Kinetik der Entstehung apoptischer Zellen durch in vitro Kokultivierung von

TLR-Liganden

Das akzelerierte Sterben der neutrophilen Granulozyten in vitro nach Koinkubation mit MNC und TLR-Liganden (CpG-Motive, LTA oder LPS) könnte auf der Induktion einer Apoptose beruhen oder (unter den gewählten in vitro Bedingungen) auf der Induktion einer primären Nekrose. Um dies zu prüfen, wurde die Entstehung apoptotischer Zellen in vitro durch eine Membranfluoreszenz mit Annexin V-FITC (s. S. 65) über die Zeit der in vitro Kultur (bis 22 h nach Beginn des Ansatzes) verfolgt.

Nach 22 h in vitro konnten unterschiedlich stark Annexin V-FITC positive Zellpopulationen identifiziert werden (Abb. 22B, Region 2 und 5) die nicht (Region 5) oder nur schwach (Region 2) Propidiumiodid positiv waren.

In Region 1 befanden sich der Definition nach vitale (FL-3 negativ), nicht apoptotische (FL-1 negativ) Zellen. In der Region 2 liegen Zellen, die eine geringgradig gesteigerte Fluoreszenz sowohl in der FL-3 als auch in der FL-1 aufweisen. Sie können somit als apoptotische Zellen angesprochen werden. In der Region 4 befinden sich stark FL-3 und FL-1 postitive Zellen.

Die in Region 5 Annexin V-FITC positiven und Propidiumiodid negativen Zellen wiesen keine Veränderungen der Morphologie im Vergleich zu den in Region 1 befindlichen Zellen auf.

Die Masse der Zellen mit veränderter morphologischer Charakteristik (s. Abb. 22A, unterer rechter Quadrant) befand sich unter den schwach Annexin V-FITC positiven Zellen wieder (vgl. Abb. 22 C2 Abb. 22A). Annexin V-FITC schwach positve/Propidiumiodid stark positive Zellen (Abb. 22B, Region 3) wiesen hingegen eine deutlich geringere Zellgröße auf (vgl. Abb. 22 C3 und Abb. 22A).

Es zeigte sich, dass das vom Hersteller empfohlene Färbeprotokoll mit Annexin V den Anteil einzelner Zellpopulationen im Vergleich zur Ausgangspopulation verändert (s. Abb. 23). So erhöhte sich der Anteil an PI-negativen Granulozyten nach der Annexin V-FITC-Färbung z.T.

deutlich gegenüber der Messung, wenn sie direkt nach der Kultivierung im Durchflusszytometer durchgeführt wurde (s. Abb. 23; nach 4 h von 44% auf 55%). Parallel zur relativen Zunahme der vitalen Granulozyten wurden nach Annexin V-FITC-Färbung deutliche Verluste an Zellen beobachtet deren Morphologie im FSC/SSC-Punktediagramm der von apoptotischen mononukleären Zellen entsprach (s. Abb. 23; nach 12 h und 22 h, Pfeil-markiert).

Propidiumiodid 1

2 3 5 4

Annexin V-FITC

Größe (FSC)

Granularität (SSC)

A) B)

C) 1 2 3

4 5

Granularität (SSC)

Größe (FSC)

Abb. 22 Morphologische Eigenschaften und Fluoreszenzcharakteristika von Zellen (PMN/MNC Gemisch) nach Annexin V-FITC- und Propidiumiodid-Färbung Neutrophile Granulozyten und mononukleäre Zellen wurden im Verhältnis 1:1 22 h in vitro inkubiert.

Darstellung einer Einzelmessung. A) Vorwärts-/Seitwärtsstreulicht-Punktediagramm nach Ausschluss von Zelldebris. B) Korrelierte Darstellung der Fluoreszenzen FL-3 (Propidiumiodid)/ FL-1 (Annexin V-FITC). In B) wurden anhand unterschiedlicher Fluoreszenzen 5 Regionen definiert. C) Morphologische Darstellung der Zellen in den Regionen 1-5 (aus B).

30 min

4h

12h

22h 31%

44%

27%

55% 60%

55%

35%

34%

Vorwärtsstreulicht (FSC)

Zeit nach Beginn

der In-vitro-Kokultivierung

Seitwärtsstreulicht (SSC)

Abb. 23 Änderung der Zellzusammensetzung nach Färbung in vitro stimulierter PMN/MNC Kokulturen mit Annexin V-FITC

Mononukleäre Zellen und neutrophile Granulozyten eines Tieres wurden im Verhältnis 1:1 bis zu 22 h in vitro kultiviert (s. S. 65). Alle Ansätze enthielten Lipoteichonsäure und CpG 2007. Nach den angegebenen Kulturzeiten in vitro wurden die Zellgemische direkt durchflusszytometrisch analysiert (linke Spalte). Parallelansätze wurden nach Färbung mit Annexin V-FITC durchflusszytometrisch analysiert (rechte Spalte). Dargestellt sind Dichteplots nach dem Ausschluss stark PI-positiver Ereignisse sowie zellulärem Debris. Die Prozentsätze stellen den Anteil der Granulozyten an allen dargestellten Messereignissen dar (oberer linker Quadrant). Die Pfeile deuten auf eine eingekreiste Population an Zellen, die nach Annexin V-Färbung deutlich reduziert auftritt.

Das zeitabhängige Auftreten von Annexin V-FITC positiven Zellen nach Stimulation von MNC/PMN-Gemischen mit TLR-Liganden ist exemplarisch in Abb. 24 dargestellt.

Nach vierstündiger Inkubation in vitro ließen sich in allen Ansätzen, auch in der Mediumkontrolle ohne Zusatz, Annexin V positive Zellen darstellen (Kasten in B, F und J), die sich unter den mononukleären Zellen finden. Nach 12 h war eine Veränderung in der Morphologie der Granulozyten zu erkennen, die nur in den Ansätzen mit CpG 2007 und dem Kombinationsansatz CPG 2007+LTA auftrat: Teile der Zellen sanken deutlich in ihrem Seitwärtsstreulichtsignal (s. Abb. 24, Kasten in C, G und K). Diese Zellen, wie auch die Granulozyten mit intakt erscheinender Morphologie wiesen jedoch keine erhöhte Annexin V-FITC-Bindung auf. Erst nach 22 h ließen sich deutlich Annexin V-FITC positive Zellen nachweisen (s. Abb. 24, Kasten in D, H und L). Deren Anteil war jedoch, gemessen an der Masse der erfassten Zellen relativ klein.

Granulozyten, deren Granularität stimulationsabhängig sank (s. Abb. 24, Kasten in C, G und K) stellten sich im FL-3/SSC Punktediagramm als gemischte Population aus schwach und stark Propidiumiodid gefärbten Zellen dar (s. Abb. 25, Region 2). Damit ist zu diesem Zeitpunkt der Kultur bereits ein Nebeneinander von Apoptose (PI schwach positiv) und Nekrose (PI stark positv) festzustellen.

30 min

4 h

12 h

22 h

Zeit nach Beginn der In-vitro-Kokultivierung Ohne Stimulus CpG 2007 LTA+CpG 2007

Zusatz zum Kulturmedium

A E I

J

K

L F

G

H B

C

D

Annexin V-FITC (FL-1)

Seitwärtsstreulicht (SSC)

Abb. 24 Auftreten Annexin V-FITC positiver Zellen nach Stimulation von MNC/PMN Kokulturen mit CpG 2007 oder der Kombination CpG 2007+LTA

Mononukleäre Zellen und neutrophile Granulozyten eines Rindes wurden im Verhältnis 1:1 bis zu 22 h in vitro kultiviert (s. S. 65). Die Ansätze erfolgten in Triplikaten ohne Zusatz (A bis D), mit CpG 2007 (E-H) oder ein Gemisch aus Lipoteichonsäure und dem CpG 2007 (I-L). Nach den angegebenen Kulturzeiten in vitro wurden die Zellgemische mit Annexin V-FITC gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert (rechte Spalte). Dargestellt sind Punktediagramme (FL-1/SSC) nach dem Ausschluss stark PI-positiver Ereignisse sowie zellulärem Debris. Die X-Achse der Zweipara-meterdarstellungen entspricht der relativen Annexin V-FITC-Bindungsstärke.

Propidiumiodid (FL-3) Annexin V-FITC (FL-1)

Seitwärtsstreulicht (SSC) Messereignisse

MediumCpG 2007LTA + CpG 2007

R1 89%

R2 11%

A)

B)

C)

D)

E)

G)

H)

F) I)

Abb. 25 Aufschlüsselung der morphologisch veränderten und Annexin V-FITC teilpositiven PMN in der Rotfluoreszenz

Percoll^®-separierte PMN wurden in einem Verhältnis von 1:1 mit autologen MNC über 12 h in vitro inkubiert. Neben unstimulierten Ansätzen (Medium) wurden Parallelansätze mit CpG 2007 oder einem Gemisch aus LTA+CpG 2007 stimuliert. Nach Annexin V-FITC Färbung wurden die Zellen in Anwesenheit von Propidiumiodid durchflusszytometrisch anaylsiert. In den Punktediagrammen (Annexin V-FITC-Fluoreszenz gegen die Granularität) wurden 2 Regionen auf Zellen mit unterschiedlicher Seitwärtsstreuung gesetzt. Die Rotfluoreszenz (FL-3) der Zellpopulationen in den eingezeichneten Regionen wird in den nebenliegenden Histogrammen dargestellt (linkes Histogramm:

Rotfluoreszenz der Zellen in Region 1; rechtes Histogramm: Rotfluoreszenz der Zellen in Region 2).

Im Dokument CpG Motive und ausgewählte Toll-like-Rezeptor-Liganden (Seite 113-119)