Generierung von Makrophagen durch in vitro Kultivierung monozytoider Zellen

monocyte derived macrophages)

Makrophagengewinnung aus bovinen Blutmonozyten nach Methode 1

Dieses durch SCHÜMANN (2001) veränderte Verfahren (Methode 1 nach JUNGI et al.

1996) diente der Gewinnung einer in Morphologie, Funktion und biochemischem Verhalten möglichst homologen, ausgereiften Makrophagenpopulation. Das Blut wurde unter sterilen Kautelen gewonnen. Dazu wurden die Tiere in gereinigte Räume gebracht. Aus der gestauten Vena jugularis wurden 90 ml Blut in einer sterilen 200 ml Schottflasche mit Zugabe von 10 ml ACD-Puffer (s. S. 49) zur Gerinnungshemmung unter ständigem Schwenken aufge-fangen. Das Blut wurde bei Raumtemperatur einer Stunde stehengelassen.

Während der weiteren Verarbeitung wurden das Blut, bzw. die Zellsuspensionen sukzessiv auf 4 bis 6°C heruntergekühlt.

In zwei 50 ml Zentrifugenröhrchen wurden 80 ml des Bluts bei 10°C und 1450 xg für 25 min ohne Bremse abzentrifugiert um den Buffy Coat, die leukozytenreiche Fraktion, zu gewinnen.

Für diesen Vorgang wurde eine Einmal-Pasteurpipette verwendet. Der Buffy coat wurde zu 100 ml des Citratpuffers (s. S. 49) in eine sterile 200 ml Schottflasche gegeben, mit Citrat-puffer auf 160 ml aufgefüllt und die Suspension auf vier 50 ml Röhrchen verteilt. Die anschließende Zentrifugation erfolgte bei 340 xg für 12 min bei 10°C mit schwacher Bremse.

Die Überstände wurden abgesogen.

Um eine maximale Ausbeute an mononukleären Zellen zu erreichen, wurde zu den erythrozytenhaltigen Zellpellets das noch nicht verwendete Blut gegeben. Ein weiterer Zentrifugationsschritt zur Gewinnung eines Buffy Coats wurde angeschlossen. Der so gewonnene Buffy Coat wurde auf die bereits einmal mit Citratpuffer gewaschenen Zellpellets aufgeteilt. Nach dem Lösen und der Resuspension der Pellets schloss sich ein weiterer Zentrifugationsschritt bei 340 xg und 10°C für 12 min an. Dieser Waschvorgang wurde etwa drei bis vier Mal wiederholt, bis der Überstand nach der Zentrifugation klar erschien.

Nach dem Absaugen des Überstandes bis auf 20 ml und der Aufteilung dieser Überstände auf zwei 50 ml Röhrchen, wurden 30 ml des kalten Lyse-Puffers (s. S. 49) in jedes Zentrifugen-röhrchen gegeben, gut geschwenkt und 5 bis 10 min bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Farbe sollte sich zu einem klarem Rot-Schwarz ändern. Eine erneute Zentrifugation für 10 min bei 10°C und 340 xg schloss sich an. Wenn das Pellet nach dem Absaugen des Überstandes leicht rötlich bis beige erschien, war die Lyse erfolgreich. Ein rotes bis schwarzes Pellet wurde noch einmal dem Lyse-Schritt unterzogen (doch wirkte sich eine zweite Lyse schädigend auf die Monozyten aus, Daten nicht gezeigt). Durch zügiges Aufrütteln des Zellpellets und der Resuspension in PBS-EDTA (20 ml), sollte die Adhärenz der Zellen an den Gefäßwänden vermindern werden.

Anschließend erfolgte eine Separation der Zellen durch Überschichtung des Lymphozyten-separationsmediums^® mit der Zellsuspension im Verhältnis von 1:3. Die Dichtezentrifugation wurde bei 810 xg, 4° C und ohne Bremse für 25 min durchgeführt.

Von nun an wurde, um Zelladhärenz zu vermeiden, auf Eis gearbeitet. Die gewonnenen MNC-reichen Interphasen wurden auf zwei Röhrchen mit je 20 ml kalter PBS-Vorlage (ohne EDTA) aufgeteilt und die Röhrchen mit PBS auf je 50 ml aufgefüllt. Zentrifugiert wurde nun bei 310 xg (4°C, 10 min). Nach Abnahme des Überstandes wurden die Zellen durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren in Iscové-Medium (s. S. 44, 3.2.5) aufgenommen und nach Zellzählung auf 6 x 10⁶ Zellen/ml eingestellt.

Diese Suspension wurde in Teflonbeutel überführt und die enthaltene Luft vor dem Verschweißen entfernt. Die Teflonbeutel mit einem Fassungsvolumen von ca. 20 ml sollten immer zwei hintereinander liegende Schweißnähte haben. Doppeltes bis dreifaches Verschweißen mit Kontrolle auf Dichte der Schweißnähte erwies sich als sinnvoll. Um einer Kontamination vorzubeugen, wurden die Nähte mit Alkohol eingesprüht, bevor sie in Petrischalen über sieben bis zehn Tage in einem Brutschrank bei 37°C und 8% CO2 (in Luft) inkubiert wurden.

Die Gewinnung der Makrophagenvorläuferzellen erfolgte nach der Kontrolle auf Hefen- oder Pilzkontamination unter einem Invertmikroskop. Kontaminierte Beutel wurden verworfen.

Nach Abkühlung der Beutel und nachdem die Zellen von der Unterseite durch Fingerklopfen gelöst worden waren, wurde der Inhalt jeweils zweier Beutel in ein 50 ml Röhrchen überführt.

Die weitere Behandlung der Zellen erfolgte auf Eis. Die Zellen wurden mindestens zweimal mit PBS gewaschen (s.o.). Zum Zählen und Einstellen der Suspension auf 2,5 x 10⁶ Makrophagenvorläufer/ml wurde das Zellpellet in 10 ml kaltem Iscové-Medium ohne Zusatz von Antibiotikum aufgenommen. Bei der mikroskopischen Betrachtung konnten ca. 20-30 % der Zellen als Makrophagenvorläufer angesprochen werden. Von dieser Zellsuspension wurde pro Kavität einer 6-well Makrotiterplatte ca. 1 ml eingesät. Um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu erreichen, wurden die Platten direkt nach Zugabe von 5 ml Medium/Vertiefung geschwenkt. Zur Ermöglichung der Zelladhärenz wurden die Kulturplatten drei bis vier Stunden im Brutschrank gelagert.

Zu Beginn der Ernte der Makrophagen wurden die einzelnen Vertiefungen sieben Mal mit warmem PBS gewaschen (Zugabe, Schwenken und vorsichtiges Abpipettieren aus der schräg gehaltenen Platte). Dieser Arbeitsschritt diente der Entfernung von Lymphozyten und dem FCS aus dem Medium, da FCS den im Folgenden verwendeten Enzymcocktail Accutase^® (s. S. 40, 3.2.3) inaktiviert. Je Kavität wurden 500 µl körperwarmer Accutase^® zugegeben, die Platte 10 sek geschwenkt und wieder abpipettiert. Nach Zugabe von 1000 µl Accutase^® erfolgte eine 10-minütige Inkubation im Brutschrank bei 38,5°C und 5% CO2 (in Luft). Durch Klopfen an den Behältnisböden wurde die Ablösung unterstützt. Nach Kontrolle der Ablösung wurde die Reaktion durch Zugabe von 1 ml Kulturmedium gestoppt. Die Zellen wurden in 15 ml Röhrchen überführt und mit Medium aufgefüllt. Die Makrophagen wurden anschließend bei 4°C und 250 xg für 10 min zentrifugiert, in I10F^+Strep aufgenommen, gezählt und im Medium auf die gewünschte Zellkonzentration eingestellt.

Makrophagengewinnung aus bovinen Blutmonozyten in Zellkulturflaschen (Methode 2) Dieses Verfahren wurde als zeitsparende Alternative zu der oben beschriebenen Methode 1 entwickelt. Geprüft werden sollte, ob sich die hiermit generierten Makrophagen morphologisch, phänotypisch und funktionell identisch zu den nach dem obigen Verfahren gewonnenen MDM verhalten.

Für die Makrophagengeneration in Zellkulturflaschen wurden wie unter 3.3.1 beschrieben pro Tier 150 ml heparinisiertes Blut gewonnen. Die Bearbeitung der Zellen geschah unter sterilen Bedingungen unter einer Reinluftarbeitsbank mit autoklavierten Mehrweg- oder sterilen Einwegmaterialien. Das Blut wurde mit PBS verdünnt (1:2) und in 50 ml Röhrchen im Verhältnis 1:3 über Lymphozytenseparationsmedium^® (s. S. 40, 3.2.3) geschichtet. Nach der Zentrifugation (1100 xg, 30 min, 4°C ohne Bremse) schloss sich die Entnahme der Interphase mit Überführung in 50 ml Röhrchen (mit 10 ml vorgelegtem PBS) an. Nach dreimaligem Waschen (s. S. 52) wurden die letzten Zellpellets in einem Röhrchen zusammengefasst und in Iscové-Medium mit 10% FCS und Streptomycin (I10F^+Strep) aufgenommen, auf 5 x 10⁶ Zellen/ml eingestellt und in Zellkulturflaschen überführt. In 200 ml Zellkulturflaschen wurden ca. 25–30 ml und in 70 ml Flaschen 7–10 ml Zellsuspension transferiert. Die Inkubation erfolgte bei 38,5°C und 5% CO2 (in Luft) für 6 Tage. Nach drei Tagen wurden 15-20 ml frisches Medium zugegeben und am fünften Tag das Medium durch abgießen und Zugabe frischen Mediums ersetzt.

Vor der Ernte der Zellen fand eine Kontrolle der Ansätze im Invertmikroskop auf mögliche Kontamination mit Bakterien oder Hefen sowie auf Adhärenz der Makrophagen statt. Der Inhalt kontaminierter Flaschen wurde nicht verwendet.

Die Ernte der Zellen erfolgte unter sterilen Kautelen. Das Medium mit nichtadhärenten Zellen wurde abgegossen. Vier Waschschritte mit 25 ml 37°C warmen PBS (Zugabe, schwenken und abgießen) schlossen sich zur Entfernung der restliche Bestandteiles des Mediums und Zelldetritus an. Den Flaschen wurde je 1ml auf 38,5°C erwärmte Accutase^® (s. S. 40, 3.2.3) zugefügt, durch Schwenken (10 sek) über die Oberfläche verteilt und wieder abgegossen.

Anschließend wurden 4 ml der Accutase^® zugegeben und für 10 min bei 38,5°C inkubiert.

Die Ablösung der Zellen vom Boden konnte durch Klopfen mit den Fingern am Boden der Flaschen nach 5 min unterstützt werden. Zumeist konnten ca. 80% der adhärenten Zellen (nach mikroskopischer Einschätzung) abgelöst werden. Die Zellsuspension wurde in 50 ml Röhrchen überführt. Alle weiteren Arbeitsschritte erfolgten auf Eis. Die Zellen wurden abzentrifugiert (250 xg, 4°C, 7 min), in 2 ml Medium (I10F^+Strep) resuspendiert und gezählt.

Abb. 2 zeigt die so gewonnenen Makrophagen nach durchflusszytometrischer Analyse.

Seitwärtsstreulicht (SSC)

Rotfluoreszenz (FL-3)

93%

6%

Vorwärtsstreulicht (FSC) 20%

80%

Seitwärtsstreulicht (SSC)

Abb. 2 Analyse der Vitalität und Reinheit aus Blutmonozyten generierter Makrophagen nach durchflusszytometrischer Erfassung

Makrophagen wurden mit dem Zellkulturflaschen-Verfahren aus Blutmonozyten generiert und durchflusszytometrisch charakterisiert. Das linke Dichtediagramm (FL-3/SSC) zeigt den relativ hohen Anteil PI-positiver = toter Zellen). Das rechte Dichtediagramm zeigt die korrelierte Darstellung Grösse/Komplexität (FSC/SSC) nach Ausschluss der toten Zellen. Makrophagen (93%) stellen sich als homogene Wolke mit relativ hohem SSC-Wert und höherem FSC-Wert dar. Der Anteil kontaminierender lymphoider Zellen beträgt hier 6%.

Besonderheiten beim Vergleich der beiden Verfahren zur Gewinnung boviner Makrophagen

Das Protokoll zur Generierung der Makrophagen nach JUNGI et al. (1996) (Methode 1) wurde genau befolgt. Zur besseren Vergleichbarkeit wurde das Protokoll der Methode 2 dahingehend verändert, dass die Temperatur auf 37°C und der CO2-Gehalt auf 8% angepasst wurden. Es erfolgten immer von zwei Tieren parallel beiden Verfahren der Makrophagen-gewinnung.