und der Abteilung experimentelle
Herz-, Thorax-, Transplantations- und Gefäßchirurgie der Medizinischen Hochschule Hannover
Untersuchungen zum Phänotyp und der Funktion regulatorischer T-Zellen nach Induktion von peripherer
Toleranz in einem allogenen porcinen Lungentransplantationsmodell
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover vorgelegt von
Stefanie Thissen aus Hildesheim
Hannover 2007
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Bernd Schröder 2. Gutachter: Apl. Prof. Dr. Heiner Niemann
Tag der mündlichen Prüfung: 31.05.2007
BAUMANN, H. UNGEFROREN, A. R. SIMON, J. M. HOHLFELD, J. H. KARSTENS, A.
HAVERICHand M. STRÜBER(2006):
Preoperative low-dose irradiation promotes long-term allograft acceptance and induces regulatory T cells in a porcine model of pulmonary transplantation.
Transplantation 82, 1, 93-101
S. THISSEN, B. KRUSE, G. WARNECKE, M. AVSAR, R. REINHARD, A.R. SIMON, A.
HAVERICHand M. STRUEBER(2007):
High Suppressive Potency of Isolated CD25+ T-cells in Porcine Allogenic Lung Transplantation in vitro
The Journal of Heart and Lung Transplantation, 26, 2, Suppl. 1, S72
B. KRUSE, S. THISSEN, G. WARNECKE, M. AVSAR, R. REINHARD, A.R. SIMON, A.
HAVERICHand M. STRUEBER(2007):
Important Role of Hematopoetic Chimerism for the Induction, but not for the Maintenance of Tolerance after Pulmonary Transplantation in Pigs
The Journal of Heart and Lung Transplantation, 26, 2, Suppl. 1, S252
Kongressbeiträge:
S. THISSEN, B. KRUSE, G. WARNECKE, M. AVSAR, R. REINHARD, A.R. SIMON, A.
HAVERICHand M. STRUEBER(2007):
High Suppressive Potency of Isolated CD25+ T-cells in Porcine Allogenic Lung Transplantation in vitro
ISHLT 27th Annual Meeting, San Francisco, 25.-28.04.2007
B. KRUSE, S. THISSEN, G. WARNECKE, M. AVSAR, R. REINHARD, A.R. SIMON, A.
HAVERICHand M. STRUEBER(2007):
Important Role of Hematopoetic Chimerism for the Induction, but not for the Maintenance of Tolerance after Pulmonary Transplantation in Pigs
ISHLT 27th Annual Meeting, San Francisco, 25.-28.04.2007
1 Einleitung 1
2 Literaturübersicht 2
2.1 Transplantationen . . . 2
2.1.1 Lungentransplantation . . . 2
2.2 Abwehrmechanismen des Immunsystems . . . 4
2.2.1 Abwehr von Krankheitserregern . . . 4
2.2.2 Abstoßung eines Transplantates . . . 5
2.2.2.1 Hyperakute Abstoßung . . . 6
2.2.2.2 Akute Abstoßung . . . 6
2.2.2.3 Chronische Abstoßung . . . 8
2.3 Immunsuppressive Medikamente . . . 9
2.4 Toleranzmechanismen . . . 10
2.4.1 Passive Toleranz-Mechanismen . . . 12
2.4.1.1 Ignoranz und Anergie . . . 12
2.4.1.2 Apoptose und Activation induced cell death (AICD) . . . 13
2.4.2 Aktive Toleranz-Mechanismen (Regulatorische T-Zellen) . . . 13
2.4.3 Induzierbare regulatorische T-Zellen . . . 14
2.4.4 Natürlich vorkommende CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen . . . 14
2.4.4.1 Entdeckung von Suppressor T-Zellen . . . 14
2.4.4.2 Thymusentstehung von CD4+CD25+ T-Zellen . . . 15
2.4.4.3 Periphere Entstehung von CD4+CD25+ T-Zellen . . . 17
2.4.4.4 Immunologischer Phänotyp der regulatorischen T-Zelle . . . 17
2.4.4.5 Mechanismen der Suppression . . . 18
2.4.5 Interaktion zwischen regulatorischen T-Zellen . . . 19
2.5 Toleranzinduktion . . . 20
2.5.1 Induktion zentraler Toleranz . . . 20
2.5.2 Induktion peripherer Toleranz . . . 21
2.5.3 Bedeutung von Tregs für Transplantattoleranz . . . 22
2.6.2 Mediumzusammensetzung . . . 23
2.6.3 Responderzellen . . . 24
2.6.4 Stimulatorzellen . . . 25
2.6.5 Zellproliferationsmessung . . . 25
2.6.6 Auswertung . . . 26
3 Material und Methoden 27 3.1 Experimentelles Design . . . 27
3.2 Versuchstiere . . . 27
3.2.1 Herkunft . . . 27
3.2.2 Charakterisierung des genetischen Phänotyps . . . 28
3.2.3 Unterbringung . . . 29
3.3 Anästhesie . . . 30
3.4 Operationstechnik . . . 31
3.5 Medikation . . . 31
3.5.1 Immunsuppression . . . 31
3.5.2 Antibiose . . . 32
3.5.3 Analgesie . . . 33
3.6 Nachbeobachtung und Abstoßungsmonitoring . . . 33
3.6.1 Blutentnahme . . . 33
3.6.2 Röntgenologische Untersuchung des Thorax (RöTx) . . . 34
3.6.3 Bronchoskopie . . . 35
3.6.4 Bronchoalveoläre Lavage (BAL) . . . 35
3.6.5 Transbronchiale Biopsie (TBB) . . . 36
3.6.6 Elektive Euthanasie . . . 37
3.6.7 Autopsie . . . 37
3.7 Auswahl der Tiere . . . 38
3.8 Charakterisierung des immunologischen Phänotyps . . . 39
3.8.1 Isolation peripherer Blutlymphozyten . . . 39
3.8.2 Antikörper . . . 40
3.8.3 Durchflusszytometrische Analyse . . . 41
3.8.4 Immunomagnetische Zellanreicherung . . . 42
3.8.5 Gemischte Lymphozytenkultur (MLR) . . . 43
3.9 Statistik . . . 46
4.2 Röntgenologische Befunde . . . 47
4.3 Histologische Befunde . . . 49
4.4 Differenzialblutbild . . . 50
4.5 Differentialzellbild der BAL . . . 50
4.5.1 Differentialzellbild der BAL in % . . . 50
4.5.2 Differentialzellbild der BAL in G/l . . . 50
4.6 Durchflusszytometrische Analyse der PBMC . . . 52
4.6.1 CD4 CD8 Färbung der Lymphozyten des peripheren Blutes in % . . . . 52
4.6.2 CD4 CD8 Färbung der Lymphozyten des peripheren Blutes in G/l . . . 53
4.6.3 CD4 CD25 Färbung der Lymphozyten des peripheren Blutes in % . . . 53
4.6.4 CD4 CD25 Färbung der Lymphozyten des peripheren Blutes in G/l . . 56
4.7 Durchflusszytometrische Analyse der BAL . . . 57
4.7.1 CD4 CD8 Färbung der Lymphozyten aus der BAL in % . . . 59
4.7.2 CD4 CD25 Färbung der Lymphozyten aus der BAL in % . . . 60
4.8 In-vitro-Suppressionsassay . . . 60
5 Diskussion 63 5.1 Versuchsmodell . . . 63
5.2 Toleranzinduktionsprotokolle . . . 65
5.3 Kritik der Methoden . . . 67
5.3.1 Abstoßungsmonitoring . . . 67
5.3.2 Charakterisierung des immunologischen Phänotypes . . . 68
5.3.3 Gemischte Lymphozytenkultur (MLR) . . . 70
5.3.4 Statistik . . . 71
5.4 Kritik der Ergebnisse . . . 71
6 Schlussfolgerungen 77
7 Zusammenfassung 79
8 Summary 81
9 Anhang 83
ALG Antilymphozytenglobuline APC antigen presenting cell
ATG Anti-T-Lymphozytenglobuline BAL bronchioalveoläre Lavage
BALF bronchioalveoläre Lavageflüssigkeit BGBl Bundesgesetzblatt
BmTx Knochenmarkstransplantation BOS Bronchiolitis obliterans Syndrom C Celsius
CD Cluster of Differentiation cm Zentimeter
COPD Chronical Obstructive Pulmonary Disease CsA Cyclosporin A
CTLA-4 cytotoxic T-lymphocyte associated antigen 4 Diff Differentialzellbild
DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonucleinsäure
DTx Transfusion unreifer spenderspezifischer dendritischer Zellen EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EKG Elektrokardiographie Ev Everolimus
FACS Durchflusszytometrie Fc Fragment crystallizable
FEV1 forciertes exspiratorisches Volumen in einer Sekunde
FiO2 Fraction of Inspired Oxygen, Sauerstoffanteil in der Inspirationsluft FITC Fluoresceinisothiocyanat
Flowmax maximaler Fluss
Foxp3 forkhead/winged helix transciption Factor FSC Forward Scatter, Vorwärtsstreulicht
G Gauge/Giga
g Gramm/Erdbeschleunigung
GITR glucocorticoid induced tumor necrosis factor receptor family related gene GM-CSF Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierender Faktor
GvHD Graft-versus-Host-Disease Gy Gray
h Stunde (hour)
HE Hämatoxylin-Eosin HS Hausschweinantigen Ig Immunglobulin IL Interleukin
IPPV intermittent positive pressure ventilation (Beatmung mit intermittierend positivem Druck) IRR irradiation (Kombination aus WBI und TI)
IS Immunsuppressivaspiegel
ISHLT International Society for Heart and Lung Transplantation IU internationale Einheit
kg Kilogramm KM Körpermasse l Liter
LZÜ Langzeitüberleber M molar
MEZ mitteleuropäische Zeit mg Milligramm
MHC Major Histocompatibility Complex MHH Medizinische Hochschule Hannover min Minute
mio Million ml Milliliter
MLR mixed lymphocyte reaction (gemischte Lymphozytenkultur) MMF Mycofenolat Mofetil
mM millimolar MV Minutenvolumen µg Mikrogramm µl Mikroliter
NaCl Natriumchlorid ng Nanogramm
NK natürliche Killerzelle nm Nanometer
NP Nierenparameter Pa Pascal
PBMC mononukleäre Zellen des peripheren Bluts PBS Phosphat gepufferte Salzlösung
PDS Polydioxanon PE R-Phycoerythrin
PEEP positiver endexspiratorischer Druck PHA-M Phytohemagglutinin
pmax maximaler Beatmungsdruck POD postoperative day
rpm Umdrehungen pro Minute S Spenderantigen
s Sekunde
SI Stimulationsindex
SLA swine leukocyte antigen SPF spezifisch pathogenfrei
SSC Side Scatter, Seitwärtsstreulicht Tac Tacrolimus
TBB transbronchiale Biopsie
TE time of exspiration (Ausatemzeit) TGF-β transforming growth factorβ
TI thymic irradiation/ time of inspiration (Einatemzeit) Treg regulatorische T-Lymphozyten
TZR T-Zell Rezeptor U units
UNOS United Network for Organ Sharing VT Tidalvolumen (Atemzugvolumen) WBI whole body irradiation
Statistische Größen
n Anzahl der Versuche
p probability, Irrtumswahrscheinlichkeit (Signifikanzniveau) SD Standardabweichung
SEM Standardfehler des Mittelwertes
¯
x arithmetischer Mittelwert
Die Lungentransplantation hat sich mit einer Einjahres-Überlebensrate von 76-81 % zu einem akzeptierten Therapiekonzept der terminalen Lungenerkrankungen entwickelt (FISCHER ET AL., 2000, 2002). Die Achillesferse dieser Therapie bleibt allerdings die Notwendigkeit einer lebenslangen pharmakologischen Immunsuppression. Vor allem in den ersten Monaten nach Transplantation führt eine insuffiziente Immunsuppression zur Schädigung des Transplantats aufgrund von Abstoßung, während eine exzessive immunsuppressive Therapie in erhöhter Morbidität und Mortalität durch opportunistische Infektionen und einer erhöhten Tumorinzidenz resultiert (ALLAN, 2004). Wünschenswert wäre eine spenderspezifische Transplantattoleranz ohne lebenslange immunsuppressive Therapie. Diese Transplantattoleranz wurde bereits in Nagermodellen durch Induktion oder Übertragung einer regulatorischen T-Zell Population (Treg) erfolgreich etabliert (COBBOLD ET AL., 2003a; KARIM ET AL., 2005). Alloreaktive T-Zellen in der Peripherie werden durch die Treg kontrolliert und so eine Abstoßung verhindert (COBBOLD ET AL., 2003b).
Im Jahr 1999 wurde an der Medizinischen Hochschule Hannover ein porcines Modell zur Induktion spenderspezifischer Immuntoleranz nach allogener Lungentransplantation etabliert (WARNECKE ET AL., 2005, 2006). In diesem Modell wurde das Transplantatüberleben bei Einsatz von verschiedenen einleitenden immunsuppressiven Protokollen untersucht. Hierbei ist es gelungen, in einigen Tieren eine dauerhafte Transplantattoleranz zu induzieren, allerdings resultiert der Einsatz desselben immunsuppressiven Protokolls in einer großen Diversität in Bezug auf das Transplantatüberleben. Obwohl eine Toleranz bei einigen Protokollen häufiger entstand als bei anderen, kam es in allen Versuchsgruppen auch zu Abstoßungsreaktionen.
Die Ursachen für eine Toleranzentwicklung müssen also in anderen Punkten als dem immunsuppressiven Protokoll begründet sein.
Die vorliegende Arbeit ist eine von zwei zeitgleich in diesem Projekt angefertigten Dissertationen, in denen teilweise retrospektiv Gründe für die unterschiedliche Toleranzentwicklung untersucht wurden. Diese Arbeit soll klären, inwiefern CD4+CD25+
Treg für das Transplantatüberleben der Tiere eine Bedeutung haben. Hierfür wurden langzeitüberlebende Tiere und Abstoßer mit unterschiedlichen Toleranzinduktionsprotokollen auf die Existenz und Funktion von Treg untersucht.
2.1 Transplantationen
Unter dem Begriff der Transplantation versteht man die Übertragung lebender Zellen, Gewebe oder Organe in einen Empfänger (WIESNER U. RIBBECK, 2000). Es werden verschiedene Formen der Transplantationen unterschieden: syngene Transplantation zwischen monozygoten Zwillingen, homologe Transplantation innerhalb eines Individuums (z.B.
Eigenhautverpflanzung nach Verletzungen), allogene Transplantation zwischen Individuen einer Spezies und xenogene Transplantation zwischen Individuen verschiedener Spezies (z.B.
die Übertragung von Schweineklappen in menschliche Herzen) (ROITT ET AL., 1991).
Die erste Organtransplantation beim Menschen fand im Jahre 1883 statt. Es war die Verpflanzung einer Schilddrüse, um das Krankheitsbild des Kretinismus ursächlich zu behandeln (SCHLICH, 1998). Diese frühen Versuche scheiterten jedoch am fehlenden Wissen um die Immunologie. Die Organe wurden bereits nach kurzer Zeit wieder abgestoßen, so dass die Organtransplantation, obwohl deren kurativer Ansatz erkannt worden war, bereits in den 30er Jahren wieder aufgegeben wurde. 1945 wurde die Forschung wieder aufgenommen, und 1962 gelang in Boston die erste erfolgreiche Nierenverpflanzung unter chemischer Immunsuppression. Vorher waren erfolgreiche Organübertragungen nur unter eineiigen Zwillingen möglich gewesen (HARRISON ET AL., 1956). Im Juni des selben Jahres gelang die erste erfolgreiche Lebertransplantation beim Menschen (STARZL ET AL., 1963) und ein Jahr später auch die erste Lungentransplantation als linksseitige Einzellungentransplantation (SANTILLÁN-DOHERTY ET AL., 2005). Übertragbare Organe sind heute Herz, Lunge, Leber, Niere, Bauchspeicheldrüse und Darm. Darüber hinaus können Knochenmaterial, Hornhaut, weiche Hirnhaut, Haut und viele andere Gewebe übertragen werden.
2.1.1 Lungentransplantation
Die Lungentransplantation ist heute ein akzeptiertes Therapiekonzept terminaler Lungenerkrankungen (DEMEO U. GINNS, 2001; GOTTLIEB ET AL., 2004;
SANTILLÁN-DOHERTY ET AL., 2005). In der Frühphase klinischer Lungentransplantationen
war die Inzidenz des frühpostoperativen Transplantatversagens hoch. WILDEVUURbeschreibt 1970 in einer ersten Zusammenfassung der Ergebnisse klinischer Lungentransplantationen eine Mortalität von über 50 % in der ersten Woche nach Transplantation (WILDEVUUR U. BENFIELD, 1970). Grund war neben technisch-chirurgischen Komplikationen vor allem die noch an den Anfängen stehende pharmakologische immunsuppressive Therapie. Durch die Einführung von Cyclosporin A (1980) konnte eine suffiziente Immunsuppression erreicht werden. Seither wurden in den Bereichen Spender-Management, Lungenkonservierung, operative Techniken, immunsuppressive Therapie, Infektionsprophylaxe sowie Abstoßungsmonitoring große medizinische Fortschritte erzielt (DEMEO U. GINNS, 2001).
Klinische Relevanz besitzen die Einzellungen-, die Doppellungen- und weit weniger häufig die Herz-Lungentransplantation. Lebendspenden im Sinne einer Übertragung einzelner Lungenlappen erfolgen, im Gegensatz zu anderen Organen wie Niere oder Leber, bis heute nur in sehr geringem Umfang (MATSUDA ET AL., 2004). Akzeptierte Indikationen für die Lungentransplantation sind Krankheiten, die mit einem fortschreitenden irreversiblen Funktionsverlust der Lunge einhergehen. Es kommen sowohl emphysematöse Erkrankungen, zum Beispiel die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (chronical obstructive pulmonary disease, COPD), Erkrankungen des Parenchyms wie die idiopathische pulmonale Fibrose, primäre pulmonale Hypertonie (PPHT) und Gendefekte wie die Cystische Fibrose als auch chronische infektiöse Erkrankungen wie Bronchiektasien (FISCHER ET AL., 2002; SANTILLÁN-DOHERTY ET AL., 2005). Die Inzidenz der Erkrankungen, die eine Transplantation nötig machen, nimmt stetig zu. Deshalb ist heute ein erhebliches Missverhältnis zwischen verfügbaren Spenderorgenen und potentiellen Organempfängern entstanden. Zurzeit versterben etwa 15-20 % der Patienten noch auf der Warteliste (EUROTRANSPLANT ANNUAL REPORT 2005, WWW.EUROTRANSPLANT.NL). Doch auch nach Transplantation sind die Langzeitprognosen von lungentransplantierten Patienten, verglichen mit Empfängern anderer solider Organe, ungünstig (GOTTLIEB ET AL., 2004).
Die Neunjahres-Überlebensrate einzellungentransplantierter Patienten liegt bei nur 36 %, verglichen mit einem Zehnjahres-Überleben von 52 % bei Herztransplantatempfängern (FISCHER ET AL., 2000). Grund hierfür ist die schwierige Gratwanderung zwischen maximaler transplantatschützender Immunsuppression und minimaler Beeinträchtigung der Infektabwehr.
Vor allem in den ersten Monaten nach Transplantation bedingt eine intensive Immunsuppression zur Verhinderung der Abstoßung eine erhöhte Morbidität und Mortalität durch opportunistische Infektionen (ALLAN, 2004). Gerade Lungentransplantate sind über die Atemluft permanent einem höheren Keimdruck ausgesetzt als alle anderen transplantierten soliden Organe.
Rezidivierende Pneumonien begünstigen sogenannte infektgetriggerte Abstoßungsreaktionen,
die die Transplantatfunktion erheblich einschränken oder sogar lebensbedrohend sind (GOTTLIEB ET AL., 2004). Die Mehrzahl der Patienten hat mindestens eine akute Abstoßungsreaktion, wobei mehrere akute Abstoßungsreaktionen einen Risikofaktor für die Entstehung einer chronischen Abstoßung (Bronchiolitis obliterans) darstellen (KHALIFAH ET AL., 2005). Diese oft therapieresistente fortschreitende Atemwegserkrankung geht mit dem Funktionsverlust des Spenderorgans einher und führt in 30 % der Fälle zum Tode oder macht eine Retransplantation nötig (DAVIS U. PASQUE, 1995). Vor diesem Hintergrund gewinnt vor allem die Verminderung rezidivierender akuter Abstoßungsepisoden an Bedeutung, da diese letztendlich zum Transplantatverlust oder zum Tod des Patienten durch chronische Organabstoßung führen können (TOUNGOUZ ET AL., 2003).
2.2 Abwehrmechanismen des Immunsystems
Der menschliche Körper muss sich jeden Tag gegen eine Vielzahl von eindringenden Krankheitserregern verteidigen. Um diese Aufgabe erfüllen zu können, ist es von großer Bedeutung, dass das menschliche Immunsystem zwischen Selbst- und Fremdantigen unterscheiden kann (GEENEN ET AL., 2001).
2.2.1 Abwehr von Krankheitserregern
Bei der Abwehr von Fremdantigen werden zunächst die Mechanismen der angeborenen Immunität aktiviert, die sich dadurch auszeichnen, dass sie unspezifisch auf Fremdantigen reagieren. Diese unspezifische Reaktion wird durch Monozyten, Makrophagen, natürliche Killerzellen (NK-Zellen) und Granulozyten hervorgerufen. NK-Zellen töten alle Zellen, die Eigenschaften von Fremdantigen aufweisen, wobei die Erkennung teilweise über Major Histocompatibility Complex-(MHC)-I-Moleküle vermittelt wird, die genauen Mechanismen aber immer noch weitestgehend unbekannt sind (LÓPEZ-BOTET ET AL., 2000; MORETTA ET AL., 2000). Monozyten, Makrophagen und Granulozyten können nach Phagozytose Krankheitserreger intrazellulär abtöten oder durch Degranulierung eine extrazelluläre Abtötung herbeiführen (KIRCHNER ET AL., 1993). Mit einiger zeitlicher Verzögerung setzt die spezifische Immunabwehr ein, bei der das phagozytierte Fremdantigen zunächst in Peptidfragmente zerlegt und dann den Lymphozyten auf der Zelloberfläche in MHC-Molekülen präsentiert wird (LONG, 1992). Die an der spezifischen Immunabwehr wesentlich beteiligten B- und T-Lymphozyten erkennen Antigen nur, wenn es ihnen in Kombination mit diesen MHC-Molekülen präsentiert wird (ARNOLD, 2002). T- und B- Lymphozyten entstehen aus lymphoiden Vorläuferzellen im Knochenmark. Während die lymphoiden Vorläuferzellen
der T-Lymphozyten aus dem Knochenmark in den Thymus wandern, entwickeln sich die B-Lymphozyten im Knochenmark selbst.
Immunzellen besitzen in Abhängigkeit von ihrer Funktion und ihres Entwicklungszustandes ein für sie jeweils spezifisches Muster an Oberflächenmarkern (GEENEN ET AL., 2001). Diese sogenannten CD-Moleküle (cluster of differentiation) können dazu benutzt werden, um einen Zelltyp zu charakterisieren, da sie ein phänotypisches Unterscheidungskriterium darstellen (ZOLA, 2001).
Die sich im Thymus aus den lymphoiden Vorläuferzellen entwickelnden und heranreifenden T-Lymphozyten exprimieren zunächst weder CD3 noch CD4 oder CD8 und damit keines der drei Moleküle, die reife T-Zellen definieren. Sie werden als doppelt negative Zellen bezeichnet (STAAL ET AL., 2001). Danach gelangen sie in ein Stadium, in dem sie alle der drei genannten CD-Moleküle exprimieren. Sie werden dann als doppelt positive Zellen bezeichnet (AMSEN U. KRUISBEEK, 1998). Weniger als 5% von diesen Zellen entwickeln sich nach positiver Selektion weiter zu einfach positiven Zellen, die neben CD3 entweder das CD4- oder das CD8-Molekül exprimieren. CD3 ist ein Leitmarker für T-Zellen, der an der Signaltransduktion ins Innere der T-Zelle beteiligt ist (ALARCÓN ET AL., 2003). Die CD4+ T-Zellen tragen Rezeptoren, die an MHC II Moleküle gebundene Peptide erkennen und werden als T-Helferzellen (TH) bezeichnet. CD8+ T-Zellen erkennen hingegen Peptide, welche an MHC I Moleküle gebunden sind und werden als T-Effektorzellen bezeichnet (LONG, 1992). Nach ihrer antigenspezifischen Aktivierung proliferieren die Lymphozyten und initiieren eine effektive Abwehr gegen spezifische Pathogene. Aus B-Zellen entwickeln sich Antikörper produzierende Plasmazellen. CD8+ T-Effektorzellen lösen bei erfolgreicher Antigenerkennung die Apoptose der antigentragenden Zelle aus. CD4+ T-Helferzellen leisten einen wichtigen Beitrag bei der Aktivierung von B-Zellen und erhöhen die Effektivität von Makrophagen. Im Gegensatz zu den Zellen der angeborenen Immunität sind alle Zellen der spezifischen Immunabwehr in der Lage, Gedächtniszellen auszubilden. Die Elimination eines schon bekannten Antigens kann somit schneller und effektiver erfolgen als bei Erstkontakt (JANEWAY U. TRAVERS, 1997).
2.2.2 Abstoßung eines Transplantates
Nach Organtransplantationen kann das Transplantatgewebe vom Empfänger abgestoßen werden. Man spricht dann korrekterweise von der Host-versus-Graft-Disease (HvGD), welche im Weiteren als Abstoßung bezeichnet werden. Bei der Knochenmarkstransplantation, bei der viele immunkompetente Zellen übertragen werden, kann es aber auch dazu kommen, dass das Empfängergewebe von den Leukozyten des Spenders angegriffen wird und
eine Graft-versus-Host-Disease (GvHD) entsteht. Schon früh erkannte die Medizin, dass Abstoßungsreaktionen nur bei Transplantationen zwischen genetisch verschiedenen Individuen auftraten, auto- und isogene Transplantate hingegen führten zu einer Organakzeptanz (ANDERSON ET AL., 1951). Interaktionen zwischen Empfänger und Spenderorgan sind vor allem auf eine genetische Differenz von zellulären Oberflächenantigenen zurückzuführen und somit entscheidend vom Verwandtschaftsgrad abhängig (GORER, 1938).
Abstoßungsreaktionen können nach verschiedenen Kriterien eingeteilt werden, wobei jedoch in vivo eine scharfe Trennung nicht immer möglich ist. Teilt man die Abstoßungen nach zeitlichen Kriterien ein, so kann man hyperakute, akute und chronische Abstoßungen unterscheiden.
Ausgehend von der Pathogenese unterscheidet man humorale von zellvermittelten Abstoßungsreaktionen.
2.2.2.1 Hyperakute Abstoßung
Die hyperakute Abstoßung ist vornehmlich humoral bedingt. Binnen Minuten kommt es auf Grund präformierter Antikörper gegen MHC- oder Blutgruppenantigene des Spenders zu einer Komplementaktivierung und intravasalen Koagulation im Transplantat mit einer massiven hämorrhagischen Infarzierung (BRAUN, 2003). Aufgrund präformierter Antikörper gegen speziesfremde Oberflächenantigene stellt diese Art der Abstoßung ein Hauptproblem in der Xenotransplantation dar (LEE ET AL., 2006).
2.2.2.2 Akute Abstoßung
Die akute Abstoßung ist primär T-zellvermittelt. Hierbei erkennen T-Effektorzellen mit antigenspezifischen T-Zell-Rezeptoren (TZR) das körperfremde Gewebe (SUTHANTHIRAN U. STROM, 1994). Die Spezifität der Antigene, gegen die sich die Transplantatabstoßung richtet, ist genetisch fixiert. Die MHC-Moleküle werden von 3 verschiedenen Genloci kodiert. Die vom MHC-I-Locus kodierten und ebenso genannten MHC-I-Moleküle finden sich auf allen kernhaltigen Zellen und Thrombozyten (also nicht auf Erythrozyten). Der MHC-II-Locus kodiert die MHC-II-Moleküle, die nur auf bestimmten Zellen des Immunsystems existieren.
Hierzu gehören B-Zellen, Makrophagen, dendritische Zellen und T-Zellen nach Aktivierung (ROITT ET AL., 1991). Mit Ausnahme der T-Zellen fasst man diese Zellen auch als antigenpräsentierende Zellen (APC) zusammen (LU ET AL., 1999). Im MHC-III-Locus schließlich sind minor histocompatibility complex Antigene kodiert.
Für die Transplantatabstoßung besitzen hauptsächlich die MHC I und II Moleküle Bedeutung.
Diese präsentieren extrazellulär Peptidfragmente aus dem Zellinneren, wobei die Herkunft der Peptidfragmente in MHC I und II Molekülen unterschiedlich ist. MHC I Antigene
präsentieren im Cytosol produzierte Fragmente, MHC II Antigene präsentieren Peptide aus phagozytierten Vesikeln. T-Lymphozyten binden sich mittels ihrer T-Zell-Rezeptoren spezifisch an die MHC/Peptid-Komplexe. Bei der ersten Begegnung mit einem Antigen benötigen sie neben der Rezeptorbindung für ihre Aktivierung eine Kostimulation. Diese kostimulierenden Moleküle existieren ausschließlich auf professionellen antigenpräsentierenden Zellen wie z.B. Makrophagen. Fehlt bei der Antigenerkennung das kostimulierende Signal, wird die T-Zelle anergisch und kann auch durch zukünftigen Antigenkontakt nicht mehr stimuliert werden. Hierdurch inaktiviert das Immunsystem autoreaktive T-Zellen und sichert die Toleranz gegenüber körpereigenem Gewebe. Nach erfolgreicher Antigenerkennung und Kostimulation der T-Zellen kommt es zur Interleukin 2 (IL-2) abhängigen Aktivierung. Im naiven Zustand besteht der IL-2 Rezeptor aus einer β−und einer γ−Kette und bindet IL-2 mit einer geringen Affinität. Aktivierte T-Zellen exprimieren als Ergänzung des IL-2-Rezeptors eine α-Kette (CD25), wodurch der IL-2 Rezeptor eine sehr hohe Affinität erhält und die Bindung von IL-2 zur klonalen Expansion der T-Zelle führt. T-Zellen können nach ihrer Aktivierung ohne Kostimulation agieren. Für die differentielle Erkennung von MHC Molekülen sind zusätzlich auf zytotoxischen T-Zellen CD8 Moleküle und auf T-Helferzellen CD4 Moleküle von Bedeutung. Sie assoziieren sich während der Antigenerkennung mit dem T-Zell Rezeptor und binden sich zusätzlich an den MHC/Peptid/T-Zell Rezeptor Komplex. Zytotoxische T-Effektorzellen induzieren bei Erkennung des MHC I/Peptid-Komplexes den Tod der präsentierenden Zelle. Aktivierte T-Helferzellen verstärken durch Bindung an den MHC II/Peptid-Komplex die Aktivität von Makrophagen und B-Zellen (JANEWAY U. TRAVERS, 1997).
Die akute Abstoßung kann nach ihrem Pathomechanismus in zwei weitere Untergruppen gegliedert werden, die direkte und die indirekte Abstoßung.
Direkte Abstoßung
Bei der direkten Abstoßung erkennen T-Zellen des Empfängers direkt MHC/Peptid-Komplexe auf antigenpräsentierenden Zellen des Spenders. Dies stellt nicht den physiologischen Weg der Antigenerkennung dar, da die T-Zell-Rezeptoren des Empfängers selbst-MHC restringiert sind, und eigentlich nicht in der Lage sein sollten, Fremd-MHC-Moleküle zu erkennen.
Eine Zeit lang war unklar, ob diese Reaktion möglicherweise durch eine Subpopulation von T-Zellen hervorgerufen wird, die sich der Positivselektion im Thymus entzogen hat. Inzwischen besteht weitestgehend Einigkeit darüber, dass reguläre T-Zellen über den Mechanismus der Kreuzreaktivität auch Fremd-MHC Moleküle binden können. Die Bindung einer T-Zelle ist von der räumlichen Struktur des gesamten Peptid-MHC-Komplexes abhängig.
Auf Grund der Vielfalt des T-Zell-Rezeptorrepertoires, der hohen Zahl an verschiedenen
Fremd-MHC-Peptid-Komplexen auf einem Transplantat und der relativ geringen Affinität des T-Zellrezeptors zu seinem MHC-Peptid-Liganden wird davon ausgegangen, dass bis zu 10%
der T-Zell-Rezeptoren Alloreaktivität aufweisen (HEEGER, 2003). Je nachdem, ob hierbei das Peptid oder das Fremd-MHC-Molekül führend für die Stärke der Interaktion mit dem T-Zellrezeptor ist, spricht man von peptid- oder MHC-dominanter Bindung. T-Zellen können sowohl Allo-MHC-Moleküle unabhängig von dem gebundenen Peptid erkennen (SMITH U. LUTZ, 1997), als auch das Peptid unabhängig vom präsentierenden MHC-Moleküle (HEEGER, 2003). Auf die Aktivierung der T-Zellen folgt deren Proliferation und Differenzierung mit Aufnahme ihrer Effektorfunktionen.
Indirekte Abstoßung
Die indirekte Abstoßung erfolgt über die physiologischen Mechanismen der Ausbildung einer Immunreaktion gegen Fremdantigene. Hierbei werden Alloantigene von antigenpräsentierenden Zellen des Empfängers phagozytiert, prozessiert und im Lymphknoten den T-Zellen präsentiert (HEEGER, 2003). Bei erfolgreicher Antigenerkennung proliferieren diese und differenzieren zu Effektor-T-Zellen.
Beide Formen, die direkte wie auch die indirekte Abstoßung, beziehen über Zell-Zell-Interaktionen und über Sekretion von Zytokinen immer auch andere Arten von Immunzellen in die Reaktion mit ein. Auch läuft in vivo nicht entweder eine direkte oder eine indirekte Abstoßung ab, sondern stets beide parallel zueinander, wenn auch zu unterschiedlichen Anteilen. Die Unterscheidung der beiden Formen ist insofern sinnvoll, da sie zwei alternative, wenn auch parallel ablaufende, Mechanismen der Initiierung von Alloreaktionen darstellen. Betrachtet man die akute Abstoßung und das chronische Transplantatversagen, so scheinen die direkte und die indirekte Alloantigenerkennung unterschiedlichen Anteil an deren Entstehung und Ausmaß zu haben (HEEGER, 2003).
2.2.2.3 Chronische Abstoßung
Die chronische Abstoßung ist multifaktoriell bedingt. An ihr sind neben alloreaktiven T-Zellen und der Sekretion von alloreaktiven Antikörpern durch aktivierte B-Lymphozyten auch makrophagenvermittelte Entzündungs- und Umbauprozesse, Immunsuppressivatoxizitäten oder Virusreaktivierungen beteiligt (SUTHANTHIRAN U. STROM, 1994). Da hier neben der Abstoßung im immunologischen Sinne auch andere Faktoren an der progredienten Schädigung des Transplantates beteiligt sind, wird der Prozeß häufig auch als chronisches Transplantatversagen bezeichnet.
Das Bronchiolitis obliterans Syndrom (BOS) ist das Hauptproblem für das Langzeitüberleben der transplantierten Lunge (CECKA, 1998). Dabei handelt es sich um eine progrediente Funktionseinschränkung, die Monate bis Jahre nach Transplantation auftritt und schließlich zum Funktionsverlust des Transplantats führt. Unter den potentiellen Risikofaktoren für die chronische Transplantatdysfunktion scheinen akute Abstoßungsreaktionen eine herausragende Rolle zu spielen (TULLIUS ET AL., 1997). Klinisch wird dies vor allem durch die enge Korrelation zwischen der Anzahl akuter Abstoßungsepisoden und dem Risiko einer chronischen Abstoßung belegt (ALMOND ET AL., 1993). Dieses Risiko bleibt auch nach erfolgreicher Therapie der akuten Abstoßung bestehen (GULANIKAR ET AL., 1992). Das BOS ist kaum medikamentös beeinflussbar, so dass als einzig effektive Therapie eine Retransplantation in Frage kommt (FISCHER ET AL., 2000)
2.3 Immunsuppressive Medikamente
Moderne immunsuppressive Medikamente sind heute in den meisten Fällen in der Lage, akute Abstoßungsreaktionen zu kontrollieren. Sie lassen sich in vier Kategorien einteilen:
Hochwirksame entzündungshemmende Mittel aus der Familie der Corticosteroide - wie Prednisolon - hemmen das Immunsystem unspezifisch, denn sie modulieren über nahezu in jeder Körperzelle vorhandene Glucocorticoidrezeptoren die Gen-Expression. Hierdurch vermindern sie die Leukozytenmigration aus den Blutgefäßen, induzieren Apoptose bei Lymphozyten und eosinophilen Granulozyten und supprimieren die Zytokinproduktion.
Zellproliferationshemmer - wie Azathioprin, Mycofenolat Mofetil oder Cyclophosphamid - stören die DNA-Synthese. Ihre stärkste pharmakologische Wirkung entfalten sie in sich teilenden Geweben. Der Einsatz als Immunsuppressivum basiert auf ihrer Toxizität für sich teilende Lymphozyten. Azathioprin beeinflusst unspezifisch Entwicklung und Wachstum verschiedener Zellen des Immunsystems. MMF hemmt spezifisch aktivierte B- und T-Lymphozyten. Everolimus und Sirolimus inhibieren Botenstoffe, die für die Aktivierung von B- und T-Lymphozyten erforderlich sind.
Selektivere Immunsuppressiva sind Calcineurininhibitoren wie z.B. Cyclosporin A, Tacrolimus und Rapamycin. Das Enzym Calcineurin ist an der Signalweiterleitung aktivierter T-Lymphozyten beteiligt. Calcineurinhemmer verhindern die Signalweiterleitung und damit die Aktivierung der T-Zelle. Sie blockieren die T-Zell-Proliferation durch Verminderung der Expression mehrerer Zytokingene, die normalerweise bei der T-Zell-Aktivierung induziert werden. Dazu zählt auch das Gen für IL-2, dessen Synthese durch T-Lymphozyten ein wichtiges Wachstumssignal für T-Zellen darstellt. Rapamycin blockiert den IL-2 Rezeptor und verhindert
dadurch die Signalgebung.
Monoklonale oder polyklonale Antikörper, die gegen Zellen des Immunsystems gerichtet sind, wie OKT3, Basiliximab oder Daclizumab, ALG und ATG, finden Anwendung während der einleitenden immunsuppressiven Therapie und als Rescuetherapie bei rezidivierenden akuten Abstoßung. Der monoklonale Antikörper Muromonab-CD3 (OKT3) bindet sich spezifisch an die ε-Kette des CD3-Moleküls, das auf allen reifen T-Zellen exprimiert wird und für die Signaltransduktion des T-Zell-Rezeptors verantwortlich ist. OKT3 führt so zur raschen Elimination aller reifen, CD3+ T-Zellen. Basiliximab und Daclizumab sind monoklonale Antikörper (CD25), die über eine selektive Blockade der α-Kette des IL-2 Rezeptors die Proliferation der aktivierten T-Zelle verhindern. Polyklonale Antikörper wie Antilymphozytenglobuline (ALG) und Anti-T-Lymphozytenglobuline (ATG) sind ein Gemisch aus Antikörpern, die gegen verschiedene Epitope auf T-Zellen gerichtet sind. ALG wirken gegen eine Vielzahl von Antigenen auf allen Lymphozyten, ATG etwas spezifischer nur auf T-Lymphozyten. Polyklonale Antikörper wirken zytotoxisch: Sie reagieren mit verschiedenen Oberflächenstrukturen der Lymphozyten und binden Komplement, hierdurch wird die Zellaktivität gehemmt, und durch Lyse - und möglicherweise auch durch Apoptose - erfolgt die rasche Elimination der Lymphozyten aus dem Blut (BARSHES ET AL., 2004).
Alle diese Mittel unterdrücken jedoch schützende sowie schädigende Funktionen des Immunsystems gleichermaßen (JANEWAY U. TRAVERS, 1997). Deshalb entwickeln infolge der chronischen Immunsuppression viele Patienten opportunistische Infektionen und maligne Tumoren, die nicht selten zum Tode führen (GOTTLIEB ET AL., 2004). Außerdem haben medikamententoxische Schädigungen vor allem der Nierenfunktion, insbesondere unter Therapie mit Calcineurininhibitoren, einen erheblichen Einfluß auf den Langzeitverlauf nach Transplantation.
2.4 Toleranzmechanismen
Als Toleranz bezeichnet man die Unfähigkeit des Immunsystems, auf ein Antigen zu reagieren.
Die Selbsttoleranz gegenüber körpereigenem Antigen ist eine wichtige Eigenschaft des Immunsystems. Von der zentralen Toleranz, die während der Lymphozytenentwicklung in den zentralen Immunorganen entsteht, wird eine periphere Toleranz unterschieden, die reife Lymphozyten in peripheren Geweben entwickeln.
Zentrale Toleranz
T-Zellen, die an einer Transplantatabstoßung beteiligt sind, erkennen das Alloantigen über spezifische T-Zell-Rezeptoren. Diese bestehen aus zwei Transmembranproteinen, die zur Erkennung von Antigen variable Regionen besitzen. Die Diversivität dieser Proteine ist genetisch festgelegt und entsteht während der T-Zell-Entwicklung durch somatische Rekombination verschiedener Gensegmente. T-Zellen erkennen das Antigen nur in Verbindung mit körpereigenen MHC Molekülen. Während der Thymusreifung durchlaufen die T-Zellen eine positive und negative Selektion. Durch die positive Selektion proliferieren nur Lymphozyten bei erfolgreicher Erkennung von körpereigenen MHC Molekülen, während durch die negative Selektion eine Entwicklung von autoreaktiven T-Zellen verhindert wird.
Die zentrale Toleranz gegen körpereigenes Antigen entsteht durch negative Selektion im Thymus. Erkennt eine unreife T-Zelle ein Antigen, wird die T-Zelle apoptotisch. Für diese Selektion wird im Thymus eine große Auswahl an Selbstantigen präsentiert. Im Laufe ihrer Entwicklung überleben nur etwa 2 % der T-Zell-Vorläufer aus dem Knochenmark diese Selektionsmechanismen und werden als reife CD4+ oder CD8+ T-Zellen in die Peripherie entlassen (JANEWAY U. TRAVERS, 1997).
Bei der Selektion von T-Zellen im Thymus geht man davon aus, dass T-Zellen, deren TZR eine hohe Affinität bzw. Avidität gegen das präsentierte Autoantigen aufweist, deletiert werden (MARIATHASAN ET AL., 1999; LERMAN ET AL., 2004), während T-Zellen mit einem TZR geringerer Affinität/Avidität dieser Depletion entgehen und als potenzielle Effektor-T-Zellen den Thymus verlassen (JAMESON U. BEVAN, 1998; MARIATHASAN ET AL., 2000; STEFANSKI ET AL., 2001; UTTING ET AL., 1998). Affinität beschreibt hierbei die Stärke der Antigen-Rezeptor-Wechselwirkung und Avidität stellt das Produkt aus Affinität und der Anzahl der vorhandenen Rezeptoren dar. Dieser Mechanismus bietet allerdings keine Erklärung für Toleranz gegenüber Selbstantigenen beispielsweise aus Auge, Gehirn und Hoden, die nicht im Thymus präsentiert werden. Auch übertrifft die Anzahl möglicher Kombinationen fremder, MHC-assoziierter Peptide die Anzahl potenzieller T-Zell-Rezeptor-Klonotypen mindestens um den Faktor 1000 (MASON, 1998). Um also jedes eindringende Pathogen zu erkennen und effizient zu zerstören, muss ein TZR eine relativ starke Kreuzreaktivität aufweisen. Mathematische Näherungen gehen davon aus, dass eine T-Zelle mit ihrem TZR bis zu 100 verschiedene MHC-gebundene Peptide erkennen kann (MASON, 2001). Es wird deshalb angenommen, dass das Immunsystem auch potentiell autoreaktive T-Zellen positiv selektioniert, um das T-Zellrepertoire zu vergrößern. Dieser Vorteil wird mit dem Risiko erkauft, dass gesunde Individuen in der Peripherie autoreaktive T-Zellen mit einem relativ schwach-affinen Rezeptor gegen verschiedene Autoantigene besitzen (LOHMANN ET AL.,
1996; SEMANA ET AL., 1999; BOUNEAUD ET AL., 2000; MASON, 2001). Als Konsequenz kann die zentrale Toleranz nur ein Teil der Mechanismen sein, welche Autoimmunreaktionen verhindern.
Periphere Toleranz
Viele Studien zeigen, dass die negative Selektion im Thymus keine vollständige Elimination aller autoreaktiven T-Zellen zur Folge hat. Die ergänzenden Mechanismen werden unter dem Begriff der peripheren Toleranz zusammengefasst, wobei noch zwischen passiven und aktiven Mechanismen unterschieden wird.
2.4.1 Passive Toleranz-Mechanismen
2.4.1.1 Ignoranz und Anergie
Die theoretisch einfachste Form der peripheren Toleranz stellt die Ignoranz dar. Werden Autoantigene entweder an immunprivilegierten Stellen wie z.B. Placenta, Auge oder Hoden (ALFERINK ET AL., 1998; ZINKERNAGEL, 1996) oder in zu geringer Zahl präsentiert, so dass eine T-Zelle nicht ausreichend stimuliert wird, spricht man von Ignoranz (KURTS ET AL., 1998, 1999). Werden beispielsweise Autoantigene des Pankreas in jungen Mäusen nicht adäquat präsentiert, so dass die T-Zelle kein ausreichendes TZR-Signal erhält, kommt es auch nicht zur Entstehung eines murinen Diabetes (HÖGLUND ET AL., 1999; ANDRÉ ET AL., 1996).
Alternativ dazu kann jedoch die Erkennung von Autoantigenen zu einer funktionellen Inaktivierung, der sogenannten Anergie, der T-Zellen führen. Er wurde erstmals als ein Ruhezustand, ausgelöst durch einen TZR-Stimulus ohne kostimulierende Signale beschrieben (JENKINS U. SCHWARTZ, 1987; SCHWARTZ, 2003). Einige Untersuchungen zeigten jedoch, dass weitere Rezeptoren bei der Auslösung von Anergie eine entscheidende Rolle spielen.
Bei B7-1 (CD80) und B7-2 (CD86) handelt es sich um costimulierende Moleküle auf antigenpräsentierenden Zellen, die mit CTLA-4 und CD28 auf T-Zellen interagieren und T-Zell-Wachstum anregen. Trotzdem konnte beobachtet werden, dass das Blockieren von B7-1 und B7-2 nicht wie erwartet Toleranz induzierte, sondern diese durchbrach (LANE ET AL., 1996). Auch entwickeln Mäuse, welche defizient für CTLA-4 sind, schwere Autoimmunerkrankungen, die zum Tod der Mäuse führen (TIVOL ET AL., 1995; WATERHOUSE ET AL., 1995). Dies erklärt sich dadurch, dass die Bindung von CD80 und CD86 auf der antigenpräsentierenden Zelle (APC) und CTLA-4 (KRUMMEL U. ALLISON, 1995; WALUNAS ET AL., 1996) auf der T-Zelle auch für die Induktion der Anergie in vivo eine entscheidende
Rolle spielt (WALUNAS U. BLUESTONE, 1998; PEREZ ET AL., 1997).
Da die Anergie mit funktioneller Inaktivierung gleichzusetzen ist, scheint eine rationelle Erklärung dafür, dass anergisierte T-Zellen in vivo persistieren (PAPE ET AL., 1998) bisher nicht zu existieren. Möglicherweise nehmen diese T-Zellen eine andere als ihnen bisher zugedachte Stellung im Immunsystem ein.
2.4.1.2 Apoptose und Activation induced cell death (AICD)
Zytotoxische T-Zellen zerstören ihre Zielzellen nach erfolgreicher Antigenerkennung über die Auslösung von Apoptose durch die gezielte Degranulation von Cytotoxinen (Perforine und Granzyme). Bei der Apoptose handelt es sich um eine aktiven Prozeß der apoptotisch werdenden Zelle, bei der die Zelle zunächst ihren Zellkern aufspaltet und anschließend durch die Absonderung von Vesikeln in sich zusammen schrumpft. T-Zellen können auch selbst von anderen T-Zellen durch diesen Mechnismus getötet werden.
Der rigoroseste Mechanismus der peripheren Toleranz ist die Eliminierung autoreaktiver T-Zellen in der Peripherie durch den so genannten Activation induced cell death (AICD). Ein Schlüsselmechanismus des AICD ist die Ligation von Fas (CD95) auf der T-Zelle und seinem Liganden FasL (CD95L) auf der APC. Dieser Beobachtung lag die Entdeckung zugrunde, dass das Lymphoproliferative Lupus-ähnliche Syndrom, eine Autoimmunkrankheit, die mit einer Anhäufung von CD8-/CD4- T-Zellen einhergeht, mit Fas- bzw. Fas-Ligand-defizienten Mäuse korreliert werden konnte (WATANABE-FUKUNAGA ET AL., 1992; SUDA ET AL., 1993). Weitere Studien zeigen, dass das für die Proliferation von T-Zellen wichtige Cytokin Interleukin-2 bei AICD eine entscheidende Rolle spielt (SUZUKI ET AL., 2001). So konnte gezeigt werden, dass T-Zellen aus Mäusen, welche defizient für IL-2 oder den hochaffinen IL-2 Rezeptor sind, durchaus proliferieren können, jedoch keine Fas-vermittelte Apoptose zeigen (PARIJS ET AL., 1997). Infolge dieser Defekte entwickeln solche Mäuse schwere Autoimmunerkrankungen, welche zum Tod der Tiere führen (WILLERFORD ET AL., 1995).
Mitlerweile wird angenommen, dass neben den erwähnten Defekten in diesen Tieren auch das Fehlen von CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen für dieses Phänomen mitverantwortlich ist (MALEK U. BAYER, 2004).
2.4.2 Aktive Toleranz-Mechanismen (Regulatorische T-Zellen)
Bei den aktiven Toleranzmechanismen werden in die Peripherie entlassene autoreaktive T-Zellen durch regulatorische T-Lymphozyten (Treg) kontrolliert (PAUST U. CANTOR, 2005;
SAITO ET AL., 2005; BEISSERT ET AL., 2006). Unter den CD4+ regulatorischen T-Zellen
werden natürlich vorkommende CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen und induzierbare regulatorische T-Zellen, die sich aus peripheren T-Zellen entwickeln, unterschieden.
Im Wesentlichen lassen sich diese beiden Typen regulatorischer T-Zellen durch Ihren Entstehungsort (Thymus oder Peripherie) und ihre Suppressionsmechanismen unterscheiden.
2.4.3 Induzierbare regulatorische T-Zellen
Zu den induzierbaren Tregs gehören neben CD4 positiven Th3- und Tr1-Lymphozyten auch verschiedene CD4 negative Subpopulationen (u.a. CD8+, TZR+CD4-CD8- und NK T-Zellen) (ZHANG ET AL., 2000; ZHOU ET AL., 2001; SEINO ET AL., 2001; GILLIET U. LIU, 2002).
Die Th3- und Tr1-Lymphozyten entstehen im Gegensatz zu den natürlich vorkommenden Tregs ausschließlich in der Peripherie und vermitteln ihre suppressiven Eigenschaften primär über lösliche Faktoren. Tr1-Lymphozyten werden aus naiven T-Zellen bei Antigenexposition und IL-10 Kostimulation gebildet (RONCAROLO ET AL., 2006). Sie supprimieren T-Zell-Proliferation durch die Sekretion von IL-10 (BACCHETTA ET AL., 1994; LEVINGS ET AL., 2001; BARRAT ET AL., 2002; VELDMAN ET AL., 2004). Th3-Lymphozyten entstehen aus naiven T-Zellen nach Antigenpräsentation durch dendritische Zellen aus der Milz (EVERSON ET AL., 1997). Ihre Suppressoraktivität ist über die Sekretion von TGF-βebenfalls zytokinvermittelt (WEINER, 2001; CHEN ET AL., 1994).
Da die CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen Gegenstand dieser Arbeit waren, sollen nur diese Zellen im Folgenden eingehender beschrieben werden.
2.4.4 Natürlich vorkommende CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen
2.4.4.1 Entdeckung von Suppressor T-Zellen
Die erste Beschreibung von Suppressor T-Zellen erfolgte durch Nishizuka et al. im Jahre 1969.
In seinen Experimenten entwickelten Mäuse, die an Tag drei nach der Geburt thymektomiert wurden, verschiedenste Autoimmunerkrankungen. Diese Autoimmunerkrankungen traten nicht auf, wenn den Mäusen der Thymus schon vor dem zweiten Tag oder später als sieben Tage nach der Geburt entfernt wurde. Die Autoimmunerkrankungen thymektomierter Tiere konnten durch einen Transfer von Milzzellen oder reifen Thymozyten aus adulten Mäusen, spätestens zwei Wochen nach Thymektomie, verhindert werden (NISHIZUKA U. SAKAKURA, 1969). Damit wurde der Grundstein für die Idee einer im Thymus entstehenden, natürlich vorkommenden Population von Suppressor T-Zellen gelegt. Bereits ein Jahr später beschrieben Gershon und Kondo eine Subpopulation von T-Zellen, welche in der Lage war, neben B-Zellen und Antigenpräsentierenden Zellen, auch T-Zellen in ihrer Aktivierung zu supprimieren (GERSHON
U. KONDO, 1970, 1971). Nach dieser Publikation folgte in den 1970er und 1980er Jahren eine Flut von Publikationen über Suppressor T-Zellen (MURPHY ET AL., 1976; RICH U. DAVID, 1979; OKUDA ET AL., 1981; KIM ET AL., 1980).
Neben der biologischen Funktion dieser T-Zellen wurde auch ein zellkontakt-unabhängiger, auf löslichen Faktoren basierender Wirkmechanismus publiziert. Die meisten dieser löslichen suppressiven Faktoren enthielten Determinanten, welche durch eine damals postulierte I-J Region des MHC codiert wurden. Nachdem jedoch durch Klonierung des MHC die Existenz eines solchen I-J Locus ausgeschlossen werden konnte (KRONENBERG ET AL., 1983), wurde die gesamte Theorie der Suppressor T-Zellen fallen gelassen. Die Idee geriet so stark in Misskredit, dass viele Wissenschaftler den Terminus ’Suppressor T-Zellen’ nicht mehr verwendeten (MÖLLER, 1988; GREEN U. WEBB, 1993). Die bis dato gewonnenen, nicht widerlegten Daten wurden im Wesentlichen als sekundäre Effekte der Th1/Th2 Kreuz-Regulation interpretiert.
Erst Mitte der 1990er Jahre erweckte ein von SAKAGUCHI ET AL. (1995) publiziertes Experiment erneutes Interesse an Suppressor T-Zellen. Er konnte zeigen, dass das suppressive Potential in einem naiven Tier sich auf diejenigen CD4+ T-Zellen beschränken lässt, welche auch die α-Kette des IL-2-Rezeptors (CD25) auf ihrer Oberfläche exprimieren.
Diese als CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen bezeichneten Suppressorzellen stellen in einem naiven Tier ca. 5-10% der peripheren CD4+ T-Zellen. Ihr suppressives Potential konnte in einem adoptiven T-Zell-Transfermodell gezeigt werden. In diesem Modell wurden Autoimmunerkrankungen durch Transfer von CD4+CD25- T-Zellen in eine T-Zell-lose Maus induziert, die alleine durch den Kotransfer von CD4+CD25+ T-Zellen verhindert werden konnten. Dass diese CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen im Thymus entstehen (SHEVACH, 2002; ITOH ET AL., 1999; SEDDON U. MASON, 2000) und eine eigenständige Subpopulation von T-Zellen darstellen, zeigte die Wiederholung der von NISHIZUKA U. SAKAKURA (1969) durchgeführten Experimente an drei Tage alten thymektomierten Mäusen. Alleine der Transfer von CD4+CD25+ T-Zellen aus erwachsenen Mäusen verhinderte bei diesen Tieren die Entstehung von schweren Autoimmunerkrankungen (ASANO ET AL., 1996).
2.4.4.2 Thymusentstehung von CD4+CD25+ T-Zellen
Neben den oben erwähnten Versuchen von ASANO ET AL. (1996) stützen noch weitere Publikationen die Entstehung von CD4+CD25+Tregs im Thymus. ITOH ET AL. (1999) isolierte CD4+CD25+ Thymozyten mit einem sehr ähnlichen Phänotyp wie CD4+CD25+Tregs aus dem peripheren Blut. Sowohl CD4+CD25+Tregs in der Peripherie als auch CD4+CD25+
Thymozyten exprimieren neben CD25 die gleichen Oberflächenmoleküle, wie z.B. CTLA-4
oder GITR (MCHUGH ET AL., 2002; SHIMIZU ET AL., 2002). Sie erscheinen anerg und sind im Stande, in vitro sowohl die Proliferation von CD4+ als auch CD8+ T-Zellen zu supprimieren.
Depletion von CD4+CD25+ Thymozyten und der Transfer von CD4+CD25- Thymozyten in eine T-Zell-lose Maus führt analog zu dem von SAKAGUCHI ET AL. (1995) publizierten Experiment, zur Entstehung schwerer Autoimmunerkrankungen (ITOH ET AL., 1999).
Durch Interaktion mit Selbstantigen werden Thymozyten mit autoreaktiven T-Zell-Rezeptoren während der T-Zellreifung zu CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen transformiert (PICCA ET AL., 2006). Welche Signale im Thymus jedoch darüber entscheiden, ob ein T-Zell-Vorläufer sich zu einer regulatorischen oder reaktiven T-Zelle entwickelt, sind weitestgehend unbekannt.
Mäuse deren T-Zellen einen transgenen TZR exprimieren, der mit intermediärer Avidität ein im Thymus exprimiertes Autoantigen erkennt, zeigten zwar einen hohen Anteil an negativ selektierten T-Zell-Vorläufern, gleichzeitig stieg jedoch die Zahl der regulatorischen T-Zellen exponentiell an (JORDAN ET AL., 2001; KAWAHATA ET AL., 2002). Es wird heute angenommen, dass die CD4+CD25+ Tregs während ihrer Entwicklung im Thymus Alloantigen mit intermediärer Avidität erkennen, dies jedoch nicht zu ihrer Depletion führt.
Ob CD4+CD25+ Tregs aus einer spezifischen T-Vorläufer-Zelle entstehen, oder ob sich jeder Thymozyt potenziell zu einer CD4+CD25+Treg entwickeln kann, ist noch ungeklärt. Die Tatsache, dass CD4+CD25+Tregs ein genauso diverses TZR-Repertoire wie reaktive CD4+
T-Zellen besitzen, stützt eher die Theorie einer spezifischen Treg-Vorläuferzelle (HORI ET AL., 2002; SEDDON U. MASON, 1999; TAGUCHI U. NISHIZUKA, 1987; TAGUCHI ET AL., 1994;
GARZA ET AL., 2000).
Auch konnte bisher nicht befriedigend beantwortet werden, ob bei der Entstehung von CD4+CD25+ Tregs neben der intermediären Avidität ihrer TZR gegen Alloantigen noch weitere Signale eine Rolle spielen. Neuere Studien zeigen eine Beteiligung von akzessorische Molekülen. Versuche mit CD28 Knock-out Mäusen und die Blockade von CD28 durch CTLA-4-Immunglobulin zeigten, dass Interaktionen zwischen CD28 und B7 eine entscheidende Rolle bei der Entstehung im Thymus und/oder der Homeostase von CD4+CD25+Tregs in der Peripherie spielen (TANG ET AL., 2003; SALOMON ET AL., 2000). CD25- (IL-2 Rezeptor α-Kette), CD122- (IL-2 Rezeptorβ-Kette) und IL-2-Knock-out Mäuse sowie die Neutralisation von IL-2 durch Antikörper resultierte in schweren Autoimmunerkrankungen, die durch den adoptiven Transfer von CD4+CD25+Tregs verhindert werden konnten (MALEK ET AL., 2002; ALMEIDA ET AL., 2002; PAPIERNIK ET AL., 1998).
Durch diese Studien wurde auch die wichtige Bedeutung von IL-2 für die Entwicklung bzw.
Funktion von CD4+CD25+Tregs nachgewiesen.
2.4.4.3 Periphere Entstehung von CD4+CD25+ T-Zellen
Obwohl heutzutage die zentrale Entstehung von CD4+CD25+Tregs im Thymus als sicher gilt, wird bezweifelt, dass dies der einzige Weg ihrer Entstehung ist. Im Rahmen der altersbedingten Thymusinvolution sinkt auch die Zahl an thymusgenerierten Lymphozyten. Daher müßte bei einer ausschließlichen zentralen Entstehung die Zahl an CD4+CD25+Tregs mit der Zeit abnehmen (AKBAR ET AL., 2003). Dies ist jedoch nicht der Fall, es ist sogar ein altersbedingter Anstieg dieser Zellpopulation zu beobachten (GREGG ET AL., 2005). Neuere in vivo (WALKER ET AL., 2003) und vitro (YAMAZAKI ET AL., 2003) Experimente zeigen, dass eine Proliferation von CD4+CD25+Tregs trotz ihres anergen Phänotyps möglich ist. Diese Proliferation ist jedoch von der Anwesenheit von Cytokinen wie IL-2 abhängig, welche nicht von den Tregs selbst produziert werden. Neben dieser direkten Expansion von CD4+CD25+Treg besteht außerdem die Möglichkeit der Neuentstehung aus CD4+ T-Zellen nach Antigenpräsentation durch nichtprofessionelle Antigenpräsentierende Zellen, wie beispielsweise aktivierte T-Zellen (AKBAR ET AL., 2003). Bei der direkten Antigenpräsentation von T-Zelle zu T-Zelle, in der Abwesenheit von professionellen antigenpräsentierenden Zellen mit adäquater Kostimulation, nehmen die T-Zellen einen regulatorischen Phänotyp an (LOMBARDI ET AL., 1994; TAAMS ET AL., 1998, 1999).
2.4.4.4 Immunologischer Phänotyp der regulatorischen T-Zelle
Bei den natürlich vorkommenden Tregs handelt es sich um eine Subpopulation der CD4+
T-Zellen, die das Antigen CD25 (α-Kette des IL-2-Rezeptors) koexprimiert (SAKAGUCHI ET AL., 1995). Im Rahmen der T-Zellaktivierung steigt durch die Expression derα-Kette die Affinität des Rezeptors für IL-2 deutlich an (SAITO U. HONJO, 1990; SUGAMURA, 1994).
Daher wurde CD25 lange Zeit hauptsächlich als Marker für aktivierte T-Zellen angesehen.
Da bis heute für CD4+CD25+Tregs kein spezifisches Oberflächenmolekül beschrieben wurde und auch aktivierte CD4+ T-Zellen CD25 exprimieren, können diese Zellen nur durch ihre funktionellen Eigenschaften charakterisiert werden. Die charakteristische Eigenschaft dieser Zellen ist, dass sie in vitro nach Stimulation über ihren TZR weder IL-2 produzieren noch proliferieren (SHEVACH, 2002; SU ET AL., 2004). Sie sind jedoch in der Lage antigenunabhängig aber zellkontaktabhängig sowohl die Proliferation als auch die Cytokinproduktion von aktivierten CD4+ und CD8+ T-Zellen zu supprimieren (TAKAHASHI ET AL., 1998; SHEVACH ET AL., 2001; THORNTON U. SHEVACH, 2000; PICCIRILLO U. SHEVACH, 2001). Bei menschlichen Lymphozyten wird von den CD4+CD25low+ Tregs mit schwacher CD25 Expression zusätzlich eine CD4+CD25high+ T-Zellsubpopulation mit starker CD25 Expression und ausgeprägter Suppressorfunktion abgegrenzt (BAECHER-ALLAN
ET AL., 2001).
Obwohl in gesunden, nicht-immunisierten Tieren CD25 immer noch ein sehr guter Marker für CD4+CD25+Tregs ist, bleibt eines der größten Probleme bei der Erforschung dieser Zellen die genaue Identifizierung durch Moleküle, welche exklusiv auf ihrer Zelloberfläche exprimiert werden. Zwar wurden neben CD25 verschiedene Oberflächenmoleküle, wie GITR (MCHUGH ET AL., 2002; SHIMIZU ET AL., 2002) oder CTLA-4 (SAKAGUCHI, 2004) mit CD4+CD25+Tregs assoziiert, jedoch findet man diese Moleküle auch auf verschiedenen Aktivierungs-, Differenzierungs- und Entwicklungsstadien von reaktiven CD4+ T-Zellen (VALZASINA ET AL., 2005; TAKEDA ET AL., 2004; MCHUGH ET AL., 2002; SHIMIZU ET AL., 2002; HUANG ET AL., 2004; ERMANN ET AL., 2005; READ ET AL., 1998; SINGH ET AL., 2001; HERBELIN ET AL., 1998; GONZALEZ ET AL., 2001; GAVIN ET AL., 2002; BRUDER ET AL., 2004).
Der forkhead/winged helix transciption Factor (Foxp3) wird, verglichen mit anderen CD4+ T-Zellen, sehr stark von CD4+CD25+Tregs exprimiert (HORI ET AL., 2003;
FONTENOT ET AL., 2003). Mäuse, welche eine natürlich auftretende Mutation im Foxp3-Gen tragen (scurfy-Maus), entwickeln schwere Autoimmunerkrankungen, die sogar verheerender verlaufen, als nach Depletion von CD4+CD25+Tregs in naiven Mäusen (BRUNKOW ET AL., 2001). Das entsprechende Krankheitsbild beim Menschen wird IPEX-Syndrom (immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome) genannt und führt, genau wie bei der scurfy-Maus, zum raschen Tod Neugeborener (WILDIN ET AL., 2002; LYON ET AL., 1990; BLAIR ET AL., 1994; GODFREY ET AL., 1991). CD4+ T-Zellen aus scurfy-Mäusen zeigen eine Hyperresponsivität auf TZR-Stimulus, benötigen zu ihrer Aktivierung keine kostimulatorischen Signale und produzieren nach Aktivierung sehr große Mengen an IL-2 und anderen Cytokinen (SCHUBERT ET AL., 2001). Zwar zeigt die scurfy-Maus eine stark erhöhte Zahl CD4+CD25+ T-Zellen, es wird jedoch angenommen, dass es sich hierbei um aktivierte CD4+ T-Zellen handelt.
Kürzlich konnte gezeigt werden, dass CD4+ T-Zellen nach Transduktion mit Foxp3 sowohl den anergen Phänotyp als auch die bisher beschriebenen Oberflächenmolekülen von CD4+CD25+Tregs sowie regulatorische Eigenschaften in vitro und in vivo zeigen (KHATTRI ET AL., 2003; FONTENOT ET AL., 2003). Somit scheint Foxp3 ein wichtiger molekularer Schalter für die Entwicklung und Funktion von CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen zu sein.
2.4.4.5 Mechanismen der Suppression
Die Bestimmung des Mechanismus der supprimierenden Wirkung führt bei in vitro und in vivo Untersuchungen zu unterschiedlichen Ergebnissen. In vitro zeigen die Tregs eine Zellkontakt
abhängige, jedoch weitgehend Zytokin unabhängige Hemmung (TAKAHASHI ET AL., 1998;
SURI-PAYER U. CANTOR, 2001; PICCIRILLO ET AL., 2002). So konnte gezeigt werden, dass in vitro TGF-β nicht an der kontaktabhängigen Suppression von CD4+ T-Zellen durch CD4+CD25+ Tregs beteiligt ist (PICCIRILLO ET AL., 2002). TAKAHASHI ET AL. (2000) und SHIMIZU ET AL. (2002) vermuten eine Hemmung durch die Oberflächenmoleküle CTLA-4 und GITR. Die Rolle des immunsuppressiven Cytokins TGF-β wurde lange Zeit kontrovers diskutiert. Bei in vivo Versuchen führt sowohl die Blockade von IL-10 als auch TGF-β zu einem Verlust der Suppressorfunktion (JOSIEN ET AL., 1998; HARA ET AL., 2001), wodurch eine Beteiligung von Zytokinen nicht vollständig ausgeschlossen werden kann. Neueste Arbeiten konnten in einem Colitis-Transfermodell zeigen, das TGF-βzwar entscheidend an der Hemmung colitogener Effektor-T-Zellen beteiligt ist, dieses jedoch nicht durch CD4+CD25+
Tregs produziert wird (FAHLÉN ET AL., 2005). Weiterhin konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass CD4+CD25+ Tregs aus TGF-β-defizienten Mäusen mit CD4+CD25+ Tregs aus Wildtyp Mäusen vergleichbare suppressive Eigenschaften besitzen, so dass eine Rolle von TGF-βbei der CD4+CD25+ Treg-vermittelten Suppression in vitro und in vivo ausgeschlossen werden kann. Nichts desto trotz ist TGF-βein entscheidendes immunmodulatorisches Cytokin, welches neben seinen direkten immunsuppressiven Eigenschaften eine wichtige Rolle bei der Entstehung und Funktion von Tr1- und Th3-Zellen einnimmt (RONCAROLO ET AL., 2001;
WEINER, 2001).
Nach einer spezifischen T-Zell-Rezeptor vermittelten Aktivierung scheint die Suppression eher antigenunspezifisch zu sein (THORNTON U. SHEVACH, 2000). Obwohl die Grundlage des suppressiven Mechanismus bis heute nicht verstanden ist, scheint einer der wichtigsten Prozesse die Hemmung der endogenen IL-2 Produktion in aktivierten T-Zellen zu sein (THORNTON U. SHEVACH, 1998; MALEK U. BAYER, 2004; THORNTON ET AL., 2004a,b). Im Einklang mit diesen Ergebnissen steht, dass alle bisher beschriebenen Mechanismen zur Durchbrechung der CD4+CD25+Treg vermittelten Suppression z.B. durch Kostimulation über CD28 oder GITR, in aktivierten T-Zellen eine starke IL-2 Produktion induzieren (THORNTON U. SHEVACH, 1998;
STEPHENS ET AL., 2004; BIN JI ET AL., 2004; ZHENG ET AL., 2004; TAKEDA ET AL., 2004; VALZASINA ET AL., 2005). Daneben scheint neueren Studien zufolge IL-2 auch für die Homeostase von CD4+CD25+Tregs in der Peripherie essentiell zu sein (FONTENOT ET AL., 2005).
2.4.5 Interaktion zwischen regulatorischen T-Zellen
Zahlreiche Studien vermuten eine Interaktion zwischen natürlich vorkommenden und induzierten Tregs. CHEN ET AL. (2003) gelang es die TGF-β induzierte Entstehung von
CD4+CD25+ Tregs mit Foxp3 Expression aus CD4+CD25- T-Zellen nachzuweisen. Andere Untersuchungen fanden eine Beteiligung von CD4+CD25+ T-Zellen bei der Entstehung von Tr1-Tregs aus Effektor-T-Zellen (JONULEIT ET AL., 2002; DIECKMANN ET AL., 2002).
Zahlreiche in vivo (TAGUCHI ET AL., 1994; ASANO ET AL., 1996; CHEN ET AL., 1996; HALL ET AL., 1998; THORSTENSON U. KHORUTS, 2001; ZHANG ET AL., 2001) und in vitro Studien (JONULEIT ET AL., 2000; GREGORI ET AL., 2001) lassen auch auf eine periphere Entstehung von CD4+CD25+ Tregs schließen. Durch T-Zell-Rezeptor Stimulation ohne Kostimulation oder Antigenpräsentation der T-Zellen untereinander können antigenspezifische CD4+CD25- T-Zellen in einen anergischen Zustand überführt werden (LAMB ET AL., 1983; LOMBARDI ET AL., 1994, 1996). Ihr Phänotyp ist identisch mit dem natürlich vorkommender CD4+CD25+
Tregs (AKBAR ET AL., 2003). Sobald sich die T-Zelle in diesem anergischen Zustand befindet, erlangt sie die Fähigkeit T-Zellproliferation zu hemmen (LOMBARDI ET AL., 1994; TAAMS ET AL., 1998; LOMBARDI ET AL., 2000; TAAMS ET AL., 2002). Der genaue Mechanismus dieser Interaktionen ist jedoch noch ungeklärt.
2.5 Toleranzinduktion
2.5.1 Induktion zentraler Toleranz
Die Induktion zentraler Toleranz zielt darauf ab, einen stabilen hämatopoetischen Chimärismus, also eine dauerhafte Koexistenz lymphatischer und myeloider Zellen von Spender und Empfänger, zu erzeugen. Dies ist möglich durch eine prä- oder perioperative Knochenmarkstransplantation. Die transplantierten Stammzellen proliferieren im Knochenmark, wandern in den Thymus des Empfängers ein und besiedeln ihn schließlich gleichermaßen mit den Empfängerzellen. So weitet sich die negative Selektion autoreaktiver Zellen im Thymus auch auf die gegen Spendergewebe gerichteten Lymphozyten aus (NIKOLIC U. SYKES, 1997). Um eine Immunreaktion des Empfängerorganismus gegen die transplantierten Knochenmarkzellen zu verhindern, bedarf es einer aggressiven Konditionierung. Durch Bestrahlung oder knochenmarkssuppressive Medikation im Vorfeld der Übertragung lässt sich die Menge sowie die Potenz der immunkompetenten Zellen reduzieren (BLAHA ET AL., 2005). Bei der Lungentransplantation in Ratten wird ein stabiler Spenderzellchimärismus induziert, indem man die Empfängertiere hochdosiert bestrahlt und ihr Knochenmark mit einem Gemisch aus Spender- und Empfängerstammzellen wiederbesiedelt.
Die Tiere entwickeln eine spenderspezifische Organtoleranz bei erhaltener Fähigkeit zur Abstoßung von Dritttransplantaten (PHAM ET AL., 1999).
2.5.2 Induktion peripherer Toleranz
Die Induktion peripherer Toleranz hat zum Ziel, die Abstoßung durch die Generierung oder Übertragung von regulatorischen T-Zellen zu verhindern. Als erfolgreich haben sich bisher in Nagermodellen die Gabe von Antigen, die Blockade von Korezeptoren und/oder Kostimulatoren, sowie der Transfer von Treg erwiesen.
Eine periphere Induktion von CD4+CD25+Treg gelingt in Mäusen durch die orale, subkutane oder intravenöse einmalige (THORSTENSON U. KHORUTS, 2001; PICCIRILLO ET AL., 2002;
APOSTOLOU U. VON BOEHMER, 2004) oder wiederholte (ZHENG ET AL., 2002; CHEN ET AL., 2003; DUTHOIT ET AL., 2004) Gabe von Antigen. Hierbei werden vermutlich alloreaktive T-Zellen durch das inadäquat präsentierte Antigen inaktiviert und möglicherweise zur regulatorischen T-Zellen transformiert.
Die Induktion einer Transplantattoleranz gelingt auch über eine Korezeptorblockade durch eine Behandlung mit monoklonalen Antikörpern wie CD4 (ARIMA ET AL., 1997), CD8 (WALDMANN ET AL., 2006) und CD25 (LI ET AL., 2006; KREIJVELD ET AL., 2007) oder eine Blockade von kostimulierenden Molekülen wie CD28 (GUO ET AL., 2003), CD40L (CD154) (WALDMANN ET AL., 2006; BANUELOS ET AL., 2004), CD80 und CD86 (BÎRSAN ET AL., 2003). Durch diese Blockade fehlt bei der Antigenerkennung das kostimulierende Signal und die T-Zelle wird anergisch oder bildet sogar einen regulatorischen Phänotyp aus. Im Rahmen der normalen T-Zell-Reifung inaktiviert das Immunsystem durch diesem Mechanismus autoreaktive T-Zellen und sichert die Toleranz gegenüber körpereigenem Gewebe.
Bei der Übertragung von regulatorischen CD4+CD25+ Lymphozyten wird die entstehende Toleranz (CHAI ET AL., 2005; ALBERT ET AL., 2006; JIANG ET AL., 2003; JIANG U. LECHLER, 2003) nicht ausschließlich durch die transferierten Treg aufechterhalten. Vielmehr induzierten die transferierten Zellen die Bildung von eigenen regulatorischen T-Zellen, was als infektiöse Toleranz bezeichnet wird (QIN ET AL., 1993; COBBOLD ET AL., 2003a). Die Mechanismen durch die diese induzierten Treg eine Transplantattoleranz aufrechterhalten sind noch weitestgehend unverstanden und werden in 2.4.4.5 näher ausgeführt.
Obwohl bisher die Etablierung von klinisch übertragbaren Großtiermodelle zur Induktion einer peripheren Toleranz nicht gelungen ist, läßt insbesondere der erfolgreiche Einsatz von Anti-CD25 Antikörpern (Basiliximab und Daclizumab) bei der Behandlung von akuten Abstoßungsreaktionen in der klinischen Transplantationsmedizin (BORRO ET AL., 2005;DE LA
TORRE ET AL., 2005; HUANG ET AL., 2006; LISCHKE ET AL., 2007) auf die Entwicklung erfolgreicher Protokolle hoffen.
