Durchflusszytometrie

Hier werden Einzelzellen in einem Probenführungssystem an einem Laserstrahl vorbei geleitet. Gestreutes Licht einer Wellenlänge (hier 488 nm) wird in Richtung des Strahls als so genanntes Vorwärtsstreulicht (Forward Scatter, FSC) oder im 90° Winkel dazu, als Seitwärtsstreulicht (Side Scatter, SSC) erfasst. Durch die Vorwärtsstreuung werden die Größe des Partikels und dessen Refraktionsindex, durch die Seitwärtsstreuung die Komplexität (Oberflächenbeschaffenheit und Granularität) charakterisiert. Die Signale werden aufgefangen und an den angeschlossenen Computer weitergeleitet. Mit Hilfe dieses Computers werden die Geräteeinstellungen kontrolliert, Messereignisse erfasst und gespeichert (ORMEROD 1990, RADBRUCH 1992).

Bei dem für diese Versuche verwendeten Durchflusszytometer handelt es sich um ein FACScan^® (s. S. 38, 3.1) mit einem Argonlaser, der Licht einer Wellenlänge von 488 nm erzeugt. Das Gerät erfasst mit entsprechenden Detektoren (FL-1, FL-2, FL-3) Fluoreszenz-lichtemissionen in drei verschiedenen Wellenlängenbereichen (Grünfluoreszenz: 515-545 nm;

Orangefluoreszenz: 564-606 nm; Rotfluoreszenz: >650 nm). Jede Zelle oder jeder Partikel wird folglich durch fünf verschiedene Parameter (FSC, SSC, FL-1, FL-2, FL-3) charakterisiert und als ein Messereignis festgehalten.

Mit Hilfe der Software „WinMDI Version 2.8“ (TROTTER 1999) erfolgte die computer-gestützte Auswertung der Daten. Ergebnisse wurden einparametrisch als Histogramm oder mehrparametrisch als korrelierte Punkte-, Dichte- oder Konturdiagramme dargestellt. Da die Werte einzelner Parameter stark von den Einstellungen für die FSC, SSC und

Fluoreszenz-detektoren abhängt wurden nur solche Messungen miteinander verglichen, die mit identischen Geräteeinstellungen erfasst wurden.

Zur Definition einzelner Untergruppen der Messereignisse („Events“) wurden nach der Messung software-gestützt elektronische „Fenster“ (so genannte „Gates“) gesetzt und zum Teil mehrere Fenster logisch miteinander verknüpft. So wurden bspw. in Mischungen aus PMN und MNC die PMN anhand ihrer charakteristischen Morphologie im FSC/SSC-Punktediagramm identifiziert (R1: Region 1) und im FL-3/SSC-FSC/SSC-Punktediagramm die vitalen Zellen (R2: Region 2). Eine Verknüpfung von R1 und R2 bot somit ein „Fenster“ auf vitale PMN.

In einer Zwei-Parameter-Darstellung FSC/SSC lassen sich morphologisch ähnliche Zellpopulationen, wie zum Beispiel eosinophile und neutrophile Granulozyten nicht voneinander unterscheiden (s. Abb. 3). Um dies zu ermöglichen wurden die Zellen im FL-1/SSC Punktediagramm angezeigt in dem sich die eosinophilen Granulozyten durch eine höhere Autofluoreszenz darstellen (s. Abb. 3).

Seitwärtsstreulicht (SSC)

Vorwärtsstreulicht (FSC) Grünfluoreszenz (FL-1) R1

R3 R2

R5 R4

Seitwärtsstreulicht (SSC)

Abb. 3 Differenzierung leukozytärer Zellpopulationen des bovinen Blutes durch morphologische und Autofluoreszenz Charakteristika nach durchflusszyto-metrischer Analyse

Dargestellt sind Punktediagramme nach Erfassung von 10.000 Ereignissen im Durchflusszytometer.

Linkes Diagramm: Darstellung der Morphologie (Größe gegen Komplexität), R1: Granulozyten mit größerer Komplexität (SSC) sind von mononukleären Zellen (R2, lymphoide Zellen) und monozytoiden Zellen (R3) zu unterscheiden. Rechtes Diagramm: Unterscheidung neutrophiler Granulozyten (R5) von eosinophilen Granulozyten (R4) aufgrund der Autofluoreszenz, gemessen im Kanal FL-1 (Grünfluoreszenz).

Quantifizierung der Zahl vitaler Zellen mit Hilfe des Durchflusszytometers (Referenzzellmethode)

Während der Inkubation starb ein Teil der eingesäten Zellen durch die Kulturbedingungen oder die Stimulatoren ab. Durch eine Färbung der toten Zellen mit Propidiumiodid (Fluoreszenz in der FL-3) war es möglich, diese von den lebendigen Zellen zu unterscheiden.

Eine bestimmte Anzahl Partikel, die sich von den zu untersuchenden Zellen unterscheiden, aber dennoch mit den gleichen Geräteeinstellungen zu messen sind, werden den Proben zugegeben. Anhand dieser kann eine Evaluation der lebendigen Zellen vorgenommen werden.

In diesem Fall wurden bovine Zellen (Referenzzellen) zugesetzt. Werden die gemessenen Referenzzellen und die vitalen Zellen ins Verhältnis gesetzt, kann die absolute Zellzahl ermittelt werden.

Um die verwendeten bovinen mononukleären Referenzzellen von den in Kultur befindlichen Zellen eindeutig unterscheiden zu können, erfolgte eine Markierung mit einem monoklonalen Antikörper gegen bovine MHC-Klasse-I-Moleküle (mAK Bo1, s. S. 43, Tab. 5) und anschließend mit einem fluorochromgekoppelten Ziege-anti-Maus-Antikörper (s. S. 43). Eine längere Lagerung konnte durch eine Fixation mittels Paraformaldehyd ermöglicht werden.

Die toten und fixierten Zellen fluoreszieren nach Zugabe von Propidiumiodid (s. S. 51) in der FL-1 und in der FL-3.

Herstellung von Referenzzellen

Referenzzellen wurden immer in größeren Mengen hergestellt und nach Fixation bei 4°C unter Lichtabschluss gelagert.

Zur Färbung wurden jeweils 2 x 10⁷ frisch separierte bovine mononukleäre Zellen des Blutes in ein 15 ml Röhrchen gegeben und bei 80 xg für 5 min und 4°C abzentrifugiert. Nach dem Abgießen des Überstandes wurde das Zellpellet in 100 µl PBS resuspendiert und mit demselben Volumen des unverdünnten monoklonalen AKs Bo1 (s. S.) für 15 min bei 4°C inkubiert. Anschließend erfolgte ein Waschschritt mit 5 ml MIF-Puffer (s. S. 44, 3.2.5) - Zentrifugation über 7 min bei 80 xg und 4°C, Abgießen des Überstandes. Das resuspendierte Zellpellet wurde nun mit 100 µl des 1:40 verdünnten FITC-konjugierten Ziege-Anti-Maus Antikörpers (s. S. 43) versetzt und über 20 min unter Lichtabschluss bei 4°C inkubiert.

Es schloss sich ein weiterer Waschschritt mit Resuspension der Zellen in 5 ml PBS an. Nach der Überführung der Zellsuspension in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen wurde das Zentrifugen-röhrchen mit PBS auf 50 ml aufgefüllt und die Zellen erneut abzentrifugiert. Die

Resuspension des Zellpellets erfolgte in 30 ml einer 4%-igen Paraformaldehyd-Lösung. Die Zellen inkubierten 24 h bei 4°C unter Lichtabschluss. Anschließend wurden die Zellen 15 min bei Raumtemperatur abzentrifugiert, dekantiert und ein zweites Mal in PBS gewaschen.

Dieses nun gewonnene Zellpellet wurde in der PI-haltigen Trägerflüssigkeit aufgenommen und auf 4 x 10⁵ Zellen/ml eingestellt. (Die Konzentration wurde vor Einsatz kontrolliert und gegebenenfalls korrigiert).

Vorbereitung der Proben für die Messung

Zum Ende der Inkubationszeit wurden die Mikrotiterplatten für ca. 15 min auf Eis gelagert, um adhärente Zellen zu lösen. Kurzes Rütteln half bei diesem Vorgang. Eine Durchmischung und nahezu vollständige Ablösung der Zellen wurde durch vielmaliges Auf- und Abpipettieren erreicht. Die Ansätze wurden in 5 ml Röhrchen für die Durchflusszytometrie (s. S. 39, 3.2.2) überführt. Es schloss sich eine Kontrolle der Platten auf residuale Zellen an.

Vor der Messung erfolgte eine Zugabe von 150 µl einer PI-haltigen Trägerflüssigkeit (Endkonzentration des PI 2 µg/ml, s. S. 51).

Ermittlung der Zahl vitaler Zellen

Je nach Anzahl der Populationen wurden 10.000–30.000 Zellen erfasst. Die Morphologie der Referenzzellen blieb durch die Fixation mit Paraformaldehyd weitgehend erhalten, was dazu führte, dass die Zellen im Vorwärts- und Seitwärtsstreulicht nicht eindeutig von den frisch separierten oder kultivierten mononukleären Zellen, wohl aber von polymorphkernigen Zellen zu differenzieren waren. Durch ihre Fluoreszenz in der FL-1 (Grünfluoreszenz) gab es aber ein eindeutiges Unterscheidungskriterium (s. Abb. 4). Die Auswertung der Messung eines Gemisches aus Kultur- und Referenzzellen erfolgte durch die Darstellung verschiedener Parameter einer Messung gegeneinander (s. Abb. 4). Einzelpopulationen konnten durch Setzen von Fenstern markiert und gezielt in weiteren Diagrammen angezeigt werden. Die einzelnen Messereignisse (Events, E) werden mittels einer Quadrantenanalyse registriert. Die Quadrantenanalyse gibt die Zahl der Messereignisse, den mittleren Wert auf der x- und y-Achse sowie prozentuale Anteile an sowohl den gezeigten, als auch den Gesamtereignissen an. Da immer eine definierte Menge Referenzzellen (ZREF) den einzelnen Messungen zugesetzt wird, war es möglich aus den gemessenen Ereignissen der vitalen Kulturzellen (EVIT) und den gemessenen Messereignissen der Referenzzellen (EREF) die Zahl vitaler Kulturzellen (ZVIT) in dem Ansatz mit folgender Formel zu berechnen:

Z = ^VIT

E ^REF E x Z VIT REF

Die Angabe des Parameters „Zahl vitaler Zellen (ZVIT)“ erfolgte als Mittelwert der berechneten Werte dreier Ansätze.

Wegen der großen interindividuellen Schwankungen der Zahl vitaler Zellen sowohl in den Proliferationsversuchen als auch in den Versuchen zum induzierten Sterben der neutrophilen Granulozyten, wurden keine absoluten Zellzahlen angegeben, sondern als Prozent der individuellen Kontrollansätze (=100%) ausgedrückt.

C

Vorwärtsstreulicht (FSC) Rotfluoreszenz FL-3

A B

D

Seitwärtsstreulicht (SSC)Seitwärtsstreulicht (SSC) Rotfluoreszenz (FL-3)Seitwärtsstreulicht (SSC)

R1 R2

R3 R4

Grünfluoreszenz FL-1 Grünfluoreszenz FL-1

Abb. 4 Evaluation der absoluten Zellzahl mittels Referenzzellmethode in der Durchflusszytometrie

Für die Bestimmung der Vitalität boviner Granulozyten nach eintägiger Inkubation wurde die absolute Zellzahl bestimmt. Zu den einzelnen Proben wurde vor der Messung eine definierte Menge Referenzzellen zugegeben. In den Abbildungen A-D sind unterschiedliche Parameter einer Messung gegeneinander aufgetragen. In Abb. A sind alle Events dieser Messung dargestellt. Da durch Zugabe von PI die toten Zellen in der FL-3 positiv sind und daher rechts in dieser Darstellung liegen, wird durch die Region R1 der Focus auf die lebendigen Zellen gelegt. In Abb. B werden ausschließlich die in R1 liegenden, vitalen Zellen in der morphologischen Darstellung gezeigt. In der hier gesetzten

sind diese beiden Populationen in der Darstellung FL-1 gegen SSC (Abb. C), da die eosinophilen Granulozyten (R3) eine höhere Autofluoreszenz besitzen und deshalb weiter rechts als die neutrophilen Granulozyten liegen. In Abb. D sind die Referenzzellen zu sehen, die von den Granulozyten schon durch ihre Morphologie und von den vitalen MNC durch ihre stärkere Fluoreszenz in den FL-1 und FL-3 zu unterscheiden sind.