CpG Motive und ausgewählte Toll-like-Rezeptor-Liganden

Aus der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover

CpG Motive und ausgewählte Toll-like-Rezeptor- Liganden: Ihre modulatorische Interaktion mit bovinen

Leukozyten

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Julia Dahnke

aus Schwerte

Hannover 2003

Wissenschaftliche Betreuung: PD Dr. med. vet. H.-J. Schuberth

1. Gutachter: PD Dr. med. vet. H.-J. Schuberth

2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. M. Hewicker-Trautwein

Tag der mündlichen Prüfung: 25.11.2003

meiner Mama in Liebe und Dankbarkeit

Inhaltsverzeichnis

Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen ... 8

1 Einleitung und Zielsetzung ... 11

2 Literaturübersicht... 12

2.1 „Danger Signals“ (DS) für das Immunsystem ...12

2.2 Erkennung von Erregern oder deren Bestandteilen durch Komponenten des Immunsystems...13

2.2.1 Mannose bindendes Lektin (MBL) ... 13

2.2.2 Cluster of differentiation 14 (CD14) ... 14

2.2.3 Toll-like-Rezeptoren ... 14

2.3 Pathogen assoziierte molekulare Muster ...22

2.3.1 CpG-Motive... 22

2.3.2 Lipopolysaccharid (LPS)... 29

2.3.3 Lipoteichonsäure (LTA)... 29

2.4 Bakterielle Superantigene...30

2.5 Neutrophile Granulozyten...32

2.5.1 Morphologische Eigenschaften neutrophiler Granulozyten... 32

2.5.2 Besonderheiten boviner neutrophiler Granulozyten... 32

2.5.3 Aufgaben der Granulozyten im Rahmen der Infektionsabwehr... 33

2.6 Makrophagen...34

2.7 Apoptose und Nekrose ...35

2.7.1 Induktion der Apoptose ... 35

2.7.2 Apoptose bei neutrophilen Granulozyten... 36

3 Geräte, Material und Methoden... 38

3.1 Geräte ...38

3.2 Material...39

3.2.1 Klinikbedarf... 39

3.2.2 Laborbedarf ... 39

3.2.3 Reagenzien ... 40

3.2.4 Antikörper und Nachweisreagenzien ... 43

3.2.5 Kulturmedien, Puffer und Lösungen ... 44

3.2.6 Tiere... 51

3.3 Methoden...52

3.3.1 Gewinnung einzelner Zellpopulationen aus bovinem Blut ... 52

3.3.2 Generierung von Makrophagen durch in vitro Kultivierung monozytoider Zellen des peripheren Blutes (BMDM, blood monocyte derived macrophages) ... 53

3.3.3 Vitalitätsbestimmung von Zellen ... 57

3.3.4 Durchflusszytometrie ... 58

3.3.5 Zellkultivierung in vitro ... 63

3.3.6 Indirekte Membranimmunfluoreszenz (MIF) ... 69

3.3.7 Statistische Verfahren... 72

4 Ergebnisse... 73

4.1 Generierung und Charakterisierung boviner Makrophagen...73

4.1.1 Methodische Vorarbeiten ... 73

4.1.2 Messung der Nitrit-Bildung durch in vitro generierte Makrophagen... 77

4.2 Bindung von DNA-Motiven an bovine leukozytäre Zellen und in vitro generierte Makrophagen ...85

4.2.1 Klassischer Bindungsnachweis ... 85

4.2.2 Alternativer Bindungsnachweis mittels Amplifikation... 87

4.2.3 Prüfung der Internalisierung biotinylierter DNA-Sequenzen ... 92

4.3 Prüfung der Proliferation induzierenden Potenz von CpG-Motiven auf bovine mononukleäre Zellen in vitro...93

4.3.1 Proliferative Eigenschaften von CpG-Motiven im Vergleich zu SEA... 93

4.3.2 MHC-Klasse-II-Expression in vitro stimulierter boviner mononukleärer Zellen des Blutes ... 96

4.4 Das beschleunigte Sterben boviner neutrophiler Granulozyten in vitro...98

4.4.1 Effekte von CpG-Motiven, LPS und LTA für reine neutrophile Granulozyten ... 98

4.4.2 Einfluss von CpG-Motiven, LPS und LTA auf neutrophile Granulozyten in Kokulturen aus PMN und MNC... 100

4.4.3 Einfluss von Kulturüberständen CpG-stimulierter mononukleärer Zellen auf neutrophile Granulozyten ... 102

4.4.4 Einfluss von Kulturüberständen aus allogenen MLCs ... 104

4.4.5 Einfluss von CpG-Motiven auf eosinophile Granulozyten ... 105 4.4.6 Abhängigkeit des Vitalitätsverlustes neutrophiler Granulozyten vom

4.4.7 CpG-Motive in Kombinationsansätzen aus bovinen Makrophagen und

neutrophilen Granulozyten ... 108

4.4.8 Bedeutung der Reaktionslage von neutrophilen Granulozyten für das Ausmaß ihres Vitalitätsverlustes nach PAMP-Stimulation... 109

4.4.9 Kinetik der Entstehung apoptischer Zellen durch in vitro Kokultivierung von PMN und MNC in Anwesenheit von TLR-Liganden ... 113

5 Diskussion... 119

5.1.1 Beurteilung der in vitro generierten Makrophagen ... 119

5.1.2 Nachweis der Produktion von NO in MNC und Makrophagen ... 120

5.1.3 Bindung und Internalisierung von CpG-Motiven durch Zellen des peripheren Blutes und Makrophagen... 123

5.1.4 Interaktion von CpG Motiven mit bovinen MNC ... 124

5.1.5 Die Interaktion zwischen DNA-Motiven, LPS und LTA mit neutrophilen Granulozyten ... 126

6 Zusammenfassung... 133

7 Summary ... 135

8 Literaturverzeichnis... 137

Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen Abb. Abbildung

ACD-Puffer Acid-Citrate-Dextrose (Citronensäurehydrat-Natriumzitrat-Dextrose- Puffer)

ADCC Antibody Depending Cell Cytoxicity (Antikörperabhängige Zellzytotoxizität)

Aqua tridest. Aqua tridestillata (dreifach destilliertes Wasser) BoBMDM Bovine Bone Marrow Derived Macrophages

BoCD Bovine Cluster of Differentiation, Bezeichnung für bovine Homologe zu humanen Differenzierungsantigenen mit CD-Nomenklatur

BoLA Bovine Cluster of Differentiation, Bezeichnung für den Haupthistokompatibilitätskomplex des Rindes

BSA Bovines Serumalbumin

bspw. Beispielsweise bzw. Beziehungsweise

C1q Fragment der Komplementkomplemente C1

C5a aktiviertes Fragment der Komplementkomponente C5 ca. Zirka

CD Cluster of Differentiation (System zur Bezeichnung von Differenzierungs- antigenen)

CD4⁺ Zellen, die das Differenzierungsantigen CD4 an der Oberfläche exprimieren

CD8⁺ Zellen, die das Differenzierungsantigen CD8 an der Oberfläche exprimieren

CO2 Kohlenstoffdioxid

ConA Concanavalin A

CpG Cytosin-Phosphate-Guanosin CR Complement Receptor (Komplementrezeptor)

D dies (lateinisch: Tag); D0 = Ausgangsmessung vor einem Versuch, D5, D6 = 5 bzw. 6 Tage nach Versuchsbeginn

DAF-2 DA Diaminofluoreszein-2 Diazetat DAF-2 T Diamino Triazolfluoreszein

DNA Desoxyribonukleinsäure DS Danger Signal (Gefahrensignal) E. coli Escherichia coli

EDA Extra domain A

EDTA Ethylendiamintetraacetat

FACScan^® Fluorescence Activated Cell Scanner (Fluoreszenzaktiviertes Zellmessgerät der Firma Becton Dickinson, Heidelberg)

Fc Fragment Cristalline (kristallisierbarer Antikörperteil, carboxy- terminales Fragment von Immunglobulinen nach Papain-Spaltung)

FCM Flow Cytometer (Durchflusszytometer) FCS Fetal Calf Serum (Fetales Kälberserum)

FITC Fluoreszeinisothiocyanat

FL-1, -2, -3 Messkanäle des Durchflusszytometers für emittierte Fluoreszenz FL-1 = Grünfluoreszenz, 530 ± 15 nm; FL-2 = Orangefluoreszenz,

FSC Forward Scatter (Vorwärtsstreulicht), Messparameter des FACScan g Gramm

G-CSF Granulocyte-Colony Stimulating Factor (Granulozyten-Wachstumsfaktor) GM-CSF Granulocyte-Macrophage-Colony Stimulating Factor (Granulozyten-

Makrophagen-Wachstumsfaktor) h hora (lateinisch: Stunde)

HRP Horse-Radish-Peroxidase HSP Heat Shock Protein (Hitzeschockprotein)

I10F^+Strep Iscove-Zellkulturmedium mit L-Glutamin, Streptomycin und 10% FCS ICAM intercellular adhesion molecule (interzelluläres Adhäsionsmolekül) IFN Interferon

Ig Immunglobulin IL Interleukin i.m. intra muskulär

iNOS induzierbare Stickstoffoxid Synthetase i.p. intra peritoneal

l Liter

LBP Lipopolysaccharid-Binding Protein

LFA-1 Leukozyten-Funktions-assoziiertes-Antigen-1 LPS Lipopolysaccharid

LTA Lipoteichonsäure

LTB4 Leukotrien B4

µ mikro (x 10^-6) m milli (x 10^-3)

M Molar (Mol/l)

mAK monoklonale(r) Antikörper MAP Mitogen Activated Protein

MBL Mannose Binding Lectin (Mannose bindendes Lektin)

MDM Monocyte Derived Macrophages – aus Monozyten gewonnene Makrophagen

MHC Major Histocompatibility Complex (Haupthistokompatibilitätskomplex) MIF Membranimmunfluoreszenz

min Minute(n)

MNC Mononuclear Cells (mononukleäre Zellen, hier: des Blutes)

MW arithmetischer Mittelwert

Mph Makrophagen

N bei Berechnung des Mittelwertes die Anzahl der Einzelbeobachtungen NaCl Natriumchlorid

n nano (x 10^-9)

NO Nitric Oxide (Stickstoffmonoxid) Nr. Nummer

ODN Oligodeoxynukleotide

P Irrtumswahrscheinlichkeit bei der Analyse der Ähnlichkeit zweier Datengruppen

PAMP Pathogen Associated Molecular Pattern (Molekulare Muster von Erregern) PBS Phosphate Buffered Saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)

PD Phosphodiester PE Phycoerythrin

Pellet Bodensatz; hier: durch Zentrifugation sedimentierte Zellen

PGE2 Progesteron E2

PI Propidiumiodid

PMN Polymorphonuclear Leukocytes (Granulozyten) PS Phosphatidylserin

PT Phosphorothioat

ROS Reactive Oxigen Species (Reaktive Sauerstoffspezies) RT Raumtemperatur

S Standardabweichung

s. siehe

s.c. sub cutan

s.S. siehe Seite

SDCC Superantigen Dependent Cellular Cytotoxicity (Superantigen abhängige zelluläre Zytotoxizität)

SEA Staphylococcus aureus Enterotoxin A sek Sekunde(n)

sog. sogenannte(r)

SSC Side Scatter (Seitwärtsstreulicht), Messparameter des FACScan^® Tab. Tabelle

TAD TGF-β-Activated Kinase

TCR T Cell Receptor (T-Zellrezeptor)

TIRAP TIR-Domain-Containing Adapter Protein TIR Toll Interacting Receptor

TNF Tumornekrosefaktor TIR Toll Interacting Protein

TOLLIP Toll interacting Protein

TRAF6 TNR-Receptor-Associated Factor 6

TRAMP TNF-Receptor Related Apoptosis Mediating Protein

u.a. unter anderem

vgl. vergleiche

v/v Volumen pro Volumen

xg multipliziert mit der Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/s²)

z.B. zum Beispiel

z.T. zum Teil

1 Einleitung und Zielsetzung

Zellen des Immunsystems erkennen Erregerbestandteile über sog. „Erreger-assoziierte molekulare Muster” (PAMP, Pathogen Associated Molecular Pattern). Die PAMPs stellen eine sehr heterogene, vielfältige Gruppe dar. Unter ihnen befinden sich Moleküle wie das Lipopolysaccharid Gram negativer Keime, die Lipoteichonsäure Gram positiver Bakterien und auch nicht-methylierte DNA-Sequenzen, die im Zentrum ein CG-Dinukleotid aufweisen (CpG-Motive) und nahezu allen Gruppen an Infektionserregern (Viren, Bakterien, Protozoen) gemeinsam sind.

Zellen des Säuger-Immunsystem besitzt für diese PAMPs Rezeptoren (Toll-like-Rezeptoren), über die sie die Präsenz von Erregern erkennen. Die TLR sind genetisch determinierte Rezep- toren, die das Bindeglied zwischen dem konstitutiven und adaptiven Immunsystem bilden.

Im Mittelpunkt dieser Arbeit stehen CpG-Motive, da über ihre Wirkung auf Zellen des bovinen Immunsystems nur wenig bekannt ist. Für Mensch und Maus sind variable Wirkungen verschiedener Motive beschrieben, abhängig von den das Zentralmotiv flankierenden Nukleotiden. Neben stimulatorischen werden ebenso Zellfunktions-hemmende und wirkungslose Motive beobachtet.

Längerfristiges Ziel solcher Studien ist es, die CpG-Motive in der Prophylaxe (Adjuvans bei Immunisierungen) und der Therapie (Immunstimulanz, Allergie- und Tumorbekämpfung) einzusetzen. Vorraussetzung hierfür ist die genaue Charakterisierung ihrer Wirkungsart auf bestimmte Zelltypen. Wie und in welcher Weise Zellen des bovinen Immunsystems auf verschiedene CpG-Motive funktionell reagieren ist jedoch erst in Ansätzen bekannt.

Das Promotionsvorhaben soll hierfür einen Beitrag leisten, indem verschiedene CpG-Motive auf ihre funktionsmodulierende Wirkung für leukozytäre Subpopulationen des Rindes vergleichend untersucht werden. Im Einzelnen sollte geprüft werden, ob CpG-Motive präferentiell an bestimmte Zellsubpopulationen binden, ob und in welchem Umfang verschiedene Motive eine proliferations-modulierende Potenz für lymphoide Zellen aufweisen und ob sie die Vitalität einer entscheidenen Effektorzellopulation – der neutrophilen Granulozyten – direkt oder indirekt beeinflussen.

Da eine der ersten Zellen des Immunsystems nach Erregerkontakt, der gewebsständige Makrophage in der Steuerung der nachfolgenden Immunreaktionen eine zentrale Rolle einnimmt sollte zudem die Interaktion bakterieller DNA-Motive und weiteren PAMPs (LPS, LTA) mit Surrogatzellen – den in vitro generierten Makrophagen aus Blutmonozyten – stellvertretend geprüft werden.

2 Literaturübersicht

Nach Infektion mit verschiedenen Erregern reagiert der Säugerorganismus mit einer Immunantwort (oder verschiedenen Immunmechanismen), die zum Ziel hat, die Ausbreitung des Erregers zu verhindern, den Erreger zu eliminieren und ein immunologisches Gedächtnis aufzubauen, das ihm ermöglicht bei erneutem Kontakt mit dem Erreger diesen schneller zu eliminieren.

Der primäre Kontakt mit dem Erreger und seinen Bestandteilen erfolgt durch Epithelzellen, Dendritischen Zellen und Gewebsmakrophagen. Diese Zellen stellen die ersten Barrieren sowie die ersten Signalgeber für das Vorhandensein eines potentiell schädigenden Agens dar.

Da diese Zellen über keine Antigen spezifischen Rezeptoren verfügen und somit nicht im klassischen Sinn zwischen „Selbst“ und „Fremd“ unterscheiden können, wurde ein weiteres Paradigma in die Immunologie aufgenommen. Dies besagt, dass es weniger auf die

„Fremdheit“ eines Antigens ankommt um entzündliche oder adaptive Immunantworten auszulösen, sondern vielmehr, dass das Antigen in der Lage ist, „Gefahr“ für den Organismus zu signalisieren. Dieses Konzept der „Danger Signals“ wurde erstmalig von MATZINGER (1994) zur Diskussion gestellt und seit dieser Zeit mit grossem Gewinn für das Verständnis initialer Immunprozesse ausgiebig diskutiert.

2.1 „Danger Signals“ (DS) für das Immunsystem

Das Vorliegen von Danger Signalen führt in verschiedenen Zelltypen des Immunsystems zu charakteristischen Folgeprozessen, die letztendlich das Startsignal für eine erfolgreiche Auseinandersetzung mit dem Träger oder Aussender des DS darstellen. DS können sowohl endogener als auch exogener Herkunft sein (MATZINGER 2002). Exogene DS sind nicht genau definiert, doch werden Moleküle wie das NiCl2, MnCl2, CoCl2 und SnCl2 zu einer Gruppe exogener DC-Schadstoffe gezählt. Nach MATZINGER (2002) wirken exogene Faktoren wie z.B. LPS, Lipoproteine oder CpG Motive als Danger Signals, da sie ebenfalls an identischen Rezeptoren (CD14, TLR-2, -4, -9) binden. Die exogenen Signale werden von Zellen des angeborenen Immunsystems, z.B. APC über genetisch determinierte Rezeptoren erkannt (HALLMAN et al. 2001), aufgenommen, prozessiert und über Oberflächenmoleküle präsentiert. Weiterhin führen sie zur Ausschüttung kostimulatorischer Signale, die das adaptive Immunsystem alarmieren (GALLUCCI und MATZINGER 2001, HALLMAN et al.

2001). Die endogenen DS sind Moleküle, die von Zellen unter besonderen Stressverhältnissen (bis zum abnormen Tod/Nekrose; s. S. 35, 2.7), abgegeben werden. Endogene DS werden

zum anderen in konstitutiv vorliegende und neusynthetisierte Signale unterteilt (GALLUCCI und MATZINGER 2001). Zu den „Primalen“ Signalen gehören u.a. Säugetier DNA, CD40- ligand, TNF-α und IL-1β, die aber wegen ihrer weiteren Präsenz auch als Feedback Signal eingeordnet werden. Sie gehören in jedem Fall zu den konstitutiven DS. Induzierbare

„Primale“ Signale sind z.B. Typ I IFN und Reaktive Sauerstoffspezies. Typ I IFN zählt ebenfalls zu den Feedbacksignalen. HSP (Heatshock Proteine) verbinden die Gruppen der konstitutiv exprimierten und induzierten Signale.

2.2 Erkennung von Erregern oder deren Bestandteilen durch Komponenten des Immunsystems

Die Erkennung pathogener Organismen erfolgt meist spezifisch. Ein erster Weg ist die Erkennung konservierter Strukturen von Pathogenen mittels spezifischer, genetisch determinierter Rezeptoren (s. 2.2.3). Zu ihnen gehören u.a. die Cluster of Differentiation (CD) und Toll-like-Rezeptoren. Im adaptiven Immunsystem erkennen T- und B-Zell Rezeptoren dargebotene, prozessierte Bestandteile. Spezifische Immunglobuline erkennen ebenfalls Ag- strukturen und werden ihrerseits über Fc-Rezeptoren erkannt. Auch über die Bindung von Mannose-bindendem Lektin (MBL) kann es zur Aktivierung der Komplementkaskade kommen. Auf weitere Möglichkeiten wird in dieser Literaturübersicht nicht eingegangen.

2.2.1 Mannose bindendes Lektin (MBL)

Mannose bindendes Lektin (MBL) gehört zu der Protein-Familie der Kollektine. Es besteht aus Oligomeren, die jeweils aus drei Peptidketten, mehreren Lektin-Domänen, kollagenen Strukturen und einer Cystein-reichen N-terminalen Region aufgebaut sind (SASTRY et al.

1989, TAYLOR et al. 1989). Es ist ein Ca²⁺-abhängiges Lektin, das an 3- und 4- Hydroxylgruppen verschiedener Zucker z.B. auf mikrobiellen Oberflächen bindet (DRICKAMER 1992, WEIS et al. 1992). Nicht nur strukturell, sondern auch funktionell ist MBL dem C1q sehr ähnlich. Beide Proteine spielen eine wichtige Rolle in der Komplement- aktivierung, der Opsonisierung mikrobieller Bestandteile und der Phagozytose dieser, sowie apoptotischer Zellen durch Phagozyten (Neutrophile und Makrophagen). MBL vermittelt einen dritten Weg der Komplementaktivierung, der parallel zu dem klassischen Weg über C1q und dem alternativen Weg über Properdin/ Faktor-D läuft. Im humanen System sind 4 MBL Mutanten bekannt, die geographisch voneinander getrennt nur in bestimmten Bevölkerungsgruppen vorkommen und in Zusammenhang mit dem systemischen Lupus erythematodes und Rheuma in Verbindung gebracht werden (LIPSCOMBE et al. 1992).

2.2.2 Cluster of differentiation 14 (CD14)

CD14 ist ein auf Monozyten, Makrophagen und Granulozyten (YANG et al. 1995) exprimierter Rezeptor, der in hohen Konzentrationen auch solubilisiert vorliegt. Er ist Bestandteil des TLR-4-Komplexes (Toll-like-Rezeptor 4), dem Rezeptor für LPS (s. S. 16).

Die in Lösung befindlichen Rezeptoren können nach der Bindung an LPS, Zellen, die kein CD14 exprimieren, aktivieren (HAZIOT et al. 1993). CD14 ist über Glycosylphospha- tidylinositol (GPI) in der Zellmembran verankert, besitzt jedoch in Ermangelung eines zytoplasmatischen Anteils keine Fähigkeit zytoplasmatische Signale zu transduzieren (ULEVITCH und TOBIAS 1995). Nach der Bindung des LPS-CD14-Komplexes an TLR-4 wird eine Enzymkaskade in Gang gesetzt, in deren Folge Zytokine wie z.B. Tumor Nekrose Faktor, IL-1, IL-6 und IL-8 ausgeschüttet (DENTENER et al. 1993, SCHUMANN et al.

1996) und die Expression verschiedener Oberflächenmoleküle, unter anderem Adhäsionsmoleküle, akzeleriert werden. Weiterhin ist CD14 für die Differenzierung apoptotischer und nekrotischer Zellen von Bedeutung (SCHLEGEL et al. 1999). Bei Makrophagen ist die Qualität der weiteren Reaktion von der Bindung durch CD14 abhängig.

Für den Menschen und die Maus wurde beschrieben, dass LPS sich mit in Serum befindlichem LBP (Lipopolysaccharid-binding protein) kreuzvernetzen muss, um an CD14 binden zu können (ADEREM und ULEVITCH 2000). LBP ist ein Akute-Phase Protein der Leber, dessen Konzentration während systemischer Infektionen und der Akute-Phase Antwort dramatisch steigt. Es ist für die Monomerisierung von LPS-Vesikeln und dem anschließenden Transport zu den membranständigen CD14-Rezeptoren zuständig (SCHUMANN et al. 1996, LAMPING et al. 1998) Im Gegensatz zum murinen und humanen System scheint dies im bovinen System nicht notwendig zu sein (JUNGI et al. 1997).

2.2.3 Toll-like-Rezeptoren

Der Name Toll-like-Rezeptor stammt von der bei der Fruchtfliege Drosophila als erstes entdeckten Rezeptorfamilie „Toll“ ab, die dem konstitutiven Immunsystem angehört. Sie bestehen aus einer extrazellulären leukin-reichen Region, einer transmembranalen Region und einem intrazellulären Bereich, der dem des IL-1 Rezeptors ähnlich ist. Toll besitzt einen spezifischen Liganden namens Spätzle. Spätzle ist ein durch die Verarbeitung mikrobieller Bestandteile entstandenes Molekül (MUZIO und MANTOVANI 2001). Tab. 1 gibt einen Überblick über die bislang identifizierten TLR und mögliche Liganden.

Aufgrund der hohen Homologie in Struktur und Gensequenz zu diesen Toll Rezeptoren konnten bei Mensch und Maus mindestens 10 verschiedene Toll-like-Rezeptoren identifiziert werden. Zurzeit ist noch kein Pendant zu Spätzle entdeckt worden, doch konnten spezifische Liganden einzelner TLR definiert werden, die gesamthaft der Gruppe der so genannten PAMPs (Pathogen Associated Molecular Patterns) angehören (s. S. 22, 2.3). Diese Strukturen mit höchst konserviertem Aufbau kommen in einem sehr großen Spektrum von Mikroorganismen vor (MEDZHITOV et al. 1997). Zu ihnen gehören z.B. Lipoprotein, Flagellin (TLR-5), unmethylierte DNA-Motive (CpG-Motive) aus Nicht-Vertebraten (TLR- 9), sowie Mannane und Mannoproteine aus Hefen (s. Tab. 1). Ebenso wie die Rezeptoren der Toll Familie bei Drosophila bestehen auch die TLRs aus einer extrazellulären und einer intrazellulären Domaine, die die Zellmembran einmal kreuzt. Der intrazelluläre Anteil ist sowohl dem IL-1 Rezeptor als auch dem der Toll Rezeptoren sehr ähnlich und wird TIR (Toll/Interleukin-1 Rezeptor) genannt (GAY und KEITZ 1991). Alle Rezeptoren bis auf TLR- 9, dessen Lokalisation noch nicht eindeutig geklärt ist, befinden sich an der Oberfläche der Zellen (ARMANT und FENTON 2002). KRIEG (1999) beschreibt die Bindung und anschließende Internalisierung von CpG-Motiven von Zellen, die TLR-9 auf der Oberfläche exprimieren, wohingegen ARMANT und FENTON (2002) von einer intrazellulären Lokalisierung ausgehen. TLRs sind ein viel versprechendes Bindeglied zwischen den Erkennungsmechanismen von konstitutivem und adaptivem Immunsystem. Alle TLRs führen nach Bindung an ihre Liganden durch ähnliche intrazellulär ablaufende Mechanismen im Endeffekt zur Bildung von NF-κB oder JNK (c-JUN N-terminal kinase). Die Bindung von spezifischen Liganden an ihren Rezeptoren kann zur Freisetzung von Zytokinen und kostimulatorischen Molekülen und/oder Veränderung der Expression von Oberflächenmolekülen führen (MEDZHITOV und JANEWAY 1997).

Tab. 1 Toll-like-Rezeptoren und ihre Liganden

Rezeptor Exogene Liganden Endogene Liganden

TLR-2 +TLR-1, +TLR-6

Bakt. Lipoproteine, Peptidoglykane,

Zymosan (Saccharomyces), GPI anchor (T. cruzi),

LPS von L. interrogans und P. gingivalis, Lipoarabinomannan (M. tuberculosis), Phosphatidylinositol (M. tuberculosis)¹, LTA²

TLR-3 Doppelsträngige DNA³

TLR-4 LPS,

F protein (resp. syncytial virus)¹

Taxol, HSP60,

Fibronectin EDA TLR-5 Flagellin¹

TLR-7 Imidazoquinoline⁴

TLR-9 Unmethylierte CpG-Motive¹

Bislang sind die spezifischen Liganden der Toll-like-Rezeptoren nicht komplett identifiziert. Diese Tabelle gibt einen Überblick über den derzeitigen Stand der Untersuchungen.

(¹Underhill und Ozinsky 2002, ²Muzio und Mantovani 2001, ³Alexopoulou et al. 2001, ⁴Hemmi et al.

2002) GPI = Glycosylphosphatidylinositol, HSP60 = Heat Shock Protein 60, LPS = Lipopoly- saccharid, LTA = Lipoteichonsäure

TLR-4

Der TLR-4 ist der am besten untersuchte Toll-like-Rezeptor. Er wird auf den Zellen des peripheren Blutsystems und Makrophagen am stärksten exprimiert, kann aber auch auf anderen Zellen detektiert werden (MEDZHITOV et al. 1997). Sein Hauptligand ist LPS, Lipopolysaccharid aus der Zellmembran Gram negativer Bakterien. LPS ist allein über die Bindung an TLR-4 in der Lage, Zellen in geringem Ausmaß anzuregen. Wenn LPS im Serum an LPS-bindendes Protein bindet, welches dann das LPS an CD14 liefert, und dieser Komplex eine Bindung mit TLR-4 eingeht, dann entsteht ein stärkerer Effekt. Die genaue Bindung an den TLR-4 ist derzeitig noch nicht geklärt. KURT-JONES et al. (2000) vermuten im Gegensatz zu JESSE et al. (1999), dass sowohl CD14 als auch TLR-4 für die Erkennung notwendig sind. Für eine starke Aktivierung der Zelle ist nach SHIMAZU et al. (1999) zusätzlich noch die Bindung des Proteins MD-2 notwendig, einem MD-1 Homolog, das die

Synzytialvirus über das Fusionsprotein F zu erkennen (KURT-JONES et al. 2000). Taxol, HSP60 und Fibronectin EDA sind körpereigene Substanzen, die ebenfalls durch TLR-4 erkannt werden. Taxol benötigt ebenso wie LPS auch einen TLR-4-MD-2 – Komplex (KAWASAKI et al. 2001). Die Bindung durch HSP60 an den TLR-4 scheint ebenfalls MD-2 abhängig zu sein. HSP60 ist jedoch nicht spezifisch für TLR-4, sondern kann auch durch TLR-2 erkannt werden (VABULAS et al. 2001). Fibronectin EDA (Extra Domain A) entsteht durch alternatives Splicing bei Gewebsverletzungen. Dieses ruft über TLR-4 in monozytoiden Zellen inflammatorische Reaktionen hervor, was OKAMURA et al. (2001) zu der Vermutung geführt hat, dass dieser Mechanismus bei Gewebsschädigungen für die inflammatorische Wirkung in vivo zuständig ist.

TLR-2, TLR-1 und TLR-6

TLR-2 erkennt hauptsächlich Bestandteile Gram positiver Bakterien (MUZONI und MANTOVANI 2001). Es gibt Ausnahmen in der Erkennung von LPS, denn TLR-2 bindet spezifisch LPS von Porphyromonas gingivalis und Leptospira interrogans. Diese Bindung scheint, wie auch die Bindung von LPS an TLR-4, ebenfalls von CD14 abhängig zu sein (HIRSCHFELD et al. 2001). Die Hauptliganden sind bakterielle Lipopeptide, Peptidoglykane, und Zymosan. Ob Lipoteichonsäure (LTA) ein Ligand des TLR-2 oder TLR-4 ist wird kontrovers diskutiert (SCHWANDNER et al. 1999, YOSHIMURA et al.

1999, TAKEUCHI et al. 1999). Nach SCHRÖDER et al. (2003) bindet LTA von sowohl Streptokokkus pneumoniae als auch Staphylococcus aureus über LBP und CD14 an TLR-2, nicht aber an TLR-4. MD-2 hat keine Auswirkungen auf die Effektivität der LTA- Stimulation. Auch prokaryotisches GPI als Ankermolekül für die Bindung vieler Proteine an die Membran von Trypanosoma cruzi ist ein spezifischer Ligand für TLR-2 (CAMPOS et al.

2001). Durch strukturelle Unterschiede zwischen Säuger-GPI und dem prokaryotischem GPI von Mikroorganismen ist eine differentielle Erkennung durch TLR-2 möglich. Ob die zusätzliche Bindung von CD14 notwendig ist, wurde bislang noch nicht untersucht. Die direkte Bindung der beschriebenen Liganden an den TLR-2 wurde bislang noch nicht nachgewiesen.

Entscheidend für die zelluläre Stimulation durch den TLR-2 ist die Ineffizienz monomerer TLR-2 Rezeptoren, eine Zelle zu aktivieren. Um eine Aktivierung der Zellen zu erreichen, ist es unabdingbar, dass sich ein Heterodimer aus TLR-2 mit TLR-6 oder mit TLR-1 bildet (UNDERHILL und OZINSKY 2002). Durch eine einseitige Blockade von TLR-2 oder TLR-6 konnte die Aktivierung muriner Makrophagen durch Gram positive Bakterien sowie Zymosan verhindert werden (OZINSKI et al. 2000, HAJJAR et al. 2001). Obwohl eine direkte Bindung

der Liganden an TLR-2 noch nicht bewiesen wurde, ist es durchaus denkbar, dass nach einer Primäraktivierung entstehende Moleküle an die TLRs binden und somit auch für die Notwendigkeit verschiedener TLR-Kombinationen zuständig sind. Für die Aktivierung von Zellen durch triazylierte bakterielle Proteine ist z.B. keine Heterodimerbildung notwendig (OZINSKI et al. 2000).

TLR-3

In einer Studie von ALEXOPOULOU et al. (2001) wurde doppelsträngige, virale DNA als ein Ligand für TLR-3 identifiziert.

TLR-5

Das besondere an seinem derzeitig identifizierten spezifischen Liganden, dem bakteriellen Flagellin, ist, dass es ein reines Protein ist. Um eine Aktivierung zu initiieren, muss TLR-5 ein Homodimer bilden. Die Bindung des Flagellins induziert in den Zellen über die Aktivierung der NF-κB die Bildung von TNF-α (HAYASHI et al. 2001).

TLR-7

HEMMI et al. (2002) konnte eine Aktivierung von TLR-7 präsentierenden Zellen durch kleine anti-virale Bestandteile wie Imidazoquinoline nachweisen, doch bleibt der natürliche Ligand weiterhin unklar. Die Aktivierung erfolgt ebenfalls über die MyD88-abhängige Signalkaskade.

TLR-9

TLR-9 bindet spezifisch DNA-Sequenzen. Sowohl DNA-Motive mit einem zentralen CG- Dinukleotid (CpG-Motive) als auch DNA-Motive mit einem reversen, zentralen Motiv (GpC- Motive), ligieren mit dem TLR-9 und werden endosomal bzw. lysosomal internalisiert (HACKER et al. 1998). Bis heute konnte keine Zellaktivierung durch die reversen Sequenzen nachgewiesen werden. CD14, MD-1 und MD-2 haben keine Auswirkung auf die Aktivierung von Zellen durch TLR-9 (BAUER et al. 2001). Die Beobachtungen durch HARTMANN et al.

(2000), dass unterschiedliche CpG-Motive für Maus und Mensch eine optimale Aktivierung der Zellen hervorrufen, stellte sich auch für BAUER et al. (2001) in der Spezifität humaner und muriner TLR-9 Rezeptoren für unterschiedliche Sequenzen dar. Zur Aktivierung ist keine Kreuzvernetzung verschiedener TLR nötig. Die Signalkaskade des TLR-9 scheint nicht

NF-κB Induktion durch DNA-Sequenzen, nicht aber die Aktivierung durch IL-1 oder TNF inhibiert werden konnte.

TLR-8 und TLR-10

Zu den Spezifitäten sowie zu den Aktivierungsmechanismen liegen derzeitig noch keine Daten vor.

Funktionelle Konsequenz einer TLR-vermittelten Zellaktivierung

Nach Bindung der spezifischen Liganden können zwei unterschiedliche Wege der Aktivierung eingeschlagen werden (s. Abb. 1). Entweder es erfolgt eine Aktivierung von NF-κB oder der zur AP-1 Familie der Transkriptionsfaktoren gehörenden Proteine JUN und FOS. NF-κB ist ein wesentlicher Transkriptionsfaktor für die Aktivierung immunrelevanter Gene, besonders für die induzierte Synthese von entzündungsvermittelnden Zytokinen (z.B.

TNF-α, IL-1) (HATADA et al. 2000) und bakterizider Radikale, wie z.B. NO (SWEET et al.

1998, SHODA et al. 2001a). Nach der Konformationsänderung des TIR, dem Toll/Interleukin-1 Rezeptor, werden die MyD88 und TOLLIP (Toll interacting protein) rekrutiert. Anschließend werden die Serin-/Threonin-Kinasen aktiviert, die der IRAK-Familie (IL-1-receptor-associated kinases) angehören. IRAK-1 und -2 assoziieren mit TRAF6 (TNR- receptor-associated factor 6), einem weiteren Adapterprotein. Der TRAF6 aktiviert sowohl TAD1 (TGF-β-activated kinase) als auch MKK6 (mitogen-activated protein kinase kinase).

Weiterhin kommt es entweder zur Degradierung von Iκ-B und anschließender Translokation von NF-κB zum Zellkern oder zur Aktivierung der c-JUN N-terminal kinase (JNK) bzw. der p38 MAP Kinase. Letztlich können Apoptose sowie ein großes Spektrum an Zytokinen, unter anderen IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF-α induziert werden (KRUTZIK et al. 2001).

ARBIBE et al. (2000) beobachteten in ihren Untersuchungen eine physikalische Verbindung zwischen Rac1 und Phosphatidylinositol-3-OH kinase (PI3 Kinase) im Zusammenhang mit TLR-2. Auch in TLR-4 positiven, MyD88 defizienten Zellen kann nach KAWAI et al. (1999) eine geringe Induktion von NF-κB beobachtet werden, was zu dem Schluss führt, dass Signaltransduktion über einen akzessorischen Mechanismus möglich ist. Ein zusätzliches Molekül namens TIR domain-containing adapter protein (TIRAP) oder MyD88-adapter-like (MAL) wurde identifiziert. Nach der Bindung wird über auto- bzw. parakrine Mechanismen IFN-β produziert. IFN-β ist für die Produktion der iNOS (inducible nitric oxide synthase) und das interferon inducible protein 10 (IP10) notwendig (TOSHCHAKOV et al. 2002).

P P IFN-beta IFNAR

TRAF-6 TAK1 MAP kinase

NF-kappaB

IFN-beta

Jak/Tyk

IL-1beta

TNF-alpha INOS

IP-10 Tyr(701)

Ser(727) STAT1

P P

P P IL-6

+

TLR-2 TLR-4

TIRAP/Mal MyD88

+TOLLIP

MyD88 +TOLLIP

Abb. 1 Intrazelluläre Signaltransduktion nach Bindung an TLR-2 oder TLR-4

Diese nach ARMANT und FENTON (2002) modifizierte Graphik zeigt die intrazelluläre Signaltransduktion nach der Bindung spezifischer Liganden an TLR-Rezeptoren. Beispielhaft sind TLR-2 und TLR-4 genannt.

In den meisten Studien wird ausschließlich über die Spezifität einzelner mikrobieller Bestandteile, ihre Bindung und Effekte berichtet. Wahrscheinlich liegt jedoch ein Zusammen- spiel verschiedener mikrobieller Bestandteile eines Organismus über verschiedene TLR an einer Zelle vor, die je nach Ligand in angepasste, leicht unterschiedliche Reaktionen münden (UNDERHILL und OZINSKY 2002). Eine Heterodimerisierung unterschiedlicher TLRs kann zur Veränderung der Ligandenspezifität der TLRs führen, was an der Interaktion von TLR-2 mit TLR-6 gezeigt werden konnte (OZINSKY et al. 2000, TAKEUCHI et al. 2001).

Bovine Toll-like-Rezeptoren

Die publizierten Studien beziehen sich bisher auf den TLR-2, TLR-4 und TLR-9. Das Gen zu TLR-4 liegt auf Chromosom 8, das für TLR-2 auf Chromosom 17 (WHITE et al. 2003). Auch die Gensequenzen zu TLR-2, TLR-3, TLR-4 und TLR-9 sind bekannt. TLR-2 und TLR-4 werden auf Monozyten, Makrophagen und Dendritischen Zellen exprimiert (WERLING und JUNGI 2003). Im Gegensatz zu Monozyten und Makrophagen zeigen Dendritische Zellen keine Reaktion auf TLR-2/-4 Liganden. Die Studien über TLR-9 beschränken sich

hauptsächlich auf die Erforschung der Wirkung von CpG-Motiven auf Zellen des Immunsystems (Lymphozyten, Monozyten, Makrophagen). Hier dienten Zytokinproduktion, Proliferation und die Induktion von iNOS als Kriterien der Aktivierung (BROWN et al. 1998, SHODA et al. 2001b, PONTAROLLO et al. 2002). Es ist noch nicht bekannt, ob CpG-Motive über TLR-9 oder einen anderen Weg Dendritische Zellen stimulieren (s. Tab. 2c), obwohl eine gesteigerte IL-12, TNF und NO Produktion beobachtet wurden (WERLING und JUNGI 2003). Nach Bindung der Liganden wird auch beim Rind NF-κB transloziert. Die bei Mensch und Maus beschriebenen alternativen Wege des TLR-4 sind beim Rind noch nicht untersucht worden (s. S. 16).

TLR-vermittelte Makrophagenaktivierung

In den bisherigen Studien zu Makrophagenaktivierung durch TLR-Liganden lag das Hauptaugenmerk auf der Zytokininduktion. Die Induktion von IL-1β, IL-12 und TNF-α (BRIGHTBILL et al. 1999, SU et al. 2000, CAMPOS et al. 2001, JONES et al. 2001) konnte nachgewiesen werden. CAMPOS et al. (2001) zeigte ebenfalls die Induktion der iNOS in Makrophagen. In LPS-stimulierten Makrophagen konnte über die TLR-4 vermittelte Aktivierung von NF-κB auch eine Steigerung der induzierbaren Cyclooxygenase-2 (COX-2) nachgewiesen werden (RHEE und HWANG 2000). Bestimmte TLR-Liganden scheinen in der Lage zu sein, die MHC-Klasse-II-Expression und die Antigenprozessierung herabzuregulieren (NOSS et al. 2001). Derzeitig liegen keine weiteren Ergebnisse über funktionelle Konsequenzen der TLR-vermittelten Makrophagenaktivierung vor.

TLR-Expression und Regulation nach Stimulation

TLRs unterliegen einer Expressionsmodulation sowohl durch Pathogene als auch durch Zytokine. So wurde TLR-2 nach Infektion von murinen Makrophagen mit Mycobacterium avium heraufreguliert, während die Expressionsdichte von TLR-4 sank (WANG et al. 2000).

Die Induktion einer gesteigerten TLR-2-Expression auf Makrophagen gelang auch nach Inkubation der Zellen mit verschiedenen Zytokinen (TNF-α, IL-1α, GM-CSF, jedoch nicht IFN-γ) (WANG et al. 2000). Über die Regulation der Expression von TLRs beim Rind gibt es bisher keine publizierten Daten.

2.3 Pathogen assoziierte molekulare Muster

2.3.1 CpG-Motive

Bereits seit Mitte der 1980er Jahre ist bekannt, dass bakterielle DNA tumorunterdrückende Wirkung besitzt (TOKUNAGA et al. 1984). TOKUNAGA et al. (1988) beschrieben die Fähigkeit synthetischer, einzelsträngiger DNA-Sequenzen zur IFN-α, β und γ Produktion sowie der Vermehrung von NK-Zellen. Erst 1992 veröffentlichten KURAMOTO et al. erste Vermutungen über die Bedeutung bestimmter sechs-Basen-Palindromen (poly(dG,dC)) für diese Effekte. Dies geriet in Vergessenheit, bis man Jahre später erneut realisierte, dass nichtmethylierte Oligodeoxynukleotide (ODNs) immunmodulierend wirken können. Durch TOKUNAGA et al. (1988), MESSINA et al. (1993) und PARK et al. (1994) wurden poly(dA,dU) und poly(dG,dC) Sequenzen entdeckt, die sowohl eine tumorsuppressive als auch eine proliferative Wirkung auf B-Lymphozyten besitzen. Nicht nur in anfänglichen Studien wurde festgestellt, dass reverse Sequenzen teilweise identische Effekte wie die Ursprungssequenz zeigen, doch konnte dies nicht für alle Sequenzen gezeigt werden (TANAKA et al. 1992). In der Schlussfolgerung wurden CG-Dinukleotide als die entscheidenden Kernelemente der DNA-Sequenzen definiert (KRIEG et al. 1995).

Definition und Vorkommen

CpG-Motive sind nichtmethylierte, einzelsträngige DNA-Sequenzen, die in 5’-3’-Richtung ein Cytosin-Phosphat-Guanosin-Dinukleotid besitzen. Nichtmethyliert bedeutet, dass am C5- Atom des Cytosins keine Methylgruppe gebunden ist (sonst Methylcytosin). Im Vertebraten- genom sind die Cytosin Moleküle zumeist methyliert (BIRD 1987). Weiterhin werden CG- Dinukleotide in Vertebraten soweit unterdrückt, dass sie nur in einem Viertel der erwarteten Häufigkeit vorkommen (BIRD 1987). Zu unterscheiden ist zwischen natürlich gewonnener DNA aus Bakterien, Viren (KRIEG et al. 1995) und Parasiten (KARLIN et al. 1994), die ein Phosphodiester (PD) Rückgrat besitzen und synthetisierten, die entweder ein „natürliches“ PD oder ein Phosphorothioat (PT) Rückgrat besitzen. Diese Veränderung des Rückgrats hemmt den schnellen Abbau durch ubiquitär vorkommende Nukleasen (ZHAO et al. 1993) und führt zu einer schnelleren Aufnahme (SESTER et al. 2000). Von entscheidender Bedeutung für die biologische Funktion sind in erster Linie die flankierenden zwei Nukleinsäuren in sowohl 3’- also auch 5’- Richtung. Es bestehen Speziesunterschiede in der optimalen immunmodula- torischen Sequenz.

Die „optimalen“ Sequenzen sind bislang für Mensch, Maus, Rind, Katze und Hund bestimmt worden (YI et al. 1998a, KRIEG et al. 1999, RANKIN et al. 2001, PONTAROLLO et al.

2002).

Maus: GACGTT

Mensch/Rind/Katze/Hund: GTCGTT

Wurden zunächst in den Studien zur Wirkungsweise der Sequenzen Hexamere eingesetzt, so wurde im Laufe der Zeit deutlich, dass längere Sequenzen, die mehrere CG-Dinukleotiden enthalten, effektiver wirken. Momentan verwendete Sequenzen enthalten teilweise über zwanzig Nukleotide. Mehrere hundert Motive sind im humanen und murinen System getestet worden. Diese längeren Motive können in ihrer Wirkung in immun-stimulatorische und immun-neutralisierende Sequenzen unterschieden werden. Die flankierenden Basen sind dafür von entscheidender Bedeutung. Im Vertebratengenom flankieren meist immun- neutralisierend wirkende Nukleotide (…CCG… oder …CGG…) das CG-Dinukleotid (KRIEG et al. 1998b). Solche Sequenzen sind sechsfach häufiger als immun-stimulatorische Sequenzen. Die biologische Funktion der putativ neutralisierenden Motive ist derzeitig noch nicht geklärt.

Molekulare Mechanismen der Immunstimulation durch CpG Motive

Über die Bindung an und die Aufnahme der DNA-Sequenzen in die Zellen existieren verschiedene Hypothesen. LIANG et al. (1996) stellten die Vermutung auf, dass im humanen System durch die Bindung an einen Oberflächenrezeptor eine Aktivierung der intrazellulären Signalkaskade ohne die zelluläre Aufnahme des CpG-Motivs induziert wird. Andere Arbeits- gruppen haben im murinen System die Notwendigkeit der Aufnahme der Sequenzen in die Zelle nachgewiesen (YAMAMOTO et al. 1994b, KRIEG et al. 1995, HACKER et al. 1998, MACFARLANE und MANZEL 1998). Da die Verhinderung der Azidifizierung von Endosomen auch den Effekt in der Zelle blockiert, kann davon ausgegangen werden, dass eine Aufnahme und endosomale Reifung zur Aktivierung von Zellen notwendig ist (HACKER et al. 1998, MACFARLANE und MANZEL 1998, YI et al. 1998b). Nach KRIEG (1999) gibt es intrazelluläre Proteine, die sequenzspezifisch ausschließlich an nichtmethylierte CpG-Motive binden. In Zellen mit internalisierten CpG-Motiven werden innerhalb von 10-15 min verschiedene Folgeprozesse aktiviert. Zu ihnen gehören die Produktion Reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und der induzierbaren Nitritoxid Synthetase (iNOS) (SWEET et al.

1998, SHODA et al. 2001a), die Aktivierung von NF-κB (STACEY et al. 1996) und AP-1 Pfade (HACKER et al. 1998) sowie der Mitogen aktivierten Proteinkinase (MAPK)-Kinase

(YI und KRIEG 1998). Heute ist bekannt, dass CpG-Motive an TLR-9 binden und eine dem IL-1 Rezeptor ähnliche Signalkaskade aktiviert wird (s 2.2.3).

Wirkungsspektrum von CpG-Motiven bei unterschiedlichen Spezies in vitro

CpG-Motive kommen in natürlicher Form mit einem Phosphodiester (PD) Rückgrat vor. Für eine stärkere Nukleaseresistenz werden synthetische Oligodeoxynukleotide mit einem Phosphorothioat (PT) Rückgrat hergestellt und eingesetzt. Über die Auswirkungen des PT- Rückgrats bestehen unterschiedliche Meinungen. HARTMAN und KRIEG (2000) beschreiben eine erhöhte Aktivierung (B-Zell-Proliferation) beim Menschen. Auch PISETZSKY und REICH (1993), LIANG et al. (1996) und ZHAO et al. (1996) beschreiben im murinen System eine Wirkungssteigerung der CpG Motive durch den Austausch des PD- Rückgrats gegen ein PT-Rückgrat. WERNETTE et al. (2002) erkennen im caninen System (im Gegensatz zum felinen System) eine aktivierende Wirkung des PT-Rückgrats. BOGGS et al. (1997) hingegen beschreiben PT-Motive als weniger wirksam bezogen auf die lytische Kapazität von NK-Zellen. SESTER et al. (2000) weisen darauf hin, dass PD- und PT- Oligodeoxynukleotide je nach untersuchten Effekten auf verschiedene Zellen stärkere bzw.

schwächere Effekte haben können.

CpG-Motive induzieren vorwiegend die Bildung von Th-1-Zytokinen (s. S. 27). Lediglich die Produktion von IL-4 durch T-Lymphozyten (PARRONCHI et al. 1999) widerspricht diesem Grundprinzip. Am weitesten erforscht sind die Effekte von CpG-Motiven auf murine und humane Immunzellen. Das Spektrum der Effekte ist sehr breit (s. Tab. 2), daher soll im Text nur auf Besonderheiten eingegangen werden. Manche der in Tab. 2 aufgeführten Effekte werden durch CpG-Motive indirekt initiiert oder induziert (kursiv dargestellt). Die durch MACFARLANE und MANZEL (1999) beschriebenen adhärenzmindernden Effekte auf Makrophagen sind z.B. indirekt initiiert. Sie können nicht durch die Verwendung von Quinacrine blockiert werden. Ein weiterer Hinweis für die nicht ausschließlich primäre Wirkung der CpG-Motive ist die Ausschüttung unterschiedlicher Zytokine (IFN-α, IFN-γ, IL- 1, IL-4, IL-6, IL-12, TNF-α) die zur Aktivierung anderer Zellenpopulationen führen kann.

Tab. 2 Wirkungsspektrum von CpG-Motiven bei unterschiedlichen Spezies in vitro A) Mensch/Affe

Zellen Oberflächenstrukturen Funktionell Zytokinsekretion B-Zellen CD86↑^ac, CD40↑^c ,

CD54↑ ^c, MHC-KLASSE- II↑^c

Proliferation↑ ^acd IL-6↑^c, IL-12↑^c, IFN-α↑^b

T-Zellen IFN-γ↑^d, IL-4↑^d,

Th-1shift ^d Dendrit. Zellen CD80↑^a, CD86↑^a,

MHC-KLASSE-II↑^a

IFN-γ↑^d, IL-12↑^d Makrophagen Prokoagulationsproteine→^e Adhäsion↓^e,

Vitalität→^e Phagozytose→^e Monozyten CD14↑^e,

MannoseR↓^e

Diff. zu MPh↓^e IL-6↑ⁿ, IL12↑ⁿ, TNF-α↑ⁿ

NK-Zellen CD69↑^a Lyt. Aktivität↑^a

B) Maus

Zellen Oberflächenstrukturen Funktionell Zytokinsekretion B-Zellen c-myc↑^m, egr↑↓ ^m ,

c-jun↑^m, c-fos↓^m

Proliferation↑^am, anti apoptotisch^m

IL-6↑^k, IL-12↑^k

T-Zellen Proliferation↑^l,

Thymozyten PS↑

IFN-γ↑^l, IL-10↑^l

Dendrit. Zellen CD80↑^a, CD86↑^a AG-Präsentation↑^a Milz: IL-6↑^a, IL-12↑^a, IFN-γ↑^m,

TNF-α↑^a, Makrophagen MHC-KLASSE-II↓^f,

sTNF-α-RI/II↓ⁱ, mTNF-α- RI→/II↑ⁱ, CSF-1↓^mu

AG-Prozessierung↓^f, AG-Präsenta-tion↓^f anti apoptotisch^m

TNF-α↑^gi, NO↓^h, iNOS↑^m, verspätet↑^g, IL-12↑ ^k, IFN-α/β↑^k

Monozyten IL-6↑^o, IL-12↑^o, TNF-α↑^o

NK-Zellen Lyt. Aktivität↑^aj IL-12↑^j, TypI IFN↑^j

C) Rind

Zellen Oberflächenstrukturen Funktionell Zytokinsekretion B-Zellen IgM↑^q, IgG1↑^q, IgG2↑^q Proliferation↑ ^pqr IFN-γ↑^q, IL-6↑^t

T-Zellen Proliferation→ ^p IFN-γ→^p

Dendrit. Zellen IL-12↑^st, TNF↑^s, NO↑^s

Makrophagen iNOS-Induktion ^r IL-6↑^t,

IL-12 (p40) ↑^rt, TNF-α↑^r, IL-1β↑^r

Monozyten Aktivierung von

Lymphozyten^p

IL-6↑^t, IL-12↑^t

NK-Zellen

aHARTMANN et al. 2000, ^bYAMAMOTO et al. 1994a, ^cHARTMANN und KRIEG 2000,

dPARRONCHI et al. 1999, ^eMACFARLANE und MANZEL 1999, ^fCHU et al. 1999, ^gCRABTREE et al. 2001, ^hGAO et al. 1999, ⁱJIN et al. 2000, ^jBOGGS et al. 1997, ^kKLINMAN et al. 1996, ^lMANNON et al. 2000, ^mSESTER et al. 1999, ⁿBAUER et al. 1999, ^oKRIEG et al. 1998a, ^pPONTAROLLO et al.

2002, ^qBROWN et al. 1998, ^rSHODA et al. 2000, ^sWERLING und JUNGI 2003, ^tZHANG et al 2001,

uSESTER et al. 1999. ↑ = Steigerung, → = kein Einfluß, ↓ = Senkung.

SESTER et al. (2000) sind der Ansicht, dass murine T-Lymphozyten nicht direkt durch CpG- Motive aktiviert werden, wohingegen MANNON et al. (2000) die Wirkungsweise als direkt ansehen. Die NO-Synthese wird ebenfalls konträr beschrieben. Die durch LPS induzierte Menge wird nach JIN et al. (2000) durch die Zugabe von CpG-Motiven gehemmt. SESTER et al. (1999) hingegen beschreiben im Zusammenspiel mit IFN-γ eine, wenn auch verzögerte (CRABTREE et al. 2001) Steigerung der iNOS. Murine Thymozyten werden lediglich durch CpG-Motive mit einem PT-Rückgrat zur Proliferation angeregt (MANNON et al. 2000). In vivo konnte nach einmaliger Gabe von CpG-DNA ein zwei- bis vierwöchiger Schutz vor Infektionen mit Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, Bacillus anthracis, Plasmodium spezies, Leishmania major und Schistosoma mansoni erreicht werden (VAN DER STEDE et al. 2002). Ebenfalls konnte durch CpG-Gabe eine Steigerung der lytischen Aktivität von NK-Zellen erzielt werden (BOGGS et al. 1997).

Aus bisherigen Studien über die Interaktion boviner Immunzellen mit CpG-Sequenzen liegen nur sehr begrenzt Daten vor. Ein Großteil der Untersuchungen wurde mit nativer DNA aus Bakterien und Protozoen durchgeführt. Diese Ergebnisse sind kursiv in Tab. 2c dargestellt.

erwiesen, ob die Aktivierung über den TLR-9 oder anderweitig erfolgt (WERLING und JUNGI 2003).

Einzelne Studien existieren für weitere Spezies. Über canine und feline Zellen berichten WERNETTE et al. (2002) über eine Proliferationsinduktion durch verschiedene CpG-Motive in B-Zellen aus Milz, Lymphknoten und Blut. Porcine Blutmonozyten reagieren mit Proliferation und Sekretion von IL-6, IL-12 und TNF-α (KAMSTRUP et al. 2001).

JØRGENSEN et al. (2001) beschrieben für den Atlantischen Lachs (Salmo salar L.), dass durch unterschiedliche CpG-Motive in Kopfnieren-Leukozyten IFN-ähnliche Zytokine sowohl vom Typ I also auch vom Typ II induziert werden können. Die Differenzierung der Zellen in adhärente und nicht-adhärente erlaubte den Nachweis der Aktivierung unter den nicht-adhärenten Zellen. In einer übergreifenden Studie wurde die Proliferation induzierende Potenz verschiedener CpG Motive in zehn Spezies überprüft (RANKIN et al. 2001). Bei allen untersuchten Spezies (Cotton Rat, Huhn, Hund, Katze, Kaninchen, Maus, Pferd, Schaf, Schwein und Ziege) konnte, wenn auch in unterschiedlichem Ausmaß, eine Proliferations- induktion nachgewiesen werden.

Wirkungsspektrum bei unterschiedlichen Spezies in vivo CpG-Motive als Adjuvans

Durch den Einsatz von CpG-Motiven als Adjuvanzien konnten im Vergleich zu Aluminiumverbindungen motivabhängig nach der primären Immunisierung bzw. nach der Boosterimpfung die bis zu 66- bzw. 16-fache Steigerung der antigen-spezifischen Immunantwort erreicht werden (HARTMANN et al. 2000). Nach der Erstimmunisierung liegt der Antikörpertiter unter Verwendung der CpG-Motive als Adjuvans demnach bereits in Bereichen der Boosterimpfung mit herkömmlichem Adjuvans (HARTMANN et al. 2000, VAN DER STEDE et al. 2002, VLEUGELS et al. 2002). CpG-Motive initiieren im Gegensatz zu Aluminiumhydroxid eine humorale und zelluläre Th-1-Antwort. RANKIN et al.

(2002) beschreiben bei kostimulatorischer Gabe die Änderung einer reinen Th-2-Antwort in eine ausgeglichene Th-2:Th-1-Antwort. Ebenfalls ist bei adulten Tieren (nicht bei Neugeborenen) die Umkehrung einer primären Th-2-Antwort durch Boosterimpfung mit CpG-Adjuvans in eine Th-1 Antwort möglich (KOVARIK et al. 1999). Die quantitativ schwächere Immunreaktion neonataler Säuger auf Impfungen kann zudem durch Zugabe von CpG-Motiven zum Impfstoff verbessert werden. Schwache Th-2-Antworten konnten bei Mäusen in eine stärkere Th-1 Antwort mit B-Zell-Proliferation, Th-1-Zytokinsekretion von Antigen präsentierenden Zellen und vermehrter IgG2a und IgM-Produktion gewandelt werden (KOVARIK et al. 1999, CHELVARAJAN et al. 1999). Da die Effizienz der

Adjuvanzien mit CpG-Motiven in Kombination potenziert wird, können sie in ihrer Dosierung minimiert und somit die Gewebsreizung vermindert werden. CpG-Motive als Adjuvans führt auch bei mucosaler Gabe zu einer signifikanten Steigerung der lokalen wie auch der systemischen Immunantwort (HORNER et al. 2000, MCCLUSKIE und DAVIS 2001, AVIVA et al. 2002). Erste Untersuchungen mit ähnlichen Effekten liegen ebenfalls für Nutztiere (Schwein, Rind, Schaf und Geflügel) vor (IOANNOU et al. 2002, RANKIN et al.

2002, VAN DER STEDE et al. 2002, VLEUGELS et al. 2002).

CpG-Motive in DNA-Vakzinen

DNA-Vakzine enthalten in Plasmiden für Antigen kodierende Sequenzen, die im geimpften Individuum translatiert werden (MCCLUSKIE et al. 2000, LEITNER et al. 2001). Zur Steigerung der Wirkung werden pro Plasmid bis zu 200 CpG-Dinukleotide eingebaut. Um eine zu starke Th-1-Reaktion zu verhindern, werden sowohl Immun-stimulatorische (..CCG..) als auch Immun-neutralisierende (..CGG..) Sequenzen eingebaut.

CpG-Oligodeoxynukleotide in der Therapie von Allergien und Tumoren

Verschiedene CpG-Sequenzen wurden in Kombination mit dem Allergen i.m., s.c., i.p. oder mucosal appliziert und die Konversion einer bestehenden Th-2-dominierten Immunantwort in eine Antwort mit Th-1-Charakteristik erzielt. Die Zahl peripherer eosinophiler Granulozyten sank, ebenso wie die Plasmakonzentration von IL-4. Gesteigert wurden die Konzentrationen von IFN-γ und IL-12. Durch die Gabe von CpG-Motiven an infantile Säugetiere kann eine Th-1 dominierte Immunlage erreicht werden, die jedoch zu einem erhöhten Risiko von Autoimmunerkrankungen führt (WILD und SUR 2001).

WARREN und WEINER (2002) konnten durch CpG-Sequenzen allein keinen, durch kombinierte Gaben von CpG-Motiven und monoklonalen, tumor-spezifischen Antikörpern jedoch einen hemmenden Effekt auf das Tumorwachstum in Mäusen feststellen. Sie beschrieben sogar eine Heilung stark erkrankter Mäuse. Tumor-Vakzinen mit CpG-DNA in Kombination mit GM-CSF steigert die T-Zellaktivierung und Typ-I-IFN-Produktion von Antigen präsentierenden Zellen (HSIN-MING et al. 1998)

Offene Fragen

Bislang liegen kaum Studien über die in vitro Wirkung von CpG-Motiven auf Granulozyten (neutrophile, eosinophile, basophile) vor. Weiterhin sind die genauen molekularen Mechanismen der induzierten immun-stimulierenden Effekte noch nicht bekannt. Inwieweit die Erreger-DNA-Motive nicht nur dem Immunsystem die Präsenz des Erregers anzeigen, sondern vielmehr über ihre modulatorische Wirkung generell immunsuppressiv wirken

2.3.2 Lipopolysaccharid (LPS)

LPS ist ein Endotoxin Gram negativer Bakterien, das aus drei makromolekularen Anteilen aufgebaut ist. Der extrazelluläre Anteil ist das so genannte O-Antigen gegen das häufig Antikörper gebildet werden. Er besteht aus drei bis zwanzig Hexosemolekülen, die für die Speziesspezifität des LPS verantwortlich sind. Das O-Antigen bedingt die Hydrophilie der Oberfläche. Der zweite Anteil ist das Kernpolysaccharid, das wiederum aus zwei Untereinheiten zusammengesetzt ist und bei vielen Gram negativen Bakterien identisch ist.

Von den beiden Anteilen (Innerer und Äußerer) ist der Äußere, ein spezifischer Zucker (Keto- desoxy-oktonat), für die Funktion der Zellmembran unentbehrlich. Der für die Virulenz entscheidende Anteil des LPS ist das Lipid A. Es dient als Verankerung in der Zellwand.

Lipid A ist amphiphil, was durch die hydrophile ß-1-6-glykosidische Verknüpfung von N- acetyl-Glucosamin-Molekülen und die hydrophobe Vier-hydroxy-Fettsäurekette begründet ist (HAHN et al. 1994).

LPS wird über CD14, LBP und MD-2 an den TLR-4 auf Zellen gebunden und stimuliert über eine intrazelluläre Reaktionskaskade, die der des IL-1-Rezeptors gleicht, deren Aktivierung (s. S. 16). Die Stimulation durch LPS resultiert unter anderem in B-Zellproliferation, vermehrter Produktion von Akut-Phase Proteinen (WONG et al. 2000) sowie der Sekretion verschiedener Zytokine (IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-12) in Makrophagen und Monozyten (CLEVELAND et al. 1996, HOSHINO et al. 1999).

2.3.3 Lipoteichonsäure (LTA)

LTA ist die acetylierte, auf der Zelloberfläche Gram positiver Bakterien exprimierte Form der Teichonsäure (PESCHEL 2002). Die Lipoteichonsäure ist ebenso wie das LPS kein spezifisches Molekül, sondern eine Gruppe sehr nah verwandter Moleküle. LTA besitzt eine Glycerol- oder Ribitolphosphateinheit als Rückgrat und besteht zudem aus Zucker-Phosphat- Polymeren mit einer einzelnen Lipidseitenkette (CLEVELAND et al. 1996).

LTA wirkt auf Säugerzellen über den TLR-2. Für die Bindung sind zudem CD14 und LBP von Bedeutung (s. S. 17). Nach einer intrazellulären Reaktionskaskade mit Aktivierung des Faktors NF-κB resultiert die Aktivierung von Makrophagen und Monozyten in der Ausschüttung verschiedner Zytokine. Dazu gehören IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-10 und IL-12 (CLEVELAND et al. 1996). Zudem ist LTA in der Lage B-Zelllinien zur Proliferation anzuregen. Von CLEVELAND et al. (1996) wurde eine Th-1-Entwicklung (Sekretion von IFN-γ) von Th-0-zellen durch LTA-Stimulation ausgelöst. LTA hemmt zudem kompetetiv die

Bindung des IL-2 an den IL-2 Rezeptor auf T-Zellen und vermindert dadurch eine Proliferationssteigerung (PLITNICK et al. 2001).

2.4 Bakterielle Superantigene

Neben einigen viralen Superantigenen und dem von Mycoplasma arthritidis produzierte Superantigen MAS (Mycoplasma arthritidis Superantigen) (Übersicht bei SCHERER et al.

1993) bilden bakterielle Proteine die größte Gruppe von Erreger-kodierten Superantigenen.

Diese Proteine (Exotoxine) werden im Wesentlichen von Staphylokokken (S. aureus, S.

intermedius) und von Streptococcus pyogenes gebildet. Die Familie der von Ihnen produzierten Superantigene ist groß und umfasst bisher 21 identifizierte Mitglieder (Staphylokokken Enterotoxine, SE(x); Streptococcus Pyogenes Exotoxine, SP(x)) (BOHACH et al. 1990, MONDAY und BOHACH 1999b, PROFT et al. 1999, ARCUS et al. 2000, ORWIN et al. 2001, ALOUF und MULLER-ALOUF 2003).

Bindung an MHC-Klasse-II-Moleküle und den T-Zellrezeptor

Generelle Eigenschaft aller Superantigene ist ihre Fähigkeit ohne vorherige intrazelluläre Prozessierung mit Antigen präsentierenden Zellen und T-Lymphozyten zu interagieren (FLEISCHER und SCHREZENMEIER 1988) und diese Zellen zu stimulieren.

Superantigene binden an MHC-Klasse-II-Moleküle außerhalb der Antigenbindungsgrube auf Antigen präsentierenden Zellen und sind sodann in der Lage an polymorphe Sequenzen der β-Kette (Vβ-Region) des αßT-Zellrezeptors zu binden (GASCOIGNE 1993). Die einzelnen Superantigene können zwar an ein breites Spektrum verschiedener alleler MHC-Klasse-II- Moleküle binden, unterscheiden sich aber in ihrer Affinität zu einzelnen Allelen. Überdies bestehen Unterschiede in der Erkennung verschiedener Vß-Familien (CHINTAGUMPALA et al. 1991, LABREQUE et al. 1993). Durch die einzigartige Form der Interaktion mit der ß- Kette des T-Zellrezeptors und MHC-Klasse-II-Molekülen sind Superantigene in der Lage einen deutlich höheren Prozentsatz vorhandener T-Zellen zu aktivieren als es durch die Präsentation eines auf herkömmliche Weise prozessierten Antigens erfolgt. So werden nach herkömmlicher Antigenpräsentation etwa 0,001 bis 0,1% der T-Zellen aktiviert, hingegen liegt der Prozentsatz nach Superantigenstimulation (in Abhängigkeit von der Frequenz des

„passenden“ Rezeptorsegmentes) bei bis zu 25% aller T-Zellen (FLEISCHER et al. 1991, HERMAN et al. 1991, MOLLICK et al. 1991, IRWIN und GASCOIGNE 1993, SCHUBERTH 1997).

Konsequenzen der Superantigenbindung in vitro

Die Konsequenzen einer Superantigenstimulation sind vielfältig. Sie können zur Aktivierung und Proliferation sowie zur Induktion von Apoptose und/oder Anergie der Zellen führen (HERMAN et al. 1991, HUANG und CRISPE 1993, AOUDJIT et al. 1995). Als Folge der Aktivierung kommt es beispielsweise zur Produktion und Sekretion verschiedener Zytokine sowie zur Superantigen abhängigen zellulären Zytotoxizität (SDCC) durch aktivierte CD4⁺ und CD8⁺ T-Zellen. Eine polyklonale Aktivierung vieler Vβ-reaktiver T-Zellen durch Superantigene führt unter Umständen zur Expansion autoreaktiver T-Zellklone (zitiert nach KRÜGER 2001). HENDRICKS (1998) beschrieb eine über T-Zellen vermittelte Proliferation boviner B-Lymphozyten, die dosisabhängig auch zur Apoptose der B-Zellen führen kann.

Die Zytokin induzierende Potenz verschiedener Superantigene beim Menschen ist wegen der unterschiedlichen Methoden nur schwer zu vergleichen. YOKOMIZO et al. (1995) und SCHUBERTH (1997) beschrieben die Superantigen stimulierte Produktion von IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-γ und TNF-α in bovinen MNC des Blutes. Die Produktion von Stickstoffmonooxid und Cyclooxygenase abhängigen Arachidonsäure-Metaboliten wie PGE2

in mononukleären Zellen wurde von HENDRICKS (1998) demonstriert.

KRÜGER (2001) beschrieb die indirekte Wirkung der Staphylokokken-Superantigene SEA und SEB auf die Vitalität von bovinen Granulozyten. Die Überlebensrate reiner neutrophiler sowie eosinophiler Granulozyten wurde von den Superantigenen nach 24-stündiger Inkuba- tion nicht beeinflusst. In zellulären, Superantigen stimulierten Kokulturen aus Granulozyten und mindestens 10% bovinen mononukleären Zellen (MNC) sank die Vitalität der neutrophilen Granulozyten im Vergleich zu den Reinkulturen bis auf 10–50%, wohingegen kein Einfluss auf eosinophile Granulozyten bestand. Der vitalitätsmindernde Effekt wurde auch ohne Zell-Zell-Kontakt durch Überstände inkubierter MNC vermittelt. Der genaue Mechanismus ist derzeitig nicht geklärt, doch sind weder TNF-α, das FAS-Molekül, Stickoxyd, PGE2 noch die durch Brefeldin A zu hemmenden Zytokine für diesen Effekt verantwortlich. Durch die simultane Inkubation mit Caspase-1- und Caspase-2-Inhibitoren wurde der Vitalitätsverlust in Kokulturen, nicht aber in den mit Überständen inkubierten Granulozyten gehemmt.

2.5 Neutrophile Granulozyten

2.5.1 Morphologische Eigenschaften neutrophiler Granulozyten

Die lichtmikroskopisch neutralen (azurophilen, primären) Granula zählen gemeinsam mit dem vielgestaltigen, polymorphen Kern zu den charakteristischen morphologischen Merkmalen ausgereifter neutrophiler Granulozyten. Andere Bezeichnungen lauten „Neutrophile“ oder

„polymorphkernige Granulozyten“ (PMN, polymorphonuclear cells) (JANEWAY und TRAVERS 1997). Die aus Knochenmarkzellen durch die koordinative Einwirkung hämatopoetischer Faktoren über Myeloblasten, Promyelozyten, Myelozyten und Metamyelozyten entstehenden jugendlichen Formen besitzen zunächst noch einen stabförmigen Kern. Die über Chromatinfäden verbundenen Segmente entstehen erst mit der weiteren Reifung (LIEBICH 1993).

Ihre primären Granula sind reich an mikrobiziden Enzymen wie Hydrolasen, Lysozym, Myeloperoxidasen, Proteinasen, sauren Hydrolasen, Histaminase und kationischen Proteinen.

Sekundäre Granula enthalten zudem noch Lactoferrin und Kollagenasen (GEMSA et al. 1991, KLEIN 1991).

Während einer Infektion steigt die tägliche Produktion der Granulozyten im Knochenmark etwa um das zehnfache. Die Überlebensdauer für Granulozyten liegt beim Menschen (ZINK 1990) und bei der Ratte (ROITT et al. 1991) bei zwei bis drei Tagen, kann aber durch lokal produzierte, anti-apoptotische Zytokine verlängert werden (BLISS et al. 1999). Die Transmigration in Entzündungsgebiete verzögert ebenso die spontane Apoptose von Neutrophilen (WATSON et al. 1997).

2.5.2 Besonderheiten boviner neutrophiler Granulozyten

Bovine neutrophile Granulozyten sind sowohl funktionell als auch morphologisch denen anderer Spezies zwar ähnlich, aber nicht identisch. Sie bilden neben den Lymphozyten die zweithäufigste Fraktion (25-45%) des Differentialblutbildes. Zusätzlich besitzen bovine neutrophile Granulozyten eine dritte Art zytoplasmatischer Granula, die größer sind und kationische antibakterielle Proteine, z.B. Baktenecin (ROMEO et al. 1988), Indolicin und β- Defensin (SELSTED et al. 1992, 1993) enthalten. Diese Proteine wirken selektiv auf bestimmte Bakterien bakterizid. Obwohl in den bovinen azurophilen Granula viele der Enzyme enthalten sind, die auch bei anderer Spezies gefunden werden, fehlt ihnen das

1998). Im Gegensatz zu Neutrophilen anderer Spezies, besitzen bovine Neutrophile offensichtlich Fc-rezeptoren für IgM (PASTORET et al. 1998).

2.5.3 Aufgaben der Granulozyten im Rahmen der Infektionsabwehr

Entzündungsmediatoren (u.a. Interleukin-8, Leukotrien B4, C5a) wirken chemotaktisch auf neutrophile Granulozyten. Sie induzieren Adhäsionsmoleküle auf Endothelzellen. Innerhalb weniger Minuten bis Stunden werden das adhäsive P-Selektin und das E-Selektin, die Kohlenhydratepitope verschiedener Glykoproteine auf Leukozyten erkennen, exprimiert. Das auf Leukozyten exprimierte L-Selektin unterstützt das „Rollen“ der Zellen entlang der Gefäßwand. Diese Wechselwirkungen führen zu einer lokalen Verlangsamung der PMN im Blutstrom (Margination) sowie einer reversiblen Anheftung der Neutrophilen an die Gefäßwand. IL-8 bewirkt eine Konformationsänderung der physiologischer Weise schwach bindenden Leukozyten-Integrine LFA-1 (Leukozyten-Funktions-assoziiertes-Antigen-1, CD11a/ CD18) und CR3 (Komplementrezeptor-3, CD11b/CD18, auch MAC-1 genannt). Ihre Affinität zu ihren Liganden, den intrazellulären Zelladhäsionsmolekülen (intercellular cell adhesion molecule, ICAM-1) der Endothelzellen, wird dadurch deutlich erhöht, was eine Immobilisation der Zellen zur Folge hat. Als Verstärkung dient das Immunglobulin ähnliche Molekül CD31 (auch PECAM: platelet endothelial cell adhesion molecule), das sowohl auf Leukozyten als auch an den Verbindungsstellen zwischen den Endothelzellen exprimiert wird (JANEWAY und TRAVERS 1997). An den Kontaktstellen dreier Endothelzellen („tricellular corners“) transmigriert der Hauptteil der Neutrophilen. Nachdem sie die Basalmembran mithilfe proteolytischer Enzyme passiert haben, gelangen die Zellen entlang eines Konzentrationsgradienten der Entzündungsmediatoren an deren Entstehungsort.

Granulozyten sind Phagozyten, die der Beseitigung von Erregern und von Zelldetritus dienen.

Die in Phagosomen aufgenommenen Bestandteile werden nach der Verschmelzung mit Lysosomen in den Phagolysosomen mit Hilfe reaktiver Sauerstoff-metabolite und bakterizider lysosomaler Enzyme/Polypeptide inaktiviert und getötet (DJEU und BLANCHARD 1987, JACKSON et al. 1995, CASSATELLA 1996, BELAAOUAJ et al. 1998). Einen Schutz vor der Selbstschädigung bieten protektive Enzyme, wie z.B. Superoxiddismutase und Katalase (JANEWAY und TRAVERS 1997). Nicht unerhebliche Mengen der Metaboliten/Enzyme gelangen in den Extrazellularraum und verursachen dort Zellschäden.

Neutrophile Granulozyten haben neben der Funktion der Phagozytose zusätzlich die Fähigkeit nach Stimulation (durch z.B. LPS, IL-1, IL-2, TNFα oder GM-CSF) Zytokine freizusetzen (LLOYD und OPPENHEIM 1992). CASSATELLA (1999) kommt zu dem Schluss, dass