OPU

Die Bestimmung der Durchblutung wurde in den OPU-Sitzungen durchgeführt. Sie fand im CF-Modus und damit nur qualitativ statt, da dieser im Vergleich zum

den Einstellungen des Gerätes und dem Gerät an sich abhängig. Die hier genutzten Einstellungen waren wie bereits erwähnt darauf ausgelegt, eine artefaktfreie Darstellung der Follikelwanddurchblutung zu gewährleisten. Die erhöhte Sensitivität der Messmethode ist insbesondere für die Durchblutungsmessung an kleinen Follikeln vonnöten (s.u.).

Die in dieser Studie nicht mögliche quantitative Ermittlung der Durchblutung hätte den Vorteil geboten, auch retrospektiv einen etwaigen Zusammenhang zwischen der Qualität der KOK und der Durchblutung nachvollziehen zu können. Es hätte eventuell eine Durchblutungsstärke ermitteln werden können, ab dem sich die Durchblutung auf die Entwicklungskompetenz auswirkt. Solch quantitative Untersuchungen haben in präovulatorischen Follikeln beim Rind stattgefunden (ACOSTA et al. 2003;

ACOSTA et al. 2005; SIDDIQUI et al. 2009a; SIDDIQUI et al. 2009b).

Eine weitere Möglichkeit, die Follikelwanddurchblutung - wenn auch nur semiquantitativ - festzustellen, ist die Messung des Grades der circumferenten Durchblutung. Dazu wird bestimmt, in wie vielen Abschnitten um die Follikelhöhle herum eine Durchblutung erkennbar ist. Diese Methode wurde in einigen Arbeiten in der Humanmedizin zum Thema Follikelwanddurchblutung und Fertilität durchgeführt (CHUI et al. 1997; BHAL et al. 1999; COULAM et al. 1999; BHAL et al. 2001;

O'LEARY et al. 2009). Allerdings wurden die teilnehmenden Patientinnen im Gegensatz zu dieser Studie einer hormonellen Stimulation unterzogen. In der hier durchgeführten Studie war diese Methode der Messung ebenfalls auf Grund der geringgradigen Durchblutung der Follikel nicht möglich.

Während der OPU-Sitzung wurde sich dann zunächst ein Überblick über die Lage, Anzahl und Größe der Follikel verschafft, um einer Verwechslung nach der Durchblutungsbestimmung vorzubeugen. Positiv für eine solche Übersicht war sicherlich die Tatsache, dass die Anzahl von Follikeln je Ovar sich sehr begrenzt zeigte. Auf den Überblick folgte dann die Ermittlung des Durchblutungsstatus. Eine erkennbare Durchblutung äußerte sich in Farbimpulsen im CF-Modus, der mehrfach, an selber Stelle und in direkter Anlehnung zur Follikelhöhle auftrat. Eine erkennbare Durchblutung wurde erst ausgeschlossen, wenn der Follikel bei Betrachtung aus mindestens zwei unterschiedlichen Schallwinkeln keine solchen Farbimpulse zeigte.

Die Betrachtung aus zwei Schallwinkeln sollte die Möglichkeit, die Gefäße im 90°-Winkel zu beobachten, und damit eine falsch neg ative Aussage über den Durchblutungsstatus zu treffen minimieren. Aus mehr unterschiedlichen Winkeln zur vollständigen Minimierung dieser Fehlerquelle wurde der Follikel nicht betrachtet, da die Bestimmung der Durchblutung schnellstmöglich durchgeführt werden musste, um eine manipulationsbedingte Verstärkung der Durchblutung und somit Verfälschung der Ergebnisse zu umgehen. Im weiteren Verlauf der OPU-Sitzung wurden zunächst die als durchblutet erkannten Follikel und dann jene ohne erkennbare Durchblutung zusammen abgesaugt.

Im Hauptversuch dieser Studie wurden 26 OPU-Sitzungen durchgeführt und eine Anzahl von 4,9 Follikeln pro Termin und Tier bei einem Intervall von 3 - 4 Tagen und ca. 6,7 je Tier und Woche punktiert. Diese Anzahl erscheint relativ niedrig. So konnten in einer Studie ebenfalls bei Holstein Friesian bei der Punktion von Follikeln ab einer Größe von 5 mm durchschnittlich 15,7 (± 3,3 SEM, n = 4) pro Tier und Woche abgesaugt werden (STUBBINGS u. WALTON 1994). In einer weiteren Studie konnten bei zwei Mal in der Woche durchgeführter Punktion von Follikeln mit einer Größe von 2 - 8 mm in Färsen (n = 8) durchschnittlich 10,4 und laktierenden Kühen (n = 8) 7,8 Follikel je Tier und Termin punktiert werden, was eine Zahl von 20,8 bzw.

15,6 pro Tier und Woche ergibt (RIZOS et al. 2005). Auch in anderen Versuchen wurden mehr Follikel als in den von uns genutzten Tieren auf dem Ovar vorgefunden (DE ROOVER et al. 2008; DING et al. 2008). Die Ursache für die in diesem Versuch geringe Anzahl von Follikeln zum Zeitpunkt der Punktion ist nicht bekannt, sie könnte multifaktoriell bedingt sein. So haben unter anderem das individuelle Tier (GALLI et al. 2001; TAMASSIA et al. 2003; DING et al. 2008), der Ernährungszustand (DOMÍNGUEZ 1995) und das Alter bezogen auf die Entwicklung des Tieres (GALLI et al. 2001) einen Einfluss auf die Anzahl der Follikel auf den Ovarien. Eine etwaige Beeinflussung der Follikelzahl durch subklinische Erkrankungen (SCHRICK et al.

2001) konnten wir nicht ausschließen.

Wird die Zahl der durchschnittlich abgesaugten Follikel nach dem Punktionsintervall aufgesplittet betrachtet, so zeigt sich, dass je Tier und Termin bei einem Intervall von

Intervall von 3 - 4 Tagen. Werden die Zahlen jedoch auf der Basis der punktierten Follikel pro Tier und Woche betrachtet, zeigt sich das Modell des zweifach in der Woche durchgeführten OPU als Erfolg versprechender. In dieser Studie konnten durchschnittlich 8,6 Follikel statt 5,1 bei 7-tägigem Intervall abgesaugt werden.

Dieses Phänomen wurde in anderen Untersuchungen ebenfalls beschrieben (HANENBERG u. VAN WAGTENDONK-DE LEEUW 1997; GARCIA u.

SALAHEDDINE 1998; GOODHAND et al. 1999; CHAUBAL et al. 2006; LOPES et al.

2006).

Etwaig abgesaugte Follikel die sich mit Blut gefüllt hatten, gingen nicht in die Auswertungen mit ein, sie wurden bei der Punktion auf Grund abweichender Farbe des Punktates als solche erkannt. Trotz dieser selten auftretenden Follikelhämatomen als Nebenwirkungen (PIETERSE et al. 1988; VAN DER SCHANS et al. 1991; PETYIM et al. 2000; CHASTANT-MAILLARD et al. 2003) und der über längere Zeit auftretenden Veränderungen wie Verdickung der Tunica albuginea und geringgradige Verhärtung der Ovarien (PETYIM et al. 2001), konnten in verschiedenen Studien keine Auswirkungen des OPU auf die follikuläre oder luteale Funktion der Ovarien (BROADBENT et al. 1997; MCEVOY et al. 2002) oder auf den Reproduktionstrakt im Allgemeinen beobachtet werden (BONI et al. 1997).

Die Größenverteilung der punktierten Follikel zeigte eine sinkende Menge an Follikeln mit steigender Größe, wie in der Literatur beschrieben (PIERSON u.

GINTHER 1987). Ferner entspricht dieser Befund den Vorstellungen der Follikelentwicklung in Wellen und der Selektion eines ovulatorischen Follikels.

Von den abgesaugten Follikeln hatten 90,1 % einen Durchmesser von 3 - 8 mm, was in etwa vergleichbar mit den Ergebnissen anderer Forschergruppen ist (BONI et al.

1997). Follikel einer solchen Größe sind noch nicht dominant (GINTHER et al. 1996), aber bereits so weit entwickelt, dass sie eine in der IVP entwicklungskompetente Oozyte enthalten (FAIR et al. 1995; HYTTEL et al. 1997). Beim OPU lassen sich auch KOK aus kleineren Follikeln gewinnen, deren Entwicklungskompetenz dann aber als eingeschränkt gilt (BLONDIN u. SIRARD 1995).

Die Vergrößerung der Follikel bei verlängertem Punktionsintervall lässt sich mit einer verlängerten Wachstumsphase erklären und ist in der Literatur beschrieben

(CHAUBAL et al. 2006). So überrascht es auch nicht, dass bei einem Intervall von 7 Tagen im Vergleich zum 3 - 4-Tages-Intervall der Anteil von Follikeln mit einem Durchmesser von mehr als 8 mm und damit dominanten Follikeln signifikant erhöht ist. Diese sind von Bedeutung, da sie das Wachstum der restlichen Follikel unterdrücken und deren Atresie einleiten (MATTON et al. 1981). Als Effekt der DF auf die Oozyten aus diesen subordinaten Follikeln wird die Herabsetzung der Entwicklungskompetenz beschrieben (HAGEMANN 1999).

Die Häufigkeit der Anwesenheit eines Follikels mit einer Größe von mindestens 9 mm in einem Versuchstier zum Zeitpunkt des OPU von 20 % bei einem Punktionsintervall von 3 - 4 Tagen bzw. 49 % bei einem Punktionsintervall von 7 Tagen ab der zweiten Punktion erscheint hoch. Angaben aus Studien, in denen ebenfalls die Häufigkeit der Punktion größerer Follikel angegeben ist, finden sich in Tabelle 31.

Tabelle 31: Häufigkeiten der Follikel mit einem Durchmesser von über 8 mm in anderen OPU-Studien

Referenz Punktionsintervall Follikelgröße Häufigkeit (%)

BONI et al. 1997 3 Tage > 9 mm 1,2

BONI et al. 1997 4 Tage > 9 mm 4,9

BONI et al. 1997 5 Tage > 9 mm 11,3

CHAUBAL et al. 2006 3 - 4 Tage > 10 mm 1,0 CHAUBAL et al. 2006 7 Tage > 10 mm 10,0

Die in der vorliegenden Studie beobachteten Häufigkeiten der Follikel mit einer Größe, die für deren Dominanz spricht, müssen sich nach der Punktion durch hohe Wachstumsraten gebildet haben, da in diese Auswertung nur Werte aus Punktionen ab dem zweiten Termin mit einbezogen wurden. Ein solch starkes Wachstum von einigen Millimetern je Tag wurde bereits in einer anderen Studie beobachtet (PETYIM et al. 2000).

Der hier nachgewiesene Einfluss der Größe des Follikels auf seine Durchblutung

Follikel während der Dominanzbildung als Limitierung an, die Blutflussgeschwindigkeit in den Wandgefäßen zu bestimmen. Allerdings findet sich keine Studie, in der eine direkte Untersuchung des Zusammenhangs zwischen Durchblutung und Durchmesser des Follikels durchgeführt wurde. Jedoch gibt es weitere Hinweise auf diesen Zusammenhang. Beispielsweise wurde in Untersuchungen aus der Humanmedizin beobachtet, dass der Anteil an gut durchbluteten Follikeln (circumferente Durchblutung des Follikels > 25 %) mit der Größe steigt (SHRESTHA et al. 2006). Auch die steigende Angiogenese während des Wachstums (JIANG et al. 2003) weist darauf hin, dass die Gesamtfläche des Gefäßquerschnitts während des Wachstums zunimmt. Im Tertiärfollikel nimmt nur eines der zuführenden Gefäße an Größe zu (KÖNIG et al. 1988). Dieses Gefäß wäre damit in einem wachsenden Follikel im zeitlichen Verlauf als erste vaskuläre Struktur eines Follikels erkennbar, sobald es einen bestimmten, detektierbaren Mindestquerschnitt erreicht hat. Der Anteil der Follikel mit einem detektierbaren Mindestquerschnitt in jenem Gefäß könnte in den kleineren Follikeln (3 - 4 mm) noch relativ gering sein, sollte aber mit steigendem Durchmesser der Follikel zunehmen.

Gerade unter den kleinen Follikeln könnte die in dieser Studie angewandte Differenzierung des Durchblutungsstatus entscheidend beeinflusst sein durch die Stärke des Blutflusses in der Wand individueller und später eventuell dominanter Follikel. Es wurde bereits ein Zusammenhang zwischen der Fähigkeit zur Dominanzbildung eines Follikels und dessen erhöhter Blutversorgung beobachtet (ACOSTA et al. 2005; GRAZUL-BILSKA et al. 2007).

Ein weiterer Faktor, der die Durchblutung des Follikels beeinflusst, ist die Atresie.

Eine fortschreitende Atresie wirkt sich in Schaffollikeln stark verringernd (Faktor 8 - 10) auf den Blutfluss in den follikulären Gefäßen aus (BROWN u.

DRIANCOURT 1989). Auf Grund der nachgewiesenen Kapillarrückbildung und verminderten Gesamtgefäßfläche in der Theka interna in atretischen Follikeln (JIANG et al. 2003) beim Rind, könnte parallel zum Schaf der Blutfluss in bovinen Follikeln ebenfalls verringert sein.

Somit wird der Blutfluss in den in dieser Studie untersuchten Follikeln unter anderem durch diese zwei konträr wirkenden Faktoren des Wachstums und der Atresie

beeinflusst. Die Stärke der Einwirkung dieser Faktoren war mit den in dieser Untersuchung angewandten Mitteln nicht zu ermitteln.

Ein Ansatz, der es ermöglicht hätte, die etwaige gegebene Unterschreitung des Mindestquerschnittes der Gefäße für eine Detektion zu umgehen, wäre eine Heraufsetzung des Mindestmaßes der zu punktierenden Follikel gewesen. In dem Fall wäre eine ausschließliche Untersuchung des Einflusses von Atresie auf die Durchblutung möglich gewesen. Diese Abänderung des Versuchsaufbaus hätte jedoch die praktische Anwendbarkeit verfälscht.

Die durchschnittliche Wiederfindungsrate von 42,6 % in dieser Studie liegt im unteren Durchschnitt. In der Literatur werden solche zwischen 41 % und 88 % erwähnt (PIETERSE et al. 1991b; LONERGAN et al. 1994; LANSBERGEN et al. 1995;

GOODHAND et al. 1999; SENEDA et al. 2001). Dabei wird die Wiederfindungsrate - wie bereits in Kapitel 2.2.3 erwähnt - beeinflusst sowohl von spezifischen Faktoren der Durchführung des OPU (LANSBERGEN et al. 1995; HASHIMOTO et al. 1999) als auch von individuellen Parametern des Follikels, wie dessen Größe (PIETERSE et al. 1991b; FRY et al. 1994; LONERGAN et al. 1994; GOODHAND et al. 1999;

SENEDA et al. 2001). Die Wiederfindungsrate sinkt mit steigender Größe des Follikels, unabhängig davon, ob die KOK per OPU-Equipment oder durch eine Aspiration aus Ovarien vom Schlachthof gewonnen werden.

Ein signifikanter Einfluss des Intervalls auf die Wiederfindungsrate in den jeweiligen Gruppen war nicht erkennbar. Dies entspricht den Befunden in anderen Studien (GIBBONS et al. 1994; GARCIA u. SALAHEDDINE 1998; GOODHAND et al. 1999).

Das Punktionsintervall und die Durchblutung hatten weiterhin keinen signifikanten Einfluss auf die Einordnung der für die IVP genutzten KOK in die einzelnen Klassifizierungsgruppen. Damit wird ein Einfluss der morphologischen Klassifizierung auf die Ergebnisse in der IVP ausgeschlossen.

Allerdings war ein signifikanter Einfluss der Durchblutung auf die Anzahl der KOK mit expandierten Kumuluszellen, also der Klasse V erkennbar. So war der Anteil an KOK der Klasse V erhöht, wenn die KOK aus Follikeln ohne erkennbare Durchblutung stammten. Diese KOK mit expandiertem Kumulus sind in ihrer Einordnung in das

da sie weitgehend unabhängig von der Menge an Kumuluszelllagen der Klasse V zugeordnet werden. Die vorliegende Expansion der Kumuluszellen kann sowohl ein Hinweis auf eine etwaige Reifung der Eizellen sein (HYTTEL et al. 1997), als auch auf eine Atresie der KOK (ASSEY et al. 1994; BLONDIN u. SIRARD 1995). Die Vermutung liegt nahe, dass jene KOK der Klasse V aus Follikeln mit fortgeschrittener Atresie stammten, da die Follikel keine erkennbare Durchblutung zeigten.

Der Anteil von 89 % IVP-tauglicher KOK ist mit den Befunden in den bisherigen Veröffentlichungen vergleichbar (HENDRIKSEN et al. 2004; MACHATKOVA et al.

2004). Die Vergleichsmöglichkeiten mit anderen Studien sind jedoch auf Grund unterschiedlicher Klassifizierung der KOK und Selektionsintensität sehr begrenzt.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Punktionsintervall der durchgeführten OPU-Sitzungen die Größe, Anzahl und Durchblutung der vorliegenden Follikel beeinflusst. Die Durchblutung der punktierten Follikel wird im Anteil an expandierten unter den gewonnenen KOK widergespiegelt.