2 Literatur
2.3 Entwicklungskompetenz von KOK
Die Entwicklungskompetenz der Oozyten oder auch die Oozytenqualtität wird meist funktionell definiert. Für GILCHRIST und THOMPSON (2007) macht auch bereits die Fähigkeit der Eizelle, ihre Umgebung über von Oozyten sezernierte Faktoren zu beeinflussen einen Teil ihrer Entwicklungskompetenz aus. Weiterhin wird die Entwicklungskompetenz an der Fähigkeit zum Meioseabschluss, der Befruchtung, der Teilung nach Fertilisation, der Weiterentwicklung zur Blastozyste, der Trächtigkeitsinduktion und Erhaltung, der Erhaltung der Gesundheit des Embryos bzw. Feten bis zum Ende der Trächtigkeit und der Produktion eines lebensfähigen, gesunden Kalbes gemessen (LONERGAN et al. 2001; SIRARD et al. 2006;
ANGUITA et al. 2007). (GILCHRI ST u. THOM PSON 2007)
Die Qualität von Eizellen basiert auf multiplen Faktoren, wobei viele dieser Faktoren nur auf zellulärer und molekularer Ebene und damit in den meisten Fällen mit invasiven Methoden messbar sind (COTICCHIO et al. 2004). Ferner wird angenommen, dass die Entwicklungskompetenz beispielsweise auf mRNA-Ebene nur mit geringen Änderungen der mRNA-Gehalte verschiedener Gene einhergeht (PFEFFER et al. 2007).
2.3.1 Einflussfaktoren auf die Entwicklungskompetenz von Eizellen
Innerhalb des Follikels findet eine Kommunikation zwischen Oozyte und somatischen Zellen statt (GILULA et al. 1978; COMBELLES et al. 2004). So wird bereits im Follikel Einfluss auf die Qualität der Eizelle genommen (SIRARD et al. 2006).
Auch die Entwicklungsphase des Follikels ist für die Entwicklungskompetenz von Bedeutung. So wirkt sich das mit der Follikelentwicklung verbundene Größenwachstum des Follikels positiv auf die Qualität der darin eingeschlossenen Oozyte aus (TAN u. LU 1990; PAVLOK et al. 1992; LONERGAN et al. 1994;
ARLOTTO et al. 1996; HAGEMANN et al. 1999; RIZOS et al. 2002; LEQUARRE et al. 2005; FENG et al. 2007; SIDDIQUI et al. 2009b). Allerdings gibt es auch Untersuchungen, in denen kein Effekt der Follikelgröße auf die Entwicklungskompetenz festgestellt werden konnte. SENEDA et al. (2001) teilten die
Entwicklungskompetenz sich bezogen auf die Teilungsfähigkeit und die Entwicklungsrate zu Blastozysten nicht signifikant unterschieden. (SENED A et al. 2001)
Zum Zusammenhang zwischen Atresie und Entwicklungskompetenz wurden verschiedene Untersuchungen durchgeführt, aus denen sich konträre Ansichten über die Auswirkung von Atresie ergaben. So erzielten teilweise die höchsten Entwicklungsraten zu Blastozysten Eizellen aus atretischen Follikeln, die beginnende Degenerationsanzeichen aufwiesen (BLONDIN u. SIRARD 1995). Diese Kopplung von Entwicklungskompetenz der KOK an den Atresiegrad der Follikel kann jedoch nicht in stark atretischen Follikel beobachtet werden (DE WIT et al. 2000). Die dabei verwandte Gruppierung der Atresieklassen von nicht atretisch, leicht, mittelgradig und stark atretisch, basirte auf der Studie von KRUIP und DIELEMAN aus dem Jahr 1982. Letztere nutzten makroskopisch als Kriterien die Transparenz des Follikels, seine Vaskularisierung und etwaige Partikel in der Follikelflüssigkeit. Als histologische Kriterien dienten die Organisation und Dicke der Membrana granulosa, Mitosestadien in den verschiedenen Zelllagen und das etwaige Vorhandensein degenerierter Zellen. (KRUIP u. D IELEMAN 1982) .
Dahingegen verlieren morphologisch als gut klassifizierte KOK aus stark atretischen Follikeln ihre Kompetenz, sich in der IVP zur Blastozyste zu entwickeln (JEWGENOW et al. 1999). Die Gewinnung von Oozyten aus degenerierten Follikeln könnte einer der Hauptgründe für eine reduzierte Entwicklungskompetenz nach der IVM sein (ASSEY et al. 1994). Ein nicht zu unterschätzender Anteil der Oozyten aus der Embryotransfer-Praxis (ET-Praxis), die sich später zu Embryonen entwickeln, stammt wohl aus früh atretischen Follikeln (DIELEMAN et al. 2002).
Die Dominanz eines Follikels beeinflusst die Atresie der subordinaten Follikel. Ob sie auch direkt die Entwicklungskompetenz der in ihnen befindlichen Eizellen beeinflussen, wird ebenfalls kontrovers diskutiert. Während in einer Untersuchung kein Effekt der Dominanzphase (definiert als Tag 6 - 7 des Brunstzyklus) auf die Entwicklungskompetenz von KOK aus Follikeln mit einem Durchmesser von 2 - 7 mm festgestellt werden konnte (SMITH et al. 1996), wurde ein positiver Effekt der Dominanz an Tag 5 nach Beginn einer neuen Follikelwelle in einer anderen
Regressionsphase im Vergleich zur Wachstums- oder statischen Phase (Tag 1 - 3 nach Start einer neuen Follikelwelle) in den untersuchten Follikeln mit einem Durchmesser von ≥ 5 mm vermehrt KOK mit Reifungsanzeichen (expandierter Kumulus).
Andere Autoren hingegen beobachteten erhöhte Teilungs- und Entwicklungsraten während der Wachstums- im Vergleich zur Dominanzphase (HAGEMANN 1999;
HENDRIKSEN et al. 2004; MACHATKOVA et al. 2004; NEMCOVA et al. 2006). Kein Einfluss der Phase des Ovarzyklus auf die Entwicklungskompetenz konnte jedoch bei Eizellen aus Follikeln mit einem Durchmesser von 2 - 7 mm in einer anderen Studie festgestellt werden (SMITH et al. 1996).
Als ein weiterer Faktor, zu dem eine Verbindung bezüglich der Entwicklungs-kompetenz hergestellt werden konnte, ist die Anzahl von Follikeln mit einer Größe von 2 - 5 mm bzw. das Vorhandensein eines Follikels mit einem Durchmesser von mehr als 10 mm auf dem Ovar. Befinden sich weniger als 10 Follikel mit einem Durchmesser von 2 - 5 mm auf dem Ovar, so sind die Teilungs- und Entwicklungs-raten zu Blastozysten der dort gewonnenen KOK signifikant verringert (GANDOLFI et al. 1997; MODINA et al. 2007).
Der Einfluss eines Cls sowohl auf dem Ovar von denen die KOK stammten als auch auf dem kontralateralen Ovar wird als positiv beschrieben (BOEDIONO et al. 1995).
Es wurde eine signifikant erhöhte Entwicklungsrate zu Blastozysten bei Vorhandensein eines Cls vorgefunden. In einer anderen Studie wurde hingegen kein Einfluss des Cls auf die Entwicklunsgraten gewonnener KOK beobachtet (VASSENA et al. 2003b). Auch ein Zusammenhang zwischen der P4-Konzentration im Blutplasma und der Entwicklungskompetenz konnte nicht erkannt werden (HAGEMANN 1999).
Für den Einfluss des individuellen Tieres auf die Entwicklungsrate zu Blastozysten bestehen ebenfalls Hinweise (TAMASSIA et al. 2003; GALLI et al. 2004).
Weiterhin gibt es Untersuchungen, die einen Zusammenhang der Entwicklungskompetenz und der Rasse (LOPES et al. 2006), des Alters bezogen auf die Adoleszenz (PALMA et al. 1993; STEEVES u. GARDNER 1999; RIZOS et al.
2005; MALHI et al. 2007), der Fütterung (DOMÍNGUEZ 1995; KENDRICK et al.
1999; ADAMIAK et al. 2005), des Laktationsstatus (BUNGARTZ et al. 1995) und einer etwaigen Trächtigkeit des Tieres (MORENO et al. 1993) zeigten.
Als sich auswirkende technische Faktoren wurden die OPU-Intervalle zwischen den Sitzungen (s.o.) und das technische Equipment (Aspirationsdruck, Nadeldurchmesser, Punkteur) ermittelt (SCOTT et al. 1994; HANENBERG u. VAN WAGTENDONK-DE LEEUW 1997; HASHIMOTO et al. 1999; KENDRICK et al.
1999).
2.3.2 Parameter zur Einordnung der Entwicklungskompetenz
Da in Versuchen meist nicht die Möglichkeit besteht, die Entwicklungskompetenz einer Oozyte in ihrer Vollständigkeit und somit bis zur Geburt eines vitalen und fertilen Neonaten zu prüfen, wird diese Prüfung zu früheren Zeitpunkten vorgenommen (z.B. Produktion von Blastozysten in vitro) und es wird versucht, sie mit anderen Indikatoren zu verknüpfen.
Parameter, die eine Einordnung bezüglich der Qualität des KOK vor der Gewinnung erlauben, würden die Effizienz der weiteren Bearbeitung erhöhen. Daher wäre dieser Zeitpunkt optimal.
Auf der Suche nach einem solchen Parameter, konnte eine Steigerung der Entwicklungskompetenz positiv mit der Größe des Ursprungsfollikels des KOK in Zusammenhang gebracht werden (TAN u. LU 1990; HAGEMANN et al. 1999).
Als ein weiteres Kriterium wurde die Echotextur des perifollikulären Stromas erkannt.
Sie zeigte sich geringer, wenn keine Embryonen aus den KOK produziert werden konnten. Allerdings ist diese Methode noch nicht ausgreift (VASSENA et al. 2003a).
Die Quintessenz der bisherigen Untersuchungen ist, dass beim Rind bisher keine verlässlichen Indikatoren gefunden werden konnten, um die Qualität bzw.
Entwicklungskompetenz von Eizellen aus Follikeln bestimmter Größe vorauszusagen (KENDRICK et al. 1999).
Die Nutzung von Kriterien zur Erkennung qualitativ hochwertiger KOK nach ihrer Gewinnung ist ein Ansatz, der zumindest die IVP effizienter machen könnte. Bei den Methoden zur Beurteilung der KOK lassen sich in die Vitalität erhaltende und
Als ein guter Parameter für die Entwicklungskompetenz der KOK wurde der Durchmesser der Eizelle beschrieben (ANGUITA et al. 2007). Ab einem KOK-Durchmesser von 115 µm kann die meiotische Kompetenz als gegeben angesehen werden, ab einem von 120 µm zeigen die Eizellen eine komplette Kompetenz für die Entwicklung bis zum Blastozystenstadium (OTOI et al. 1997).
Die allgemeine Morphologie der KOK zeigte sich ebenfalls als geeignet, um eine Einordnung durchzuführen (HAZELEGER et al. 1995; BONI et al. 2002). So wurden teilweise erfolgreich die Kumuluszellzahl und -beschaffenheit (MADISON et al.
1992), aber auch beginnende Degenerationsanzeichen an den KOK (beginnende Expansion an den äußeren Kumuluszellen und leichte Granulierung des Ooplasmas) und atretische Follikel (histologisch über den Gehalt an pyknotischen Zellkernen) als Kriterium (BLONDIN u. SIRARD 1995) genutzt. Ebenso konnte eine herabgesetzte Farbintensität des Zytoplasmas der Oozyte mit geringeren Entwicklungsraten in Zusammenhang gebracht werden (HAZELEGER et al. 1995).
Es gibt allerdings auch Kritik an der Nutzung der morphologischen Parameter zur Einordnung der Entwicklungskompetenz. Der Erfolg dieser Methode wird als sehr limitiert beschrieben (COTICCHIO et al. 2004). Die genutzten Kriterien hätten keine endgültige Aussage über die Entwicklungskompetenz der KOK liefern können (HAGEMANN 1999; MERMILLOD et al. 1999). So verlieren beispielsweise morphologisch gute KOK aus stark atretischen Follikeln ihre Entwicklungskompetenz (JEWGENOW et al. 1999; FENG et al. 2007). Auch die Kumuluszellexpansion wird als unzuverlässiger Indikator für die Reifung von Eizellen beschrieben (RUSSELL et al. 2006). Ein weiteres Argument zur nicht ausreichenden Verlässlichkeit der morphologischen Beurteilung ist, dass diese den Beeinflussungen der Gewinnungstechnik ausgesetzt sind (CHAUBAL et al. 2006).
Eine weitere Möglichkeit zur Einschätzung der Entwicklungskompetenz kann über die Beschaffenheit der Zona pellucida (Zahl und Durchmesser der Poren) erfolgen (SANTOS et al. 2008).
Bei der humanen Oozyte ist es möglich eine Qualitätsbeurteilung auch über intrazelluläre Bestandteile der Eizelle wie unter anderem die Organisation des
Spindelapparates mittels eines Mikroskops mit polarisiertem Licht durchzuführen (KEEFE et al. 2003).
Als weitere Kriterien zur Beurteilung wurden die Dichte von Granulosazellen in der Follikelflüssigkeit (FENG et al. 2007) und eine Brilliant-Kresyl-Blau (BCB)-Färbung (Indikator für G6PDH-Aktivität) herangezogen (BHOJWANI et al. 2007).
Während der IVP wurden die Ausschleusungsgeschwindigkeit des Polkörpers während der Reifung (DOMINKO u. FIRST 1992) und das Auftreten der Furchung herangezogen (WARD et al. 2001).
Die Methoden zur Beurteilung zellulärer oder molekularer Parameter in der Oozyte sind oft invasiv und damit zerstörend für die einzelne Eizelle. Invasive Techniken zur Feststellung der Entwicklungskompetenz sind eine Möglichkeit, um objektive Kriterien für Oozytenqualität zu finden (COTICCHIO et al. 2004). In einem zweiten Schritt muss dann eine Korrelation zwischen invasiven und nicht invasiven Markern für die Qualität gefunden werden, um invasive und damit destruktive Prozesse zu umgehen (ANGUITA et al. 2007).
Die Analyse der Genexpression per RT-PCR wird als eine gute Methode angesehen, um ein weites Spektrum von Daten bezüglich der Qualität von Eizellen und Embryonen zu erfassen (LECHNIAK 2002).
Allerdings ist eine erhöhte mRNA-Expression nicht immer mit erhöhten Gehalten an Proteinen verbunden (GYGI et al. 1999) und Proteine sind nicht immer enzymatisch aktiv (SUMNER et al. 2003).
Daher wird ferner versucht, eine Relation zwischen der Entwicklungskompetenz und den Proteinen (ELLEDEROVA et al. 2004; GUPTA et al. 2009) und Metaboliten in der Follikelflüssigkeit bzw. dem IVP-Medium zu finden (SINGH u. SINCLAIR 2007).