Die Interaktion zwischen DNA-Motiven, LPS und LTA mit neutrophilen

Nachdem gezeigt wurde, dass CpG-Motive an neutrophile Granulozyten binden wurde untersucht ob diese Interaktion eine funktionelle Konsequenz besitzt. Ein schnell, leicht und zuverlässig zu erfassender Parameter stellte die durchflusszytometrische Erfassung der Zellvitalität dar. Die Veränderungen der Zellgröße (Vorwärtsstreulicht) und der Granularität (Seitwärtsstreulicht) waren trotz der teilweise statistisch relevanten Unterschiede nicht stark ausgeprägt.

Diese Interaktion wurde nur von einer leichten Vitalitätsminderung neutrophiler Granulozyten in Reinkultur begleitet. Einzig für zwei der geprüften CpG-Motive (CpG 1760 und 2006) war dieser Effekt signifikant (s. S. 98, 4.4.1). Dieser Effekt war relativ schwach und könnte ebenfalls einen indirekten Effekt darstellen, da die PMN-Präparationen zwischen 2% und 10% MNC enthielten. In jedem Fall scheinen nur neutrophile Granulozyten derart beeinflussbar gewesen zu sein, da dieser Effekt nicht bei eosinophilen Granulozyten nachgewiesen werden konnte (s. S. 105, 4.4.5).

Allerdings waren diese Effekte stärker ausgeprägt wenn PMN in Reinkultur gemeinsam mit SEA und CpG-Motiven inkubiert wurden (s. Tab. 16). Nach KRÜGER (2001) war dieser Effekt durch Superantigeneinsatz allein nicht zu sehen. HAYASHI et al. (2003) haben an humanen Neutrophilen keine direkte Aktivierung durch CpG-Motive feststellen können. Ein

(Pam3CSK4 TLR-2/-1 und Zymosan TLR-2/-6). In den hier beschriebenen Studien waren die Vitalitätsverluste durch LPS zwar bei einigen Individuen sehr hoch, doch wurden keine statistisch relevanten Unterschiede erreicht (s. Abb. 17). Durch Vorinkubation der Neutrophilen mit GM-CSF konnten sie eine Aktivierbarkeit durch CpG-Motive nachweisen.

BYLUND et al. (2002) konnten eine Stimulation humaner PMN mit PT-Motiven, wohingegen die gleichen Sequenzen mit einem PD-Rückgrat keinen Einfluss hatten. Eine direkte Aktivierung von PMN ist somit nicht auszuschließen, auch wenn sie durch den Parameter „Zahl vitaler Zellen“ statistisch nicht konsequent nachzuweisen ist.

Der Zelltod in vitro; Kritik des methodischen Ansatzes

Viele Arbeitsgruppen verwenden apoptotische Merkmale als Nachweis für eine Vitalitätsverminderung. LUNDQVIST-GUSTAFSSON & BENGTSSON (1999) bedienten sich der durchflusszytometrischen Bestimmung der verminderten Zellgröße als Maß für die Apoptose. Ein weiteres Beispiel ist die Bindung von Annexin V-FITC, das an Phosphatidylserin bindet (FADOK et al. 1992). ALAM et al. (1999) hingegen verwendeten Fluorochrom markierte Caspase-Substrate, um die Caspase-Aktivität während der Apoptoseinduktion durchflusszytometrisch zu quantifizieren.

Apoptotische Zellen gehen in vitro jedoch schnell durch eine sekundäre Nekrose zugrunde (WALSH et al. 1998). Der Zeitraum in dem der Nachweis einer primären Apoptose-Induktion möglich ist, ist demnach nur kurz und bei der Verwendung verschiedener Stimuli nicht unbedingt Zeitgleich. Apoptotische, noch membranintakte Zellen, die sich durch sekundäre Nekrose als Propidiumiodid positiv darstellen, verlieren rasch ihre Membran- und Kernintegrität, was eine eindeutige Zuordnung ebenfalls erschwert. Durch Wahl eines falschen Messzeitpunktes besteht zudem die Gefahr der falsch positiven oder negativen Bestimmung. Unterstützt wird diese Hypothese durch eigene Beobachtungen, die sowohl einen selektiven Zellverlust der morphologisch veränderten Granulozytenpopulation (s. Abb.

23) sowie PI-positiver Zellen (s. Abb. 23) durch ein Verfahren der PS-Bindung erfassen.

Aus diesen Gründen wurde in dieser Arbeit der quantitative, durchflusszytometrische Nachweis der Modulation der Zellvitalität eingesetzt, der zuverlässig die noch vitalen Zellen erfasst, jedoch keine Aussage über die Art des Zelltodes zulässt.

PAMPs senken die Vitalität neutrophiler Granulozyten in Kokultur mit MNC

Durch die Stimulation von Kokulturen boviner PMN mit MNC oder Makrophagen mit CpG-Motiven, LTA und LPS konnte nach 22-stündiger Inkubation in vitro ein selektives,

akzeleriertes Absterben der neutrophilen Granulozyten (s. S. 100, 4.4.2) beobachtet werden.

Dieser PAMP-vermittelte Effekt in bovinen PMN/MNC Mischkulturen wurde erstmal von KRÜGER (2001) nach Einsatz von Superantigenen beschrieben. Der Superantigen vermittelte Effekt konnte in dieser Arbeit reproduziert werden (s. S. 100, 4.4.2) und erwies sich als stärker als der gleichgerichtete Effekt verschiedener weiterer PAMPs (CpG-Motive, LPS, LTA).

Interessant in diesem Zusammenhang ist jedoch die Tatsache, dass bisher alle beim Rind untersuchten PAMPs, gleich an welche Rezeptoren sie an Zelloberflächen binden, den selben Vitalitäts-mindernden Effekt für neutrophile Granulozyten aufweisen. Dies scheint somit ein generelles Phänomen der Wirkungsweise von Erregermustern darzustellen.

Überdies wurde gezeigt, dass der kostimulatorische Einsatz von PAMPs (CpG-Motive+SEA oder CpG-Motive+LPS/LTA) in additiver Art und Weise die Vitalität neutrophiler Granulozyten negativ beeinflusst (Tab. 16, Abb. 17). Dies erfolgte so stark, dass Unterschiede zwischen den CpG-Motiven (wie sie bei alleinigem Einsatz noch beobachtet werden können) nach Einsatz in Kombination mit SEA nicht mehr zutage traten. Ob die einzelnen Stimulatoren (SEA und PAMPs) über unterschiedliche Mechanismen/Mediatoren wirken, ist nicht bekannt, doch beschrieben HALLMANN et al. (2001) sowie UNDERHILL und OZINSKY (2002) die Aktivierung der gleichen intrazellulären Signalkaskade mit der finalen Translokation von NF-κB für alle TLR. SEA hingegen bindet an MHC-Klasse-II-Moleküle sowie T-Zellrezeptoren und wirkt wahrscheinlich über andere, intrazellulär induzierte Mechanismen. KRÜGER (2001) beschrieb, dass bei der Stimulation mit 1 ng/ml SEA ein Plateau des induzierbaren Vitalitätsverlustes erreicht ist und zudem selbst bei logarithmischer Konzentrationssteigerung des Stimulators kein weiterer Effekt erreicht werden konnte. Damit kann ausgeschlossen werden, dass nach Kostimulation mit CpG-Motiven und SEA einzig mehr von den relevanten, Apoptose fördernden Mediatoren aus stimulierten MNC freigesetzt wurden. Vielmehr scheint wahrscheinlich, dass CpG-Motive die Sekretion anderer, ebenfalls pro-apoptotischer Mediatoren – zusätzlich zu den SEA-induzierten – bewirken.

Neben dem Verlust vitaler Granulozyten wurde durch den kostimulatorischen Einsatz von PAMPs die Granularität der Zellen im Mittel vermindert (s. Tab. 16 und Abb. 17). Dieser Granularitätsverlust kann als Parameter einer Zellaktivierung interpretiert werden, die sich in der Verschmelzung der Granula mit der Zellmembran zur Abgabe der Inhalte in den Extrazellularraum äußert: BYLUND et al. 2002 beschrieben einen Granularitätsverlust humaner Granulozyten nach 45-minütiger Stimulation mit PT-CpG-Motiven über die Messung von Gelatinase und Vitamin B12 in den Kulturüberständen. Dies schien nach

dieser Arbeit wurden nur marginale Granularitätsveränderungen boviner neutrophiler Granulozyten gesehen. Diese Unterschiede mögen wiederum in der Verwendung unterschiedlicher Verfahren und dem Einsatz unterschiedlicher finaler Konzentrationen der verwendeten CpG-Motive begründet sein.

Lösliche Faktoren von mononukleären Zellen sind für das akzelerierte Sterben boviner neutrophiler Granulozyten verantwortlich

Ein direkter Zell-Zell-Kontakt zwischen MNC und PMN scheint nicht für den Tod neutrophiler Granulozyten essentiell zu sein, da auch Überstände PAMP-aktivierter mononukleärer Zellen das Sterben der PMN in ähnlichem Ausmaß induzieren (s. Tab. 17).

Diese konditionierten Überstände enthielten sowohl MNC-Mediatoren als auch die zur Stimulation verwendeten CpG-Motive was nicht ausschließen lässt, dass CpG-Motive und MNC-Mediatoren gleichzeitig nötig sind um zum akzelerierten Sterben der Neutrophilen zu führen.

In der Summe kann der hier nachgewiesene CpG-induzierte Vitalitätsverlust boviner neutrophiler Granulozyten ebenfalls als sehr empfindlicher und zuverlässigerer Parameter einer MNC-Aktivierung angesehen werden. Zur Induktion des akzelerierten Sterbens boviner PMN scheint eine deutliche Proliferationsreaktion der MNC nicht unabdingbar zu sein. Trotz der sehr viel geringeren proliferationsinduzierenden Potenz von CpG-Motiven im Vergleich zu SEA liegt der CpG-induzierte Vitalitätsverlust wesentlich näher an dem SEA-induzierten (s. Tab. 13, Tab. 14 und Tab. 16). Noch deutlicher wird dies durch die zeitgleich zu den unter 4.4.3 beschriebenen Versuchen durchgeführten parallelen Proliferationsansätzen der selben Tiere, in denen keine signifikanten Effekte durch CpG-Motive erzielt werden konnten (Daten nicht gezeigt).

Es bestehen keine an den Progesteron- und Östrogenspiegel gekoppelten Unterschiede in der Quantität des induzierten Zelltodes

Trotz des generellen Effektes der untersuchten PAMPs auf PMN in Kokultur mit MNC fiel die hohe interindividuelle Varianz auf. Um sich den Ursachen zu nähern, wurde unter der Hypothese, dass die Expression von PAMP-Rezeptoren (TLRs) hormonreguliert ist bei zwei Tieren die Abhängigkeit des Zyklusstandes (Hormonstatus) dei differentiellen Reaktivität der Zellen untersucht. Dies lag nahe, da verschiedene Autoren von einer Beeinträchtigung der PMN-Funktionen durch physiologische Veränderungen der Sexualsteroide berichteten (Steigerung der PMN-Zahl im Blut; stärkere Phagozytosefähigkeit in Abhängigkeit von Östrogen; verringerte Fähigkeit zur ADCC durch hohe Progesteronspiegel) (ROTH et al.

Jedoch konnte bei zwei Tieren im Verlauf zweier Zyklen nur durch LTA ein qualitativer Unterschied der induzierten Effekte auf bovine PMN in Kokulturen festgestellt werden (s. S. 106, 4.4.6). Die quantitativen Unterschiede des Vitalitätsverlustes der vier Messzeit-punkte stehen in keinem Verhältnis zu den Progesteron- und Östrogenspiegeln im Blut.

Der Zustand der PMN entscheidet über den MNC-vermittelten Vitalitätsverlust mit Bisher wurde für den Effekt nur die in MNC unterschiedlich stark induzierten pro-apoptotischen Mediatoren für die individuell unterschiedliche Apoptoserate der Neutrophilen und damit für die individuellen Unterschiede verantwortlich gemacht. Gleichwohl müssen PMN in der Lage sein mit entsprechenden Rezeptoren diese Signale zu erkennen. Somit kann die individuell unterschiedliche Ausstattung der PMN mitentscheidend für ihren Vitalitätsverlust sein.

Diese Hypothese bestätigte sich nach Analyse des Vergleichs autologer und allogener PMN/MNC Kombinationen. Fälle in denen autologe Kombinationen unterschiedlich starke Apoptoseraten der PMN aufwiesen (bei identischem Stimulus) sowie die PMN (in den allogenen Ansätzen mit MNC andere Tiere) ähnliche Apoptoseraten aufwiesen, ließen nur den Schluss zu, dass die Reaktionslage der PMN über deren Apoptose mitentscheidend ist. (s.

S. 108).

Im Gegensatz zu B- und T-Zellen bspw. exprimieren neutrophile Granulozyten konstitutiv CD137, einen Rezeptor der TNF/NGF (nerve growth factor) Rezeptor Superfamilie, dem jedoch die Todesdomaine fehlt (SIMON 2003). Durch denselben Autor wurde auch das funktionelle Vorliegen von FAS Rezeptoren und FAS Liganden beschrieben. Diese Rezeptoren und Liganden scheinen jedoch nicht für die spontane Apoptose neutrophiler Zellen in vitro verantwortlich zu sein. Über die Regulation der Rezeptorexpression bestehen bislang noch keine Kenntnisse, doch kann davon ausgegangen werden, dass nicht nur die anti- und pro-apoptotischen Mediatoren, sondern auch die Rezeptoren einer Regulation unterliegen. Schlussfolgernd ist festzustellen, dass obwohl die Apoptose neutrophiler Granulozyten durch in vitro Aktivierung von Mitgliedern der TNF/NGF Rezeptorfamilie gesteigert werden kann, die spontane Apoptose der Neutrophilen letztendlich nicht kalkulierbar ist (SIMON 2003).

Vergleichbare autolog/allogenen Kombinationen unter Verwendung von Makrophagen anstelle der MNC lassen bislang im Wesentlichen den Schluss zu, dass die Makrophagen (mehr als die PMN) und deren Stimulierbarkeit durch die verwendeten PAMPs

bleiben allerdings weiterführenden Untersuchungen vorbehalten, da die Anzahl der Versuche zu diesem Themenkomplex nur initiale Anhaltspunkte liefert.

PAMP-stimulierte MNC und Makrophagen sowie stimulierte Zellen aus allogenen MLC-Ansätzen sezernieren offenbar Faktoren, die zum Vitalitätsverlust boviner Neutrophiler führen, sei es allein oder im Konzert mit zusätzlich anwesenden PAMPs.

Geht man davon aus, dass es sich um die Induktion der Apoptose handelt, führt die Suche nach verantwortlichen Faktoren im wesentlichen zu einer Vielzahl Apoptose hemmender Zytokine und anderer Mediatoren. Nur wenige Berichte beschreiben rein Apoptose fördernde Faktoren für Neutrophile (s. Tab. 3). Das Stickoxid-Radikal (NO, FORTENBERRY et al.

1998), der Tumor Nekrose Faktor-α (TNF-α), das Prostaglandin E2 (PGE2) und Fas-FasL-Interaktionen (LILES et al. 1996) sind die wenigen bislang beschriebenen Mediatoren, wobei für TNF-α und PGE2 sowohl pro- als auch anti-apoptotische Effekte beschrieben wurden (s. Tab. 3). KRÜGER (2001) versuchte das Superantigen vermittelte beschleunigte Sterben der Neutrophilen näher zu analysieren und konnte eine Bedeutung von TNF-α, von FasL und PGE2 nicht nachvollziehen. Einzig für das Stickoxid (NO) konnte indirekt eine Beteiligung an der Apoptoseinduktion nachgewiesen werden. FUCS et al. (1992) beschrieben die vermehrte Produktion von IL-2, IL-4 und IL-3/GM-CSF in allogenen und syngenen MLCs.

Über IL-4 und GM-CSF ist jedoch bekannt, dass sie eine anti-apoptotische Wirkung auf Neutrophile besitzen, und somit nicht als Induktoren für den Vitalitätsverlust in Betracht zu ziehen sind (s. Tab. 3).

Ist Apoptose oder Nekrose für das akzelerierte PMN-Sterben verantwortlich?

Für den spontanen und den induzierten Zelltod polymorphkerniger Granulozyten wird von vielen Arbeitsgruppen (HASLETT et al. 1985, PAYNE et al. 1994, GASMI et al. 1996, WALZOG et al. 1997, HANNAH et al. 1998) generell die Induktion der Apoptose verantwortlich gemacht. Dennoch blieb die Möglichkeit einer induzierten primären Nekrose zu prüfen. Um sich dieser Frage in dieser Arbeit zu nähern wurde engmaschig über die Zeit der in vitro Kultur eine Anfärbung der Zellen mit Annexin V-FITC durchgeführt

Der Anteil Annexin V-FITC-markierter Zellen stieg mit der Zeit nach Ansatz der in vitro Kultur an, wobei die Fluoreszenzintensität unterschiedlich stark ausgeprägt war (s. Abb. 22).

Viele PMN wiesen nur eine schwache Bindung auf. Die Propidiumiodid und stark FL-1 positiven Zellen sind per definitionem im Übergang von einem primär apoptotischen in einen sekundär nekrotischen Vorgang, in dem bereits ein Integritätsverlust der Zellmembran vorliegt (s. Abb. 22). Ein primär nekrotischer Vorgang ist für diese schwach FL-1 positiven

Zellen denkbar, da sie im Gegensatz zu den stark FL-1 positiven Zellen auch eine schwache Rotfluoreszenz aufwiesen. Über eine Permeabilisierung der Zellemembran kann sowohl PI als auch Annexin V-FITC vermehrt in die Zelle eindringen und somit eine sich verstärkende Fluoreszenz erklärt werden. Eine Abnahme der PI-Färbung der schwach zu den stark fluoreszierenden Zellen ist nicht wahrscheinlich (Abb. 22 R2 und 5), was die Hypothese der primär nekrotischen Vorgänge der FL-1 schwach positiven PMN unterstützt. Alle FL-3 positiven Zellen weisen einen starken Größen- und Granularitätsverlust auf (s. Abb. 22), was zu der Vermutung führt, dass sie zu späteren Zeitpunkten nicht mehr als Zelle zu erkennen sind, sondern als Detritus vorliegen. Da durch den Färbevorgang mit Annexin V-FITC die Population mit diesen morphologischen Veränderungen selektiv depletiert wird, ist zu erklären, dass im Verlauf der 22 h der Anteil PI positiver Zellen nicht in dem Maße steigt, wie die Zahl vitaler Zellen ohne morphologische Veränderungen in den Parallelansätzen fällt (Daten nicht dargestellt). Von KÖNIG (2003) wurden ebenfalls bovine PMN mit Annexin V-FITC inkubiert. In dieser Arbeit war eine Unterscheidung der apoptotischen von den nekrotischen Granulozyten eindeutig gegeben, wobei zu beachten ist, dass die Zellen mit anderen Stimuli inkubiert wurden.