Messenger RNA-Expressionsmuster

Die Real-time RT-PCR ist die bevorzugte Methode für die Ermittlung quantitativer mRNA-Expression in kleinen Probenmengen, wie Oozyten oder präimplantatorischen Embryonen, insbesondere bei Genen mit geringer Expression (GAL et al. 2006).

Die für die Untersuchung ausgewählten Gene haben sich in ihrem Gehalt bereits von unterschiedlichen Einflussfaktoren verändert gezeigt (WRENZYCKI et al. 2007) und dienten somit als Indikator für den Einfluss der für diese Studie gewählten Parameter. Allerdings muss bei der Interpretation von Daten aus der PCR immer beachtet werden, dass eine Relevanz für die Protein- bzw. Funktionsebene

In den in dieser Studie untersuchten unreifen Eizellen wurde allgemein betrachtet ein signifikanter Einfluss des Punktionsintervalls auf die mRNA-Gehalte einiger der untersuchten Gene, aber keiner des Durchblutungsstatus und auch keine Interaktion beider Parameter beobachtet. Der Einfluss des Punktionsintervalls bezog sich auf die Transkripte von ZAR1, BMP15, GDF9, DNMT1A, DNMT3A und HDAC. In diesen Fällen waren die relativen Gehalte an mRNA in KOK aus Punktionen mit auf 7 Tage verlängertem Intervall herabgesetzt. Diese Auswirkungen des Punktionsintervalls zeigten sich vor allem in KOK, die aus nicht erkennbar durchbluteten Follikeln stammten. Die Transkriptgehalte von HSP70 und DNMT1b zeigten sich nicht signifikant vom Punktionsintervall beeinflusst.

Für ZAR1 war der relative mRNA-Gehalt in unreifen Eizellen, die einmal in der Woche gewonnen wurden, signifikant geringer als der Gehalt aus jenen, die zweimal in der Woche aus nicht erkennbar durchbluteten Follikeln gewonnen wurden.

In anderen Studien war ein geringerer Gehalt an mRNA für ZAR1 im Zusammenhang mit der In-vitro-Reifung der Eizelle und der Enukleierung und Aktivierung im SCNT festgestellt worden (NOWAK-IMIALEK et al. 2008). Die Manipulation für den SCNT steht im Zusammenhang mit herabgesetzter Entwicklungskompetenz. Daher könnte ein verringerter Gehalt an mRNA für ZAR1 im Zusammenhang mit einer herabgesetzten Qualität der Eizelle stehen.

Sollte die mRNA in den Eizellen aus verlängertem Punktionsintervall in entsprechendem Maße in Proteine umgesetzt werden, so könnte die verringerte Menge an Proteinen eine allgemein herabgesetzte Enzymwirkung in der Zelle zur Folge haben. Da für ZAR1 eine Beteiligung an der transkriptionellen Regulation vermutet wird (WU et al. 2003b), könnte dies eine Abweichung der Transkriptionsaktivität bedingen.

Die relativen mRNA-Gehalte für BMP15 verhalten sich parallel zu denen von ZAR1.

Auch hier lassen sich signifikant verringerte Gehalte feststellen, wenn Eizellen einmal in der Woche gewonnen wurden, im Gegensatz zu jenen, die zweifach in der Woche aus nicht erkennbar durchbluteten Follikeln gewonnen wurden. Für die unreifen Eizellen aus zweimal wöchentlich punktierten Follikeln mit erkennbarer Durchblutung

zeigten sich im Vergleich zu jenen aus einmal in der Woche gewonnenen die Unterschiede nur tendentiell.

Vergleichbare Studien, die sich ebenfalls auf die Transkription von BMP15 in unreifen Eizellen beziehen, gibt es bisher nicht. In einer Studie, die sich mit der mRNA-Expression in Embryonen beschäftigte, die nach einem Transfer zur Geburt eines Kalbes führten, konnte festgestellt werden, dass der mRNA-Gehalt für BMP15 in solchen Embryonen im Vergleich zu jenen, die nicht zur Geburt eines Kalbes führten erhöht war (EL-SAYED et al. 2006).

Die in dieser Untersuchung festgestellten verringerten Gehalte an BMP15-mRNA in den KOK aus einmalig je Woche stattfindender Gewinnung könnten nach Berücksichtigung der oben genannten Studie auf eine verminderte Qualität der untersuchten Oozyten hinweisen. Studien an Schafen, die eine Mutation des BMP15-Gens aufwiesen, ließen eine erhöhte Ovulationsrate bzw. infertile Phänotypen erkennen (GALLOWAY et al. 2000; JUENGEL et al. 2004).

Daher könnten parallel zu den aufgeführten Untersuchungen in anderen Spezies auch beim Rind evtl. Abweichungen bezüglich der Ovulationen, der Fertilisationsraten etc. auftreten, wenn die enzymatische Gesamtaktivität von BMP15 verändert ist. Dies könnte parallel zu den Befunden beim Schaf ein Fertilitätsproblem in den Nachkommen bedingen.

Die mRNA-Gehalte für GDF9 in unreifen Eizellen, die einmal in der Woche gewonnen wurden, wiesen eine signifikante Verringerung gegenüber jenen aus nicht erkennbar durchbluteten Follikeln nach einmaliger Gewinnung je Woche auf.

Eine Verminderung des relativen Gehaltes an mRNA für GDF9 konnte auch in Oozyten aus Follikeln mit einer Größe von unter 2 mm (im Vergleich zu solchen mit einer Größe von über 5mm) und nach IVM (im Vergleich zur In-vivo-Reifung) beobachtet werden. Da sowohl ein Durchmesser des Herkunftsfollikels von unter 2 mm als auch die IVM mit verringerter Entwicklungskompetenz einhergehen, kann der verminderte Gehalt an GDF9-mRNA als ein Zeichen für eine verringerte Qualität angesehen werden (TAN u. LU 1990; PAVLOK et al. 1992; BORDIGNON et al. 1997;

HUMBLOT et al. 2005).

Bei Versuchen in Mäusen konnten Störungen in der Granulosazellfunktion (ELVIN et al. 1999), der Follikelentwicklung allgemein (DONG et al. 1996) und im Speziellen der Kumuluszellfunktion (YAN et al. 2001) nachgewiesen werden.

Die relativen Gehalte von DNMT1A und 3A verhalten sich ähnlich wie die für GDF9.

Ein signifikanter Unterschied in den Gehalten beider Gene ist zwischen den Eizellen aus nicht erkennbar durchbluteten Follikeln aus unterschiedlichem Intervall zwischen den OPU-Sitzungen zu ermitteln. Dabei ist der Gehalt in jenen aus einmal in der Woche stattfindender Gewinnung erniedrigt. Direkt vergleichbare Untersuchungen gibt es nicht, da keine Studien im entsprechenden Stadium und mit entsprechenden Primern für die Isoformen der DNMT durchgeführt wurden.

Bei einer Widerspiegelung der Veränderungen auf Protein- und Enzymaktivitätsebene könnte dies abweichende Methylierungsmuster bedingen und somit essentiell in die Transkription der Embryonen aus solchen Oozyten eingreifen.

Dies könnte sowohl die Erhaltung vorhandener Methylierungsmuster durch die DNMT1A (PRADHAN et al. 1997), als auch die De-novo-Methylierung durch die DNMT3A (OKANO et al. 1998) betreffen.

Auch die Gehalte der mRNA für HDAC2 zeigten sich in den Gruppen der Eizellen aus nicht erkennbar durchbluteten Follikeln in den unterschiedlichen Punktionsintervallen signifikant beeinflusst. Ein weiteres Mal waren jene aus Punktionen in einem Intervall von 7 Tagen herabgesetzt. Ferner konnten signifikante Unterschiede beim Vergleich der mRNA-Gehalte in Eizellen aus einwöchentlichem Punktionsintervall im Vergleich zu jenen in Eizellen aus Follikeln ohne erkennbare Durchblutung bei zweifacher Gewinnung in der Woche und in einem Vergleich zwischen den Gehalten in Oozyten aus nicht erkennbar durchbluteten Follikeln aus Punktion im 7-Tagesintervall und jenen in Eizellen aus zweifach in der Woche stattfindendem OPU gefunden werden.

In einer anderen Studie wurde ein veränderter Gehalt an mRNA für HDAC2 mit der Aktivierung im SCNT in Verbindung gebracht. Im Vergleich zu unreifen, reifen und enukleierten Eizellen wiesen aktivierte Eizellen einen signifikant geringeren Gehalt an HDAC2-mRNA auf (NOWAK-IMIALEK et al. 2008). Dieser Eingriff setzt die

Entwicklungskompetenz der Eizelle herab. Daher könnten die verringerten Gehalte an HDAC2-mRNA ein Indikator für eine herabgesetzte Qualität sein.

Sollten auch jene Veränderungen in den mRNA-Gehalten sich auf Ebene der Enzymaktivität in der Eizelle widerspiegeln, könnte das eine Abweichung in der Acetylierung der Histone und somit in der Genexpression in den folgenden Stadien der Entwicklung bedingen, was ebenfalls ein essentieller Eingriff in die physiologischen Verhältnisse mit Auswirkung auf verschiedenste Abläufe in der Zelle haben könnte.

Die in den Blastozysten untersuchten relativen mRNA-Gehalte zeigten allgemein keine so umfangreichen Abweichungen wie die von uns untersuchten unreifen Oozyten. Während sich in den unreifen Eizellen sechs der acht untersuchten Gene in ihrer Expression durch das Punktionsintervall beeinflusst zeigten, war in den Blastozysten nur eines von acht untersuchten Transkripten verändert. Dieser Sachverhalt erklärt sich, wenn berücksichtigt wird, dass in den Blastozysten die Einwirkung der IVP egalisierend gewesen sein könnte. Schließlich ist nachgewiesen, dass sich die Anfangsqualität auf die Menge der in der IVP produzieren Embryonen auswirkt, wohingegen die Kultivierung einen Einfluss auf die Qualität jener Embryonen nimmt (RIZOS et al. 2002). Die in dieser Studie untersuchten Blastozystenstadien wiesen eine signifikante Veränderung der mRNA-Gehalte nur in Bezug auf G6PD auf. Es war eine signifikante Auswirkung des Punktionsintervalls feststellbar. Der Durchblutungsstatus zeigte keinen Einfluss, jedoch war eine Interaktion beider Parameter zu ermitteln.

Blastozysten aus KOK, die aus nicht erkennbar durchbluteten Follikeln stammten, die einmal in der Woche abgesaugt wurden, wiesen einen signifikant geringeren G6PD-mRNA-Gehalt auf als Blastozysten aus KOK aus Punktion im Abstand von 3 - 4 Tagen. In einer anderen Untersuchung konnte eine Abweichung für die Menge an G6PD-mRNA festgestellt werden, wenn eine Untersuchung an ungereiften Eizellen und IVM-Eizellen stattfand. Jene wiesen im Vergleich zu in vivo gereiften Eizellen und solchen aus Gewinnung während des LH-Peaks signifikant verringerte Gehalte auf.

In anderen Studien hat sich der mRNA-Gehalt für G6PD ebenfalls von verschiedenen Parametern beeinflusst gezeigt. So ist der Gehalt in Blastozysten aus IVP im Vergleich zu jenen aus Kultivierung in Schafovidukten und In-vivo-Produktion signifikant erhöht (LONERGAN et al. 2003a; BALASUBRAMANIAN et al. 2007).

Auch ein erhöhter Sauerstoffgehalt während der IVP wirkt sich entsprechend aus (BALASUBRAMANIAN et al. 2007). Im Gegensatz zu dieser Erhöhung des mRNA-Gehaltes durch Faktoren, welche die Entwicklungskompetenz verringern (HASLER et al. 1995; BALASUBRAMANIAN et al. 2007), bewirken der Einsatz geschlechtsdifferenzierten Spermas und eine späte 1. Teilung der Zygoten (42 Stunden vs. 27-30 Stunden), mit denen ebenfalls eine herabgesetzte Entwicklungskompetenz in Verbindung gebracht werden konnte (LONERGAN et al.

1999; MORTON et al. 2007), eine Verringerung des relativen mRNA-Gehaltes (LONERGAN et al. 2000; MORTON et al. 2007). Auf Grund dieser konträren Ergebnisse lässt sich keine klare Aussage über die Bedeutung der Befunde dieses Versuchs treffen.

Weiterhin wurde das Geschlecht der Embryonen dieser Studie nicht berücksichtigt, welches die Transkript-Gehalte für G6PD nachweislich beeinflusst (GUTIERREZ-ADAN et al. 2000; WRENZYCKI et al. 2002).

Setzt sich die detektierte Veränderung des mRNA-Gehalts auch auf Ebene der Enzymaktivität fort, so könnte das Auswirkungen auf den Pentose-Phosphat-Zyklus nach sich ziehen, welche auf Grund der umfangreichen Bedeutung seiner Produkte wie Nukleotide und NADPH (LEHNINGER et al. 1999) in der Zelle verschiedenste Abweichungen nach sich zöge. So wäre es möglich, dass die Nukleotid-Synthese und somit einige genetische Prozesse wie auch die Transkription gestört wären.

Weiterhin ist das Enzym an der Produktion von NADPH beteiligt, welches sowohl für die Fettsäure- und Steroidproduktion als auch die Abwehr von oxidativem Stress benötigt wird (LEHNINGER et al. 1999), weswegen eine veränderte Enzymaktivität auch diese Bereiche betreffen würde.

Die festgestellte Interaktion der beiden untersuchten Parameter sagt aus, dass eine nicht erkennbare Durchblutung sich nur verringernd auf den mRNA-Gehalt auswirkt, wenn das Punktionsintervall von 3 - 4 Tagen auf 7 Tage verlängert wird. Die

naheliegendste Hypothese dazu ist, dass eine nicht nachweisbare Durchblutung in Follikeln bei Punktionen im 3 - 4-Tagesintervall vor allem bedingt ist durch noch nicht sehr stark ausgeprägte Gefäße auf Grund noch nicht sehr fortgeschrittenen Wachstums. Dies scheint die Qualität der in ihr befindlichen Eizelle nicht zu beeinträchtigen.

In den nicht erkennbar durchbluteten Follikeln aus den Punktionen im 7-Tages-intervall könnte die für uns nicht erkennbare Durchblutung eher durch eine fortgeschrittene Atresie bedingt sein und somit eine Veränderung der Umstände für die Eizelle anzeigen. Sie könnte auf Grund der verringerten Durchblutung in diesem Stadium des Wachstums Schaden genommen haben.

Abschließend lässt sich formulieren, dass bei einer Gewinnung von Eizellen per OPU in einem Abstand von 7 Tagen eine unterschiedliche Follikelwanddurchblutung mit veränderten mRNA-Gehalten verschiedener entwicklungsrelevanter Gene einhergeht.

5.4 Follikelflüssigkeit

Für die Ermittlung der E2-Gehalte in der Follikelflüssigkeit konnten 72 Proben ausgewertet werden, für die Gehalte an P4 waren dies 106 Proben.

Zu den Ergebnissen ist allgemein anzumerken, dass die Standardfehler der Steroidhormongehalte in den einzelnen Gruppen relativ hoch waren. Allerdings sind solch hohe Abweichungen aus anderen Untersuchungen bekannt (KRUIP u.

DIELEMAN 1982; KRUIP u. DIELEMAN 1985; SKYER et al. 1987; SUNDERLAND et al. 1994; WISE u. MAURER 1994; DE LOS REYES et al. 2006). Auch ein Ausschluss von 20 % der am stärksten abweichenden Werte in den jeweiligen Gruppen führte zu keiner nennenswerten Änderungen der Unterschiede in den einzelnen Gruppen, weshalb dieser Ausschluss nur getestet, aber im Weiteren nicht umgesetzt wurde.

Die Mittelwerte der Gehalte von E2 in der Follikelflüssigkeit bezogen auf die verschiedenen Follikelgrößen zeigten keine signifikanten Abweichungen in den

wonach der E2-Gehalt mit dem Wachstum der Follikel ansteigt (CARSON et al. 1981;

KRUIP u. DIELEMAN 1982). In der Gruppe mit einem Durchmesser von mehr als 8 mm wäre es allerdings möglich, dass sich zumindest in den einmal die Woche punktierten Follikeln bedingt durch eine voranschreitende Atresie ein verringerter Gehalt an E2 ergäbe (CARSON et al. 1981; KRUIP u. DIELEMAN 1982; BURKE et al. 2007).

Die Mittelwerte der Gehalte von P4 in der Follikelflüssigkeit zeigten keine signifikanten Unterschiede in den verschiedenen Größenklassen. Der Literatur zu Folge hätte es in nicht präovulatorischen Follikeln zu einem Anstieg des Gehaltes an P4 mit steigender Atresie kommen müssen (KRUIP u. DIELEMAN 1985; WISE u.

MAURER 1994).

Eine weitere Aufsplittung der Werte für E2 und P4 nach der Größe, der Durchblutung und dem Punktionsintervall blieb ebenfalls ohne Aussagekraft.

Auch die Berechnung des Verhältnisses der Gehalte von E2 und P4 führte nicht zu aussagekräftigen Ergebnissen.

Die starken individuellen Schwankungen der Steroidhormongehalte und eine eingeschränkte Nutzbarkeit der Quotienten aus den Gehalten von E2 und P4 sind in der Literatur beschrieben (KRUIP u. DIELEMAN 1985; DE LOS REYES et al. 2006;

ROBERTS et al. 2006).

Erstmals wurde in dieser Arbeit die Korrelation zwischen der Follikelwanddurchblutung an nicht präovulatorischen Follikeln beim Rind und der Qualität von KOK bzw. Oozyten aus OPU betrachtet.

Es konnte beobachtet werden, dass sich per Ultraschall detektierte Follikelwanddurchblutung mit einer veränderten Qualität der im Follikel befindlichen KOK respektive Oozyten einhergeht, wenn diese in einwöchentlichen Abständen per OPU gewonnen werden.

Diese Effekte auf die Qualität wurden auf verschiedenen Ebenen festgestellt. So konnten vermehrt KOK mit expandiertem Kumulus aus Follikeln ohne erkennbare Wanddurchblutung separiert werden. Ebenso zeigte sich die Fähigkeit der Oozyten bzw. KOK, sich unter IVP-Bedingungen zu einer Blastozyste zu entwickeln, bei einer

nicht erkennbaren Follikelwanddurchblutung herabgesetzt. Weiterhin erschienen auf molekularer Ebene die mRNA-Gehalte verschiedener, entwicklungsrelevanter Gene verändert.

Schlussfolgernd kann festgestellt werden, dass bei einem Intervall von 7 Tagen zwischen den OPU-Sitzungen die Messung der perifollikulären Durchblutung als ein nutzbarer Parameter angesehen werden kann, um Oozyten von erhöhter Qualität zu gewinnen.