jeweiligen 5´- bzw.
3´-Primern für die zu untersuchenden Transkripte, der zugesetzten cDNA aus der Aufbereitung und H2O. Die Mengen waren bedarfsangepasst.
Danach wurden die Ansätze ein weiteres Mal in das „IQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System“ der Firma Bio-Rad verbracht. Der Cycler benötigte zunächst eine Phase von 10 Minuten zum Aktivieren der Polymerase, bevor es mit der Amplifikation begann.
Tabelle 13: Ablauf eines Zyklus in der PCR
Es wurden standardmäßig 42 Zyklen durchgeführt.
Die Detektion der Menge der enthaltenen cDNA fand über die Bildung eines fluoreszierenden Komplexes aus dem Fluoreszenz-Farbstoff SYBR-green und doppelsträngiger DNA statt. Die kontinuierliche Messung der Fluoreszenz machte eine Quantifikation über den Zeitpunkt der erstmaligen Detektion möglich.
Die Verifikation der PCR-Produkte fand sowohl durch eine gelelektrophoretische (siehe Abbildung 28 und Abbildung 29 ) als auch eine Sequenzanalyse statt.
Globin
Abbildung 28: Gelchromatographie der PCR-Produkte der Eizellen
50 fg 257 bp
Embryo 257 bp
245 bp 256 bp 202 bp
G6PD 183 bp
DNMT1A 172 bp
DNMT3A 57 bp
HDAC2 162 bp Marker
100 bp Marker
DSC2 199 bp
Abbildung 29: Gelchromatographie der PCR-Produkte der Blastozysten
Progesteron in der Follikelflüssigkeit
3.4.1 Bestimmung der Progesteronkonzentration per ELISA
Die P4-Konzentration wurde mit einem ELISA nach dem von PRAKASH et al. (1987) beschriebenen Verfahren ermittelt. (PRAKASH et al. 1987)
Die Follikelflüssigkeit konnte für die Bestimmung der P4-Konzentration ohne Extraktion direkt im ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) eingesetzt werden, da die Standardkurve ebenfalls mit Follikelflüssigkeit angesetzt war.
Die Follikelflüssigkeit für die Standardkurve und Verdünnungen der Proben wurde vor ihrem Einsatz mit Aktivkohle behandelt, um sie von Steroidhormonen zu befreien.
Für die Behandlung wurde zunächst eine Aktivkohle-Lösung vorbereitet:
1. 5 g Aktivkohle + 41,7 ml Assaypuffer mischen 2. für 16 Stunden bei 4 °C unter Rühren inkubieren Die Behandlung der Follikelflüssigkeit fand wie folgt statt:
1. Herstellung einer Mischung aus 10 ml Aktivkohle-Lösung und 40 ml Follikelflüssigkeit
2. Inkubation bei 4 °C für 16 Stunden 3. Zentrifugation bei 500 g für 10 Minuten
4. Überstand abnehmen und in weitere 5 ml Aktivkohle-Lösung überführen 5. Inkubation bei 37 °C für 2 Stunden
6. Zentrifugation bei 500 g für 10 Minuten
7. Überstand abnehmen und in weitere 5 ml Aktivkohle-Lösung überführen 8. Inkubation bei 37 °C für 2 Stunden
9. Zentrifugation bei 500 g für 10 Minuten
10. Filtration des Überstandes (Filter mit Siebweite von 0,2 µm)
11. Gefrieren der „CT-Follikelflüssigkeit“ (CT = charcoal treated, mit Aktivkohle behandelt) bei - 20 °C
Die Standardkurve wurde in den Verdünnungen 0,2 bis 12,5 ng/ml mit P4 (Fa.
Sigma-Aldrich, Produkt-Nr. P013-25G) erstellt.
Für den kompetitiven ELISA dienten 96-Wellplatten (Fa. Nunc, Langensebold;
Wissenschaftszentrum Weihenstephan, TU München, 85354 Freising) beschichtet waren. Zunächst wurden ein zweiter, spezifisch P4 bindender Antikörper (monoklonaler ImmunglobulinG-Antikörper Clone 2H4 der Fa. Sigma-Aldrich, Produkt-Nr. P-1922), sowie natives (Standardkurve, Kontrollen, Probe) und enzymgekoppeltes P4 (Progesteron-3-Carboxymethyloxim-Meerrettichperoxidase von Professor H.H.D. Meyer, Lehrstuhl Physiologie, Wissenschaftszentrum Weihenstephan, TU München, 85354 Freising) zugegeben. Darauf trat zwischen letzteren eine kompetitive Situation um die Bindung an die definierte Menge an Antikörpern ein. Nach einer Inkubation über Nacht bei 4 °C wurden die Substratlösungen (Zusammensetzung s iehe Anhang) hinzugegeben, woraufhin ein quantitative Umsetzung der Substrate durch das P4 -gebundene Enzym stattfand. Nach einer weiteren Inkubation von 40 Minuten unter Lichtschutz wurde die Reaktion mit H2SO4 gestoppt und die Farbintensität des umgesetzten Substrates photometrisch bestimmt. Die Auswertung fand mit dem Mikroplattenphotometer „SLT Spectra“ in Kombination mit der Software „Magellan“
der Firma Tecan (Männedorf, Schweiz) statt. Durch die kompetitive Situation im ELISA ist die Konzentration des P4 umgekehrt proportional zur Farbintensität des Reaktionsansatzes. Das Prinzip des kompetitiven ELISA ist in Abbildung 30 dargestellt.
Abbildung 30: Prinzip des kompetitiven ELISA
Werte, die oberhalb der Detektionsgrenze in einer Verdünnung von 1:100 lagen, wurden für die statistische Auswertung gleich dem höchsten in dieser Verdünnung gemessenen Wert gesetzt.
Die Intra- und Interassay-Variationskoeffizienten lagen bei < 10 % bzw. < 12 %.
3.4.2 Bestimmung der 17ß-Östradiol-Konzentration mittels Radioimmunoassay
Die E2-Konzentration wurde nach dem von IRVING-RODGERS et al. 2003 beschriebenen Verfahren ermittelt.(IRVING-ROD GER S et al. 2003)
Zur Bestimmung des E2-Gehaltes wurde das Radioimmunoassay- (RIA-) Kit „DSL 4400“ (Firma Beckman Coulter GmbH, Krefeld) eingesetzt. Für die Analyse der Reaktion wurde der Strahlendetektor „LKB 1272 clinigamma“ (zunächst Firma Wallac, mittlerweile Fa. Perkin-Elmer aus Monza, Italien) genutzt.
Das Prinzip dieses kompetitiven RIA entspricht grundsätzlich dem des ELISA.
Allerdings findet die Detektion über eine Bestimmung der Radioaktivität statt. Die untere und obere Nachweisgrenze dieses Tests liegen nach Herstellerangaben bei 4,7 und 6000 pg/ml, die Intra- und Interassay-Variationskoeffizienten betrugen 5,3 bzw. 9,3 %. Die Kreuzreaktivität des im RIA-Antikörpers ist Tabelle 14 angegeben.
Tabelle 14: Kreuzreaktivität des im RIA verwandten Antikörpers
Substrat Kreuzreaktivität (%)
Östron 3,40
Östradiol-3-Glukuronid 1,80
Östriol 0,75
Östron-ß-D-Glukuronid 0,30
16-Keto-Östradiol 0,29
17α-Östradiol 0,26
Östradiol-3-Sulfat 0,21
Für die statistische Auswertung wurden Werte unterhalb des Messbereichs (< 4,7 pg/ml) gleich der unteren Nachweisgrenze und jene oberhalb des
3.5.1 Allgemeiner Versuchsaufbau
Das Versuchsziel war die Überprüfung der Auswirkungen einer per Ultraschall erkennbaren bzw. nicht erkennbaren Durchblutung des Herkunfts-Follikels und eines unterschiedlichen Abstandes zwischen den Gewinnungsterminen der Rinder-KOK auf deren Qualität. Dabei wurden die Auswertungen auf drei Aspekte fokussiert:
1. Die Eignung der Oozyten für die IVP
2. Die Steroidhormongehalte in der Follikelflüssigkeit
3. Die Expression spezifischer, entwicklungsrelevanter Gene in den Oozyten bzw. den produzierten Blastozysten
3.5.2 Versuchsanordnung
Der Ablauf des Versuchs ist in Abbildung 31 dargestellt.
Eizellgewinnung per OPU
Einfrieren denudierter, unreifer Oozyten
IVP von Embryonen
Bestimmung der Teilungs- und Entwicklungsraten
Einfrieren der Blastozysten
Analyse der mRNA-Gehalte entwicklungsrelevanter Gene
mittels quantitativer RT-PCR
Abbildung 31: Überblick über die Versuchsanordnung
3.5.2.1 Etablierung von OPU und anschließender IVP
Die Versuche fanden im Zeitraum von August 2006 bis April 2008 statt.
In den Vorversuchen von August 2006 bis Januar 2007 wurde an 4 Tieren der Klinik
Parameter im CF-Modus des Ultraschallgerätes zur artefaktfreien Darstellung der Durchblutung.
In dieser Phase war feststellbar, dass eine übermäßige Manipulation der Ovarien eine verstärkte Durchblutung provoziert. So zeigten Follikel, in denen zunächst keine Durchblutung erkennbar war, nach starker oder längerer Manipulation einen veränderten Durchblutungsstatus.
Parallel zu den OPU-Übungen wurden die gewonnenen KOK in die IVP eingebracht, um die allgemeine Handhabung der KOK zu optimieren.
3.5.2.2 Durchführung des Hauptversuchs
Der Hauptversuch begann im Februar 2007 und endete im April 2008. Es wurden zunächst das OPU und die IVP durchgeführt, parallel dazu fand die Probennahme und -konservierung für die mRNA-Analyse statt.
Darauf folgten die Follikelflüssigkeitsgewinnung, deren Analyse und die mRNA-Analsye per quantitativer real time RT-PCR.
3.6 Statistische Auswertungen
Für die statistischen Auswertungen der Ergebnisse wurde das Computerprogramm SigmaStat in der Version 2.0 der Firma Jandel Scientific genutzt.
Die Analyse der Daten aus dem OPU, der IVP und der Follikelflüssigkeit fand mittels Chi Quadrat-, t-Tests und Two way ANOVA statt.
Die Daten zu den Transkripthäufigkeiten der verschiedenen Gene wurden zunächst auf Normalverteilung mittels des Kolmogorov-Smirnov-Tests geprüft und anschließend eine Varianzanalyse mit dem Levene Median Test durchgeführt. Im Anschluss daran erfolgte eine Two way ANOVA für jedes Gen mit den zwei Faktoren Punktionsintervall des OPU und Durchblutungsstatus der Follikel und ihren Interaktionen gefolgt von einem Tukey-Test.
Die Daten wurdenals (arithmetisches Mittel) ± s (Standardabweichung) bzw. ± SEM (Standardfehler) dargestellt. Unterschiede von P ≤ 0,05 galten als statistisch signifikant.
4 Ergebnisse
4.1.1 Ergebnisse aus dem OPU
Für die Gewinnung der KOK wurden insgesamt 26 OPU-Sitzungen durchgeführt. In jeder OPU-Sitzung waren 6 Tiere als Eizelldonoren eingesetzt. An drei der 26 durchgeführten Gewinnungstermine fiel jeweils ein Tier pro Termin auf Grund mangelnder Allgemeingesundheit bzw. mangelnder Möglichkeit zum Vorlagern des Ovars vor den Ultraschallkopf aus. Komplikationen bedingt durch die durchgeführte Epiduralanästhesie konnten nicht beobachtet werden. Selten kam es nach der Follikelpunktion zu einer Hämatombildung in einzelnen Follikeln.
4.1.1.1 Ergebnisse zu den punktierten Follikeln
Während der 26 Punktionstermine wurden 746 Follikel ab einer Größe von 3 mm punktiert. Pro Tier und Termin ergab sich daraus eine Zahl von 4,9 ± 2,9 Follikeln ( ± s), je Tier und Woche durchschnittlich 6,7 Follikel. Dreihundertzweiundvierzig dieser punktierten Follikel waren per Ultraschall als durchblutet erkennbar, 387 zeigten keine Durchblutung in der Follikelwand.
In den 15 OPU-Sitzungen im Intervall von 3 - 4 Tagen konnten 473 Follikel punktiert (4,3 ± 3,0 pro Tier und Termin; ± s) werden, in den 11 OPU-Sitzungen in einem Intervall von 7 Tagen konnten 273 Follikel punktiert (5,4 ± 2,7 pro Tier und Termin;
± s) werden (siehe Tabelle 15).
Die durchschnittliche Größe der punktierten Follikel betrug bei einem Intervall von 3 - 4 Tagen zwischen den OPU-Sitzungen 5,0 mm (± 1,9 mm; ± s) und in einem Intervall von 7 Tagen 5,5 mm (± 2,8 mm; ± s).
Punktions-intervall
Durchblutungs-status Gesamt /
Durchschnitt
I2 I1 + -
OPU-Sitzungen (n) 26 15 11 --- ---
Punktierte Follikel (n) 746 473 273 351 395 Punktierte Follikel je
Tier und Termin 4,9 4,3 5,4 --- ---
(I2/I1 = Punktion 2x bzw. 1x wöchentlich; + = erkennbar durchblutete Follikel, - = nicht erkennbar durchblutete Follikel; Standardabweichungen siehe Text)
Die in Kapitel 9.3.1 befindliche Tabelle 64 zeigt eine Übersicht über die Größen, das Punktionsintervall und den Durchblutungsstatus der punktierten Follikel.
Wie in Tabelle 16 aufgeführt, hatten unabhängig vom Punktionsintervall oder dem Durchblutungsstatus 90,1 % der punktierten Follikel einen Durchmesser von 3 - 8 mm.
Tabelle 16: Anzahl der punktierten Follikel nach den Größengruppen 3 – 8 mm und > 8 mm
Follikelgröße 3 - 8 mm >8 mm
Anzahl (n) 672 74
Prozent (%) 90,1 9,9
4.1.1.1.1 Ergebnisse mit Fokus auf das Punktionsintervall zwischen den OPU-Sitzungen
Mit der Steigerung des Intervalls zwischen den OPU-Sitzungen von 3 - 4 auf 7 Tage stieg der Anteil an größeren Follikeln (> 8 mm Durchmesser) signifikant (p ≤ 0,001).
3 - 8 mm Durchmesser und > 8 mm und dem Punktionsintervall ist in der Tabelle 17 dargestellt.
Tabelle 17: Häufigkeiten der punktierten Follikel in den Größenklassen 3 - 8 mm und
> 8mm, aufgeschlüsselt nach dem Intervall der OPU-Sitzungen
Punktionsintervall
I2 I1
Follikelgröße
Gesamt-Follikelzahl
(n) n % n %
3 - 8 mm 672 446 66,4a 226 33,6b
> 8 mm 74 27 36,5a 47 63,5b
Summe 746 473 --- 273 ---
(I2/I1 = Punktion 2x bzw. 1x wöchentlich; a:b; P ≤ 0,05)
Bei Berücksichtigung der punktierten Follikel der einzelnen Versuchstiere unter Ausschluss der Erstpunktion stellte sich heraus, dass bei der Punktion in einem Intervall von 3 - 4 Tagen durchschnittlich 20 % der Tiere (± 23; ± s) zum Zeitpunkt der Punktion einen Follikel der Größe eines dominanten Follikels aufwiesen, wohingegen es im Intervall von 7 Tagen 49 % der Tiere (± 34; ± s) waren. Somit war auch unter Ausschluss der Erstpunktion ein signifikanter Einfluss des Punktionsintervalls auf das Vorliegen eines dominanten Follikels gegeben (P ≤ 0,001).
Punktionsintervall ist in der folgenden Abbildung 32 dargestellt.
0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Follikeldurchmesser (mm)
Prozent (%)
Abbildung 32: Häufigkeitsverteilung der punktierten Follikel mit Aufschlüsselung nach dem Punktionsintervall zwischen den OPU-Sitzungen
(n = 746; Punktionsintervall 3 - 4 Tage= helle Balken, Punktionsintervall 7 Tage = dunkle Balken)
4.1.1.1.2 Ergebnisse mit Fokus auf den Durchblutungsstatus der Follikel
Der Durchblutungsstatus der Follikel wird signifikant beeinflusst (P ≤ 0,001) durch die Größe des Follikels (bezogen auf > bzw. ≤ 8 mm). Die Signifikanz dieses Einflusses bleibt auch bei einer Aufschlüsselung der Daten nach den unterschiedlichen Punktionsintervallen erhalten (mit P ≤ 0,003 leicht abgeschwächt im Intervall von 3 - 4 Tagen). Die grundlegenden Daten dazu finden sich in Tabelle 18.
Tabelle 18: Häufigkeiten der punktierten Follikel in den Größenklassen 3 - 8 mm und
> 8mm, aufgeschlüsselt nach dem Durchblutungsstatus der Follikel
Durchblutungsstatus
+ -
Follikelgröße (mm)
Gesamt-Follikelzahl
(n) n % n %
3 - 8 mm 672 289 43,0a 383 57,0b
> 8 mm 74 62 83,8a 12 16,2b
Summe 746 351 --- 395 ---
(+ = erkennbar durchblutete Follikel, - = nicht erkennbar durchblutete Follikel; a:b; P ≤ 0,05)
4.1.1.1.3 Ergebnisse bezogen auf das Punktionsintervall der OPU-Sitzungen und den Durchblutungsstatus der Follikel
Ein nachweisbarer Einfluss des Punktionsintervalls auf die Durchblutung besteht nicht. Eine Gegenüberstellung der punktierten Follikel nach Intervall und Durchblutung ist in Tabelle 19 zu sehen. Es besteht kein signifikanter Einfluss des Punktionsintervalls auf den Durchblutungsstatus der Follikel.
Tabelle 19: Häufigkeiten der punktierten Follikel aufgeschlüsselt nach dem Punktionsintervall der OPU-Sitzungen und dem Durchblutungsstatus der Follikel
Durchblutungsstatus
+ -
Punktions-intervall
Gesamt-Follikelzahl
(n)
n % n %
I2 473 218 62,1 255 64,6
I1 273 133 37,9 140 35,4
Summe 746 351 100 395 100
(I2/I1 = Punktion 2x bzw. 1x wöchentlich; + = erkennbar durchblutete Follikel, - = nicht erkennbar durchblutete Follikel)
4.1.1.2 Ergebnisse zu den gewonnenen KOK
Aus den Punktaten der 746 Follikel konnten 318 KOK gefunden werden. Die durchschnittliche Wiederfindungsrate (= gefundene KOK / punktierte Follikel) betrug 42,6 % (± 2,4 SEM). Die aufgenommenen Parameter (Punktionsintervall und Durchblutungsstatus) der punktieren Follikel zeigten keinen signifikanten Einfluss auf die Wiederfindungsrate.
In den 15 OPU-Sitzungen im Intervall von 3 - 4 Tagen konnten 473 Follikel punktiert und 184 KOK gefunden werden (WR= 38,9 % ± 1,8; ± SEM), in den 11 OPU-Sitzungen in einem Intervall von 7 Tagen konnten 273 Follikel punktiert und 134 KOK gefunden werden (WR= 49,1 % ± 2,8; ± SEM). Differenziert nach dem Durchblutungsstatus ergeben sich Wiederfindungsraten von 36,8 % (± 4,7 SEM) für erkennbar durchblutete Follikel und solche von 47,8 % (± 4,5 SEM) für nicht erkennbar durchblutete Follikel. In der statistischen Prüfung zeigten sich die Ergebnisse als ähnlich.
Eine Übersicht über die Daten gibt Tabelle 20:
Tabelle 20: Übersicht über die Wiederfindungsraten nach den OPU-Sitzungen, differenziert nach dem Punktionsintervall und dem Durchblutungsstatus der Follikel
Gesamt Punktionsintervall Durchblutungsstatus (I2/I1 = Punktion 2x bzw. 1x wöchentlich; + = erkennbar durchblutete Follikel,
Die Klassifizierungen der aus dem OPU gewonnenen KOK sind in Tabelle 21 dargestellt.
Tabelle 21: Übersicht über die morphologische Klassifizierung der per OPU gewonnenen KOK
(I2/I1 = Punktion 2x bzw. 1x wöchentlich; + = erkennbar durchblutete Follikel, - = nicht erkennbar durchblutete Follikel, KOK = Kumulus-Oozyten-Komplexe,
IVP = In-vitro-Produktion)
Als IVP tauglich (Klassen I-III) erwiesen sich 89 % der gewonnenen KOK (siehe Tabelle 21). Aus der Analyse der Daten ergab sich kein signifikanter Einfluss des Punktionsintervalls oder der Durchblutung auf die Einordnung der KOK nach IVP-Tauglichkeit.
in die Klassifizierungen I-IV und V nach der Durchblutung aufgeführt. Eine statistische Analyse der Daten zeigte einen signifikanten Einfluss der Durchblutung auf die Einordnung in die aufgeführten Klassen (a:b; P ≤ 0,05). Dabei enthielten Follikel mit nicht erkennbarer Durchblutung signifikant häufiger KOK der Klasse V.
Tabelle 22: Übersicht zu den per OPU gewonnenen KOK differenziert nach der Expansion der Kumuluszellen und dem Durchblutungsstatus der punktierten Follikel
Klassifizierungen
I-IV V
Durch-
blutungs-status
Gesamtzahl KOK (n)
% n % n
+ 125 96,8a 121 3,2b 4
- 193 91,2a 176 8,8b 17
(+ = erkennbar durchblutete Follikel, - = nicht erkennbar durchblutete Follikel, KOK = Kumulus-Oozyten-Komplexe, a:b;P≤ 0,05)
Ein signifikanter Einfluss des Punktionsintervalls auf die Expansion der Kumuluszellen der KOK konnte nicht festgestellt werden.
4.1.2 Ergebnisse aus der IVP
Von den durch die OPU-Sitzungen gewonnenen KOK wurden 256 in die IVP eingebracht. In der IVP teilten sich 138 der kultivierten vermeintlichen Zygoten, woraus sich eine durchschnittliche Teilungsrate von 53,9 % (± 16,8; ± SEM)ergab.
Bis zum Tag 8 nach Fertilisation entwickelten sich 55 Zygoten zu Morulae und Blastozysten, was eine durchschnittliche Entwicklungsrate von 21,5 % (± 8,8; ± SEM) ausmachte. Ein signifikanter Einfluss des Punktionsintervalls oder des Durchblutungsstatus der Follikel ließ sich in der statistischen Analyse der Daten nicht erkennen. Die Ergebnisse aus der IVP sind differenziert nach dem Punktionsintervall in Tabelle 23 und differenziert nach Durchblutung in der Tabelle 24 dargestellt:
Tabelle 23: Ergebnisse aus der IVP der OPU-KOK, aufgeschlüsselt nach dem Punktionsintervall zwischen den OPU-Sitzungen
Punktionsintervall
I2 I1
n % ± s n % ± s
KOK in der IVP 144 --- --- 112 --- ---
Teilungen 79 54,9 19,4 59 52,7 16,5
Entwicklung 34 23,6 6,4 21 18,8 9,9
(I2/I1 = Punktion 2x bzw. 1x wöchentlich, IVP = In-vitro-Produktion, KOK = Kumulus-Oozyten-Komplexe)
Tabelle 24: Ergebnisse aus der IVP der OPU-KOK, aufgeschlüsselt nach dem Durchblutungsstatus der Herkunftsfollikel
Durchblutungsstatus
+ -
n % ± s n % ± s
KOK in der IVP 109 --- --- 147 --- ---
Teilungen 59 54,1 23,1 79 53,7 20,7
Entwicklung 27 24,8 14,2 28 19,0 10,4
(+ = erkennbar durchblutete Follikel, - = nicht erkennbar durchblutete Follikel,
Die Daten aus der IVP aufgeschlüsselt sowohl nach dem Durchblutungsstatus der Herkunftsfollikel als auch nach dem Punktionsintervall finden sich in Tabelle 25.
Tabelle 25: Ergebnisse aus der IVP der OPU-KOK, aufgeschlüsselt nach dem Punktionsintervall zwischen den OPU-Sitzungen und dem Durchblutungsstatus der
Herkunftsfollikel
Punktionsintervall
I2 I1
+ - + -
Durchblutungs-status n/% ± s n/% ± s n/% ± s n/% ± s
KOK in der IVP 63 --- 81 --- 46 --- 66 ---
Teilungsrate (%) 54,0 25,7 55,6 18,4 54,3 20,5 51,5 23,9 Entwicklungsrate (%) 25,4 a 16,2 22,2 a 9,9 23,9 a 12,0 15,2 b 9,4
(I2/I1 = Punktion 2x bzw. 1x wöchentlich; a:b;P≤ 0,05, IVP = In-vitro-Produktion, KOK = Kumulus-Oozyten-Komplexe)
Die statistische Analyse ergab einen signifikant negativen Einfluss (a:b; P ≤ 0,05) einer nicht nachweisbaren Durchblutung auf die Entwicklungsrate, wenn die KOK in einem Intervall von 7 Tagen gewonnen wurden.
4.1.3 Ergebnisse aus der Analyse der mRNA-Expression verschiedener Gene
Da im Ergebnisteil der Übersicht halber nur Vergleiche der relativen mRNA-Gehalte der Proben gezeigt werden sollen, finden sich die absoluten Daten zu den Ergebnissen im Kapitel 9.3. Der statistische Vergleich der Ergebnisse wurde mit den arithmetischen Mittelwerten und den Standardfehlern durchgeführt.
4.1.3.1 Analyse der unreifen Eizellen
In den Untersuchungen der mRNA-Gehalte in den unreifen Eizellen (n=39) wurden die Einflüsse der Punktionsintervalle und des Durchblutungsstatus berücksichtigt.
Eine statistische Auswertung der Einflüsse der Parameter auf die mRNA-Expression der analysierten Gene ist in der Tabelle 26 dargestellt.
Tabelle 26: Übersicht über die Einflüsse auf die untersuchten mRNA-Gehalte in den analysierten unreifen Eizellen
Einflussfaktor
HSP70 ZAR1 BMP15 GDF9 DNMT1A DNMT1B DNMT3A HDAC2
Punktions-intervall nsig sig sig sig sig ns sig sig
Durchblutungs-status nsig nsig nsig nsig nsig nsig nsig nsig Interaktion der
Parameter nsig nsig nsig nsig nsig nsig nsig nsig Untersuchte
Proben (n) 39 39 39 35 39 38 39 39
(sig = signifikant [P ≤ 0,05], nsig = nicht signifikant)
Das Punktionsintervall der durchgeführten OPU-Sitzungen (3 - 4 Tage vs. 7 Tage) zeigte in den Auswertungen einen signifikanten Einfluss auf die mRNA-Gehalte von ZAR1, BMP15, GDF9, DNMT1A, DNMT3A und HDAC2. Jene von HSP70 und DNMT1b zeigten sich nicht signifikant beeinflusst. Ebenso nicht signifikant beeinflusst waren alle untersuchten mRNA-Gehalte durch den Durchblutungsstatus ihrer Herkunftsfollikel. Desgleichen war eine signifikante Interaktion beider
Gehalte der jeweiligen, signifikant beeinflussten Gene in unreifen Eizellen der unterschiedlichen Gruppen nach dem Punktionsintervall und dem Durchblutungsstatus des Herkunftsfollikels aufgeschlüsselt dargestellt.
Für ZAR1 zeigte sich ein Einfluss des Intervalls der OPU-Sitzungen auf den mRNA-Gehalt. Dieser Einfluss erwies sich als signifikant zwischen den Eizellen aus dem Gewinnungsintervall von 7 Tagen und jenen Eizellen, die zweimal in der Woche aus Follikeln ohne erkennbare Durchblutung gewonnen wurden (P ≤ 0,05).
Ein Unterschied des mRNA-Gehaltes für ZAR1 der Eizellen, die zweimal in der Woche aus Follikeln mit erkennbarer Durchblutung gewonnen wurden, zu jenen aus den Gruppen der einmal in der Woche gewonnenen, war nicht erkennbar.
ZAR1
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 1,60 1,80 2,00
-1 +1 -2 +2
Relativer Transkriptgehalt
Abbildung 33: Die relativen mRNA-Gehalte von ZAR1 in den unreifen Oozyten der untersuchten Gruppen
(+ bzw. – stehen für eine erkennbare bzw. nicht erkennbare Durchblutung, die Ziffern 1 und 2 für die Anzahl der OPU-Sitzungen pro Woche; a:b;P≤ 0,05, n = 39)
a
a
b ab
zwischen den Eizellen aus dem Gewinnungsintervall von 7 Tagen und jenen Eizellen, die zweimal in der Woche aus Follikeln ohne erkennbare Durchblutung gewonnen wurden (P ≤ 0,05). Der Einfluss des Punktionsintervalls auf den mRNA-Gehalt für Eizellen, die zweimal in der Woche aus Follikeln mit erkennbarer Durchblutung gewonnen wurden gegenüber jenen aus den Gruppen der einmal in der Woche gewonnenen, war nur tendentiell ausgeprägt (P ≤ 0,1).
BMP15
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40
-1 +1 -2 +2
Relativer Transkriptgehalt
Abbildung 34: Die relativen mRNA-Gehalte von BMP15 in den unreifen Oozyten der untersuchten Gruppen
(+ bzw. – stehen für eine erkennbare bzw. nicht erkennbare Durchblutung, die Ziffern 1 und 2 für die Anzahl der OPU-Sitzungen pro Woche; a:b;P≤ 0,05, n = 39)
a a
b ab
Woche aus Follikeln mit erkennbarer Durchblutung gewonnen wurden, gegenüber jenen aus den Gruppen der einmal in der Woche gewonnenen signifikant (P ≤ 0,05).
GDF9
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50
-1 +1 -2 +2
Relativer Transkriptgehalt
Abbildung 35: Die relativen mRNA-Gehalte von GDF9 in den unreifen Oozyten der untersuchten Gruppen
(+ bzw. – stehen für eine erkennbare bzw. nicht erkennbare Durchblutung, die Ziffern 1 und 2 für die Anzahl der OPU-Sitzungen pro Woche; a:b;P≤ 0,05, n = 35)
a
ab
b b
DNMT1A war nur bei Eizellen erkennbar, die aus Follikeln ohne erkennbare Durchblutung gewonnen wurden (P ≤ 0,05).
DNMT1A
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40
-1 +1 -2 +2
Relativer Transkriptgehalt
Abbildung 36: Die relativen mRNA-Gehalte von DNMT1A in den unreifen Oozyten der untersuchten Gruppen
(+ bzw. – stehen für eine erkennbare bzw. nicht erkennbare Durchblutung, die Ziffern 1 und 2 für die Anzahl der OPU-Sitzungen pro Woche; a:b;P≤ 0,05, n = 39)
a ab
b
ab
DNMT3A war ebenfalls nur bei Eizellen erkennbar, die aus Follikeln ohne erkennbare Durchblutung gewonnen wurden (P ≤ 0,05).
DNMT3A
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 0,80 0,90
-1 +1 -2 +2
Relativer Transkriptgehalt
Abbildung 37: Die relativen mRNA-Gehalte von DNMT3A in den unreifen Oozyten der untersuchten Gruppen
(+ bzw. – stehen für eine erkennbare bzw. nicht erkennbare Durchblutung, die Ziffern 1 und 2 für die Anzahl der OPU-Sitzungen pro Woche; a:b;P≤ 0,05, n = 38)
a
ab
b
ab
einen signifikanten Einfluss nur bei Eizellen, die aus Follikeln ohne erkennbare Durchblutung gewonnen wurden (P ≤ 0,05). Ferner besteht ein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen der Eizellen aus Follikeln ohne erkennbare Durchblutung bei einmal wöchentlicher OPU-Sitzung und jenen aus Follikeln mit erkennbarer Durchblutung bei zweimal wöchentlich stattfindender OPU-Sitzung.
Ebenso verhält es sich zwischen Eizellen aus der Gruppe der einmal pro Woche aus erkennbar durchbluteten Follikeln gewonnenen und jenen aus der Gruppe der zweimal je Woche aus nicht erkennbar durchbluteten Follikeln gewonnenen.
HDAC2
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 1,60
-1 +1 -2 +2
Relativer Transkriptgehalt
Abbildung 38: Die relativen mRNA-Gehalte von HDAC2 in den unreifen Oozyten der untersuchten Gruppen
(+ bzw. – stehen für eine erkennbare bzw. nicht erkennbare Durchblutung, die Ziffern 1 und 2 für die Anzahl der OPU-Sitzungen pro Woche; a:b;P≤ 0,05, n = 39)
a
ac
b bc
4.1.3.2 Analyse der Blastozysten
Für die Untersuchungen der mRNA-Gehalte in den Blastozysten (n = 24) wurden ebenfalls die Einflüsse der Punktionsintervalle und des Durchblutungsstatus berücksichtigt.
In der Tabelle 27 sind die Einflüsse der Parameter auf die mRNA-Expression der analysierten Gene dargestellt.
Es zeige sich eine signifikante Beeinflussung des mRNA-Gehaltes von G6PD. In Bezug auf dieses Transkript konnte ebenfalls eine signifikante Interaktion der Parameter des Punktionsintervalls und der Durchblutung festgestellt werden. Ein
Es zeige sich eine signifikante Beeinflussung des mRNA-Gehaltes von G6PD. In Bezug auf dieses Transkript konnte ebenfalls eine signifikante Interaktion der Parameter des Punktionsintervalls und der Durchblutung festgestellt werden. Ein