Aus der Klinik
Hämatologie, Hämostaseologie , Onkologie und Stammzelltransplanation
Direktor: Prof. Dr. med. Arnold Ganser Zentrum Innere Medizin Medizinische Hochschule Hannover
Untersuchungen zum Potential von G-CSF für die in vitro Induktion regulatorischer T-Zellen
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin an der medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Stefanie Schulze Lammers
aus Köln Hannover 2013
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 15.07.2014 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. med. Christopher Baum Betreuer: Prof.'in Dr. med. Anke Franzke
Referent: Prof.'in Dr. phil. nat. Dr. med. Ulrike Köhl Korreferent: Prof. Dr. med. Karl Welte
Tag der mündlichen Prüfung: 15.07.2014 Prüfungsausschussmitglieder:
Prof. Dr. med. Reinhold Ernst Schmidt Prof. Dr. med. Anke Schwarz
Prof. Dr. med. Bettina Wedi
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 4
2 Originalarbeit: „ Characterization of Granulocyte colony stimulating factor for in vitro induction of regulatory T cells for cellular immune intervention in transplant medicine“ Stefanie Schulze Lammers, Sya N. Ukena, Sarvari Velaga, Anke Franzke Experimental and Clinical Transplantation 2013; 2: 169-175 ... 6
3 Diskussion ... 14
4 Zusammenfassung und Ausblick ... 17
5 Literaturverzeichnis ... 18
6 Danksagung ... 19
7 Lebenslauf ... 20
8 Erklärung ... 22
Einleitung -4-
1 Einleitung
G-CSF ist als ein Zytokin identifiziert worden, das die Proliferation normaler Granulozyten- Kolonien und die Reifung leukämischer Zelllinien induziert.1,2,3 Rekombinantes menschliches G-CSF (rhG-CSF) findet seit mehr als 20 Jahren in der Behandlung von Neutropenien nach Bestrahlung und Chemotherapie in der Klinik Verwendung. Darüber hinaus hat sich rhG-CSF bei der Mobilisierung peripherer hämatopoetischer Vorläuferzellen von gesunden Spendern bewährt und wird weltweit in der hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT) eingesetzt.4,5
Es gibt immer mehr Hinweise, dass G-CSF nicht nur einen erheblichen Einfluss auf die Hämatopoese und das angeborene Immunsystem hat, sondern auch vielfältige Effekte auf adaptive Immunreaktionen ausübt. Die Proliferation von T-Zellen nach allogener und mitogener Stimulation ist bei Patienten6 und gesunden Stammzellenspendern7, die mit rhG- CSF behandelt wurden, reduziert. Es wird vermutet, dass der Effekt durch lösliche Faktoren8,9, indirekte Modulation der Monozytenfunktion7,10 oder durch Hemmung ko- stimulatorischer Signalwege11 vermittelt wird. Weiterführende Untersuchungen haben gezeigt, dass G-CSF über die funktionelle Expression des G-CSF-Rezeptors auf T- Lymphozyten12 und einer Induktion von Interleukin 4 (IL4) in vitro und in vivo eine Verschiebung in Richtung einer sogenannten Th2-Immunreaktion hervorruft. Darüber hinaus haben verschiedene Arbeitsgruppen festgestellt, dass es nach alloantigener oder mitogener Stimulation bei Kostimulation mit G-CSF zu einer erhöhten Produktion von IL1013,14, IL415,16,17, und Tumor Growth Factor (TGF-β)18 sowie zu einer verminderten Sekretion von Interferon-gamme (IFN-γ) und IL215,17,19,20 kommt. Die meisten dieser Daten sprechen für einen indirekten G-CSF-Effekt auf den T-Zell-Phänotyp, der über Monozyten und dendritische Zellen vermittelt wird. In einer Studie von Rutella und Kollegen konnte gezeigt werden, dass G-CSF CD4+-T-Zellen mit einem regulatorischen Phänotyp induziert, die in der Peripherie gesunder Spender große Mengen IL10 und in einem geringerem Umfang TGF-β produzieren.14 Diese Untergruppe von sogenannten regulatorischen T-Zellen (Tr1-Zellen) könnten aus CD4+CD25--T-Zellen21 in der Gegenwart von IL10 konvertieren und inflammatorische Immunreaktionen22, wie zum Beispiel die Graft-versus-Host-Erkrankung, unterdrücken. Bei der Graft-versus-Host-Erkrankung handelt es sich um eine lebensbedrohliche Immunantwort nach allogener HSCT, die von den T-Zellen des Spenders ausgelöst wird und zur entzündlichen und destruktiven Veränderung der beteiligten Organe wie Haut, Leber und Gastrointestinaltrakt führen kann.
Einleitung -5- Experimentelle Daten und klinische Versuche haben gezeigt, dass sogenannte regulatorische T-Zellen (Tregs) die Graft-versus-Host-Erkrankungunterdrücken können23,24,25, während der vorteilhafte Graft-versus-Leukemia-Effekt erhalten bleibt.26,27 Tregs zeichnen sich daraus aus, dass sie die Proliferation von Effektor T-Zellen supprimieren und damit Immunantworten balancieren können. Die spezifischen Immunzellen spielen ebenfalls bei der Suppression von Immunreaktionen im Rahmen von Autoimmunität, Organtransplantationen und Infektionskrankheiten eine entscheidende Rolle. Deshalb wird die therapeutische Anwendung von Tregs bei der Unterdrückung unerwünschter Immunreaktionen untersucht.28 Eine erhebliche Einschränkung für eine breite klinische Anwendung des Zelltransfers adoptiver regulatorischer T-Zellen ist deren geringe Zellzahl im peripheren Blut gesunder Spender.
Darum ist die Entwicklung von Expansionsprotokollen für humane Tregs im großen Maßstab Zentrum des Interesses der klinischen Forschung. Im Kontext der klinischen Entwicklungen von zellbasierten Therapien und in Bezug auf bisherige Forschungsergebnisse stellt sich die Frage, ob G-CSF direkt die Umwandlung naiver T-Zellen in regulatorische T-Zellen induzieren kann. Eine direkte in vitro Induktion von Tregs durch G-CSF könnte für die Entwicklung neuartiger Strategien genutzt werden und die quantitative Limitation von Tregs überwinden. Daher wurden im Rahmen dieser Dissertationsarbeit das Potential von G-CSF für die in vitro Induktion von Tregs untersucht, indem Markermoleküle regulatorischer T- Zellen auf Genexpressions- und Proteinebene untersucht wurden (siehe bitte Angaben zu Material und Methoden sowie Ergebnisse in der Originalarbeit).
Originalarbeit -6-
2 Originalarbeit
ARTICLE
Characterization of Granulocyte Colony Stimulating Factor for In Vitro Induction of Regulatory T Cells for Cellular
Immune Intervention in Transplant Medicine
Abstract
Objectives:The application of regulatory T cells in the field of solid-organ and hematopoietic stem cell transplantation is under investigation to develop novel cellular strategies for tolerance induction.
Establishing in vitro procedures to induce and expand regulatory T cells seeks to overcome the limiting small number of this rare T cell population.
The present study is based on growing evidence that granulocyte colony stimulating factor exerts immune regulatory function in the adaptive immune system and may induce regulatory T cells in vivo.
Materials and Methods:We analyzed the effect of recombinant granulocyte colony stimulating factor to directly convert CD4+CD25-T cells into regulatory T cells in vitro. Marker molecules were analyzed by quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction and fluorescent-activated cell sorter analyses. Functional assays were performed to investigate the suppressive capacity of granulocyte colony stimulating factor stimulated T cells.
Results:Kinetic analyses of Foxp3 gene expression uncovered increased levels early after in vitro stimulation with granulocyte colony stimulating factor. However, protein analyses for the master transcription factor Foxp3 and other regulatory
T cells revealed that granulocyte colony stimulating factor did not directly induce a regulatory T cell phenotype. Moreover, functional analyses demonstrated that granulocyte colony stimulating factor stimulation in vitro does not result in a suppressive, immune regulatory T cell population.
Conclusions:Granulocyte colony stimulating factor does not induce regulatory T cells with a specific phenotype and suppressive potency in vitro.
Therefore, granulocyte colony stimulating factor does not qualify for developing protocols aimed at higher regulatory T cell numbers for adoptive transfer strategies in solid organ and hematopoietic stem cell transplantation.
Key words: T cells, G-CSF, Foxp3, Regulatory T cells, Clinical trials
Introduction
Granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) has been identified as a cytokine that induces proliferation of normal granulocyte colonies and maturation of leukemic cell lines.1-3 Recombinant human G-CSF (rhG-CSF) has been in clinical use for more than 20 years to reduce neutropenia after radiation and chemotherapy. Furthermore, rhG-CSF is approved for mobilizing peripheral blood progenitor cells from healthy donors and is used worldwide in hematopoietic stem cell transplantation.4,5
Growing evidence exists that G-CSF not only acts as a master regulator of hematopoiesis and the innate immune system, but also exerts pleiotropic effects on adaptive immune responses. In patients6and healthy stem cell donors7 treated with rhG-CSF, the proliferative response of T cells to allogeneic and mitogenic stimulation is reduced. This effect is
Stefanie Schulze Lammers, Sya N. Ukena, Sarvari Velaga, Anke Franzke
DOI: 10.6002/ect.2012.0187 Copyright © Başkent University 2013
Printed in Turkey. All Rights Reserved.
From the Hannover Medical School, Department of Hematology, Hemostasis, Oncology and Stem Cell Transplantation, Carl-Neuberg-Strasse 1, 30625 Hannover
Acknowledgements:This work was supported by a grant from the German Federal Ministry of Education and Research (reference number: 01EO0802). The author(s) declare having no competing interests.
Corresponding author:Anke Franzke MD, Hannover Medical School, Department of Hematology, Hemostasis, Oncology and Stem Cell Transplantation, Carl-Neuberg-Strasse 1, 30625 Hannover, Germany
Phone:+49 511 532 3202 Fax:+49 511 532 8205 E-mail:franzke.anke@mh-hannover.de Experimental and Clinical Transplantation (2013) 2: 169-175
thought to be mediated by soluble factors,8,9indirect modulation of monocyte function,7,10or inhibition of costimulatory signaling pathways.11 Further investigations by our group have shown that G-CSF provokes a shift toward Th2 immune response via the functional expression of the G-CSF receptor on T lymphocytes,12with an induction of IL4 secretion in vitro and in vivo. Others have identified increases in IL10,13,14 IL4,15-17 TGF 18 production, and decreases in IFN-and IL215,17,19,20on alloantigenic or mitogenic stimulation. Most of these data argue for an indirect effect of G-CSF on the T-cell phenotype via monocytes and dendritic cells. Rutella and associates have shown that G-CSF induces CD4+ T cells with a regulatory phenotype producing high amounts of IL10, and to a lesser extent, TGF-in the periphery of healthy human recipients.14 These regulatory T cells (Tr1 cells) might convert from CD4+CD25- T cells21 in the presence of IL10 and suppress inflammatory immune responses22 like graft-versus-host disease.
Experimental data and clinical trials have shown the potency of regulatory T cells to suppress graft- versus-host disease23-25 while preserving the beneficial graft-versus-leukemia effect.26,27Notably, regulatory T cells (Tregs) also play a pivotal role in controlling immune responses in autoimmunity, solid-organ transplantation, and infectious diseases.
Therefore, the therapeutic application of Tregs to suppress unwanted immune reactions is under investigation.28A major limitation for a broad clinical application of adoptive regulatory T cells (Treg) cell transfer is the small number of Tregs in the peripheral blood of healthy donors. Therefore, establishing large-scale expansion protocols for human Tregs is in the focus of clinical research. In the context of clinical developments in cell-based therapies and with respect to formerly reported results, we addressed the question whether G-CSF may directly induce conversion of naïve T cells into regulatory T cells. The direct induction of Tregs by G-CSF may effect development of novel strategies for Treg cell induction and expansion.
Materials and Methods
Donor sampling
Heparinized blood samples (40 mL) were obtained from 28 healthy donors (17 women and 11 men;
median age 31.5 y; range 20-48 y) after gaining
written, informed consent. Approval was obtained from the ethical committee of Hannover Medical School. All protocols conformed with the ethical guidelines of the 1975 Helsinki Declaration.
Isolation of CD4+CD25- T lymphocytes and stimulation with recombinant human granulocyte colony stimulating factor
Peripheral blood mononuclear cells were freshly isolated by Ficoll gradient and CD4+CD25- T lymphocytes were negative selected using the CD4+CD25+regulatory T cell kit (Miltenyi Biotech, Germany) according to the manufacturer’s protocol.
The purity of the isolated T cell population was controlled by fluorescent-activated cell sorter analysis (> 95%). CD4+CD25- T lymphocytes were stimulated with/without 100 ng/mL rhG-CSF (Granocyte 13, Chugai Pharma, Frankfurt, Germany) on anti-CD3 and anti-CD28 antibody precoated cell culture plates (over night at 4°C with 5 g/mL) for the indicated time points. Total RNA was isolated using RNeasy Mini Kit from Qiagen (Hilden, Germany) and DNase digested according to the manufacturer’s protocol. Isolated mRNA was reversely transcribed using 200 U Superscript II (Invitrogen, Germany), oligo dT-, and random hexamer primers (Invitrogen). Polymerase chain reaction was performed using primers specific for human RPS9, Foxp3, CD127, CTLA-4, GATA3, CD39, and IL10 (primer sequences could be requested by the corresponding author). Quantitative real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) was done with the GeneAmp 5700 Sequence Detection System (Perkin Elmer, Rodgau Jügesheim, Germany) using Brilliant SYBR Green QPCR Core Reagent Kit (Stratagene, Heidelberg, Germany) as described elsewhere.29
Regulatory T cell suppression assay
To test whether G-CSF induces a suppressive phenotype CD4+CD25- T cells were prestimulated with 100 ng/mL G-CSF on anti-CD3 and anti-CD28 precoated cell culture plates for 12 hours and cultured at a ratio of 1:1 with CD4+CD25-T cells for additional 12 hours. Proliferation assays were done in triplicates in 200 L of RPMI medium that contained 10% fetal calf serum and pulsed with 1 Ci/well of [3H]-thymidine for the final 6 hours.
[3H]-Thymidine incorporation was measured by scintillation counting.
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Regulatory T cell phenotype analysis
In vitro cultured and stimulated CD4+CD25-T cells were treated for the last 4 hours of cell culture stimulation with the protein transport inhibitor Brefeldin A (final concentration 10 g/mL). Staining was performed by direct immunofluorescence with monoclonal antibodies against the antigens with following fluorochromes: CD4 PerCP, CD127 Alexa647, Foxp3 Alexa488, CD25 PeCy7, CD39 APC, CTLA4 PE, membrane bound TGFß [LAP] APC, 4-1BB APC, CD62L PE, IL10 PE, Helios PE, and CD69 APC Cy7 (BD Biosciences, Heidelberg, Germany, and BioLegend, San Diego, CA, USA). Isotype and fluorescence minus one controls were included for the respective antibodies. Fixation and permeabilization for staining with antibodies against Foxp3, Helios, CTLA4, and IL10 were done with Foxp3 buffer set (BD Biosciences). After surface staining cells were incubated with Fixation Buffer A for 15 minutes, they were washed twice. Fixed cells were permeabilized by incubating them with Buffer C for 30 minutes and stained with Foxp3, Helios, CTLA4, and IL10 antibodies. Cells were analyzed using fluorescent- activated cell sorter Canto (BD Biosciences) and FloJo software (TreeStar Inc., Ashland, OR, USA).
T cell in vitro expansion
Isolated CD4+CD25-T cells were cultured in RPMI 1640 containing GlutaMAX medium (Invitrogen, Darmstadt, Germany) supplemented with 10% fetal calf serum (Biochrom AG, Berlin, Germany) for 14 days at 37°C in 96-well U-bottom plates. To avoid contaminations, 50 g/mL gentamycin (Sigma Aldrich, Hamburg, Germany) and 50 g/mL penicillin/streptomycin (Sigma Aldrich) were added to the medium. T cells were stimulated daily with 100 ng/mL rhG-CSF (Granocyte 13, Chugai Pharma, Frankfurt, Germany) and IL-2 500 U/mL (PeproTech GmbH, Hamburg, Germany) and CD3/CD28 Dynabeads (Invitrogen, Darmstadt, Germany) in a 4:1 ratio, according to expansion protocols.30Dynabeads were changed after 7 days and removed after 11 days’
culture.
Statistical analyses
For statistical analyses, GraphPad Prism software (GraphPad software Inc, La Jolla, CA, USA) using paired or unpaired ttest was used. A Pvalue of < .05 was considered statistically significant. Error bars represent standard error of the mean.
Results
Gene expression analysis of T cells after granulocyte colony stimulating factor stimulation in vitro The following experiments were performed to determine whether G-CSF stimulation in vitro converts CD4+CD25−T cells into a Foxp3+regulatory T cell phenotype. In a kinetic study, CD4+CD25- T cells were analyzed 2, 4, 12, and 24 hours after stimulation with anti-CD3 and anti-CD28 for Foxp3 gene expression changes with and without additional G-CSF application. As demonstrated in Figure 1, in vitro stimulation of CD4+CD25- T lymphocytes led to an up-regulation of Foxp3, independent of G-CSF application. However, quantitative analysis of further Treg cell-associated gene transcripts (Figure 2) displayed a significant down-regulation of CD127 and up-regulation of CTLA-4 and CD39 in anti-CD3 and anti-CD28 stimulated naïve T cells with and without G-CSF compared with cultured counterparts without any stimulation. Up-regulation of CTLA4 is significantly more pronounced in stimulated T cells without addition of G-CSF, whereas the significant change in gene expression levels for CD127 and CD39 is not G-CSF dependent. Former results were confirmed,12 and CD4+T cells showed significantly higher mRNA expression levels for the Th2 master regulator 171
Figure 1. Foxp3 Expression in CD4+CD25-T Cells Stimulated With G-CSF In Vitro
Freshly isolated CD4+CD25-T cells from 9 healthy donors were stimulated with G-CSF for 2, 4, 12, and 24 hours. Isolated mRNAs were transcribed, reversely transcribed, and analyzed by real-time RT-PCR. White bars indicate unstimulated CD4+CD25- T cells, grey bars indicate anti-CD3/CD28 stimulated CD4+CD25-T cells, and black bars indicate CD4+CD25-T cells additionally stimulated with G-CSF. The results of real-time RT-PCRs are presented as mean values of relative mRNA expression levels to the housekeeping gene RPS9. Results of a 2-tailed unpaired ttest > .05 were regarded as not significant (ns).
GATA3 after additional G-CSF stimulation compared with anti-CD3 and anti-CD28 T cell stimulation alone. Interleukin-10 gene expression levels did not change after anti-CD3 and anti-CD28 stimulation of CD4+CD25-T cells with and without G-CSF in vitro.
Immune phenotype of T cells after granulocyte colony stimulating factor stimulation in vitro In addition, effects of G-CSF stimulation on the immune phenotype of anti-CD3 and anti-CD28 stimulated naïve T cells were studied (Figure 3) for markers associated with Treg cell differentiation/determination (CD127, Helios, Foxp3) and function (CD39, CTLA-4, IL-10, LAP), T-cell activation/costimulation (4-1BB, CD62L, CD69), and differentiation (CD45RA, CD45RO). In vitro activation with anti-CD3 and anti-CD28 stimulation led to a conversion of CD4+CD25- T cells to CD25+ T cells (data not shown). However, the additional stimulation with G-CSF did not reveal any significant changes in the expression of the analyzed phenotypic Treg and T cell markers. The stimulated T cells show signs of activation (CD69, CD62L) and express membrane bound TGFß. Less than 20% show a naïve T cell phenotype (CD45RA) whereas approximately 10% resemble a memory T cell phenotype (CD45RO). An induction of Foxp3 protein expression was not observed. Moreover, expression of other Treg cell-associated marker molecules was not affected after in vitro stimulation with and without G-CSF.
Effects of granulocyte colony stimulating factor on the proliferation of T cells
To test whether G-CSF can enhance the proliferation of T cells, long-term expansion cultures with anti-CD3 and anti-CD28 stimulation under IL2 supplementation have been performed. Cell numbers of highly purified CD4+CD25- T cells increased up to 7.5 and 9.8 fold (means, 3.0 and 3.5 fold) without and with additional G-CSF stimulation in vitro (Figure 4A; P< .05). Thus, direct G-CSF stimulation of T cells does not induce cell
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Figure 2. Characterization of In Vitro G-CSF Stimulated CD4+CD25-T Cells
Freshly isolated in vitro activated CD4+CD25-T cells from 6 healthy donors were stimulated with G-CSF for 4 hours. Isolated mRNAs were transcribed, reversely transcribed, and analyzed by real-time RT-PCR for CD127, CTLA4, CD39, GATA3, and IL10. White bars indicate unstimulated CD4+CD25-T cells, grey bars indicate anti-CD3/anti-CD28 stimulated CD4+CD25-T cells, and black bars indicate CD4+CD25-T cells additionally stimulated with G-CSF. The results of real-time RT-PCRs are presented as mean values of relative mRNA expression levels to the housekeeping gene RPS9. Results of a 2-tailed unpaired ttest > .05 were regarded as nonsignificant (ns). Pvalues < .05 (*) and < .01 (**) are regarded as significant.
Freshly isolated in vitro activated CD4+CD25-T cells from 3 healthy donors were stimulated with G-CSF and were analyzed for surface and intracellular expression of informative molecules by fluorescent-activated cell sorter.
Expression values were calculated as percentage of total CD4+T cells and are shown as mean values. Fluorescent-activated cell sorter plots presented are representative of 3 analyses.
Figure 3. Phenotype of In Vitro G-CSF Stimulated CD4+CD25-T Cells
Freshly isolated CD4+CD25-T cells from 5 healthy donors were activated in vitro with anti-CD3/anti-CD28 (bars without stripes) and additional daily stimulation with 100 ng/mL G-CSF (bars with stripes). (A)Cell numbers were counted after 7 days (white bars), 11 days (light grey bars), and 14 days (dark grey bars). Increased cell numbers are expressed as fold change. Error bars indicate standard deviation. (B)Foxp3 and CD127 protein expression after 14 days of in vitro culture analyzed by fluorescent-activated cell sorter. Expression values were calculated as percentage of total CD4+T cells. Error bars indicate standard deviation.
Figure 4. Long-term Culture of In Vitro G-CSF Stimulated CD4+CD25-T Cells
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proliferation under the described conditions. In addition, the phenotypic fluorescent-activated cell sorter analysis of CD4+T cells after 14 days of in vitro culture without and with G-CSF did not affect the expression levels of Treg cell-associated molecules Foxp3 (mean, 7.7% and 6.6% Foxp3+) and CD127 (mean, 49.3% and 44.3% CD127-) (Figure 4B).
Functional analysis of granulocyte colony stimulating factor-treated T cells
Regulatory T cells display a suppressive phenotype and show an inhibition on the proliferation of effector T cells. To test functional effects of direct G-CSF stimulation, G-CSF pretreated T cells were studied in a standard assay for their suppressive capacity. Figure 5 shows that co-incubation of G-CSF pretreated T cells with effector T cells did not lead to an inhibition on effector T-cell proliferation.
Discussion
Regulatory T cells play a pivotal role in inducing and maintaining immune tolerance. Several experimental and clinical studies have shown that adoptive transfer of donor regulatory T cells prevents graft-versus-host disease and favors
immune reconstitution after allogeneic stem cell transplants.24,26,27,31 However, this novel cellular approach for tolerance induction is limited by the availability of small Treg cell numbers and therefore, adoptive Treg cell transfer is restricted to single applications in the lymphopenic situation of allogeneic stem cell transplantation. In vitro induction and expansion of Tregs might overcome these limitations. The availability of higher Treg cell numbers would allow repetitive Treg cell infusions in stem cell transplantation or even, application in the nonlymphopenic situation of solid organ transplantation. We evaluated the potential of G-CSF for in vitro induction and expansion of Tregs.
In the present study, we evaluated the potential of G-CSF for in vitro induction and subsequent expansion of Tregs. Growing evidence indicates that G-CSF-induced effects are not limited to the myeloid lineage,4but also induce pleiotropic modulations of adaptive immune responses.32This may be reflected by the functional expression of the G-CSF receptor in other cell types like T lymphocytes.12 Most importantly, G-CSF induces alterations of cytokine networks,19,33polarization of T cell function,15,17,34,35
and augmentation of IL10–producing Tregs.36,37 Recent research has identified several promising candidates promoting the in vivo and/or in vitro induction/expansion of Tregs. The immuno - suppressive agent rapamycin provides a selective advantage for Treg cell growth,38whereas all-trans retinoic acid facilitates de novo generation of Foxp3+ Tregs from CD25-T cells.39This conversion to Tregs also can be achieved in vitro in the presence of all- trans retinoic acid and transforming growth factor beta.40,41 As high and stable Foxp3 expression is mandatory for the suppressive function of Tregs,42-44 the hypomethylating agents decitabine and azacitidine emerged as promising FDA (Food and Drug Administration) approved drugs to induce Foxp3 expression in CD4+CD25-T cells in vitro and in vivo. Induction of Foxp3 in activated CD4+CD25- T cells generated functional Tregs with suppressive properties. Moreover, in vivo treatment of mice with azacitidine after allogeneic stem cell transplantation mitigates graft-versus-host disease while preserving graft versus leukemia by increased peripheral conversion of CD4+CD25- effector T cells into functionally suppressive Foxp3+Tregs.45
Although G-CSF stimulation of CD4+CD25- T cells results in short-term induction of Foxp3 173
Proliferation presented as means of counts per minute and was measured in in vitro anti-CD3/CD28 stimulated CD4+CD25-T lymphocytes isolated from 5 healthy donors (grey bar). Inhibition assay was performed by using CD4+CD25-T lymphocytes prestimulated with G-CSF for 12 hours and co-cultured afterwards at a ratio of 1:1 with activated CD4+CD25-T cells for additional 12 hours (black bar). Results of a 2-tailed unpaired ttest > .05 were regarded as not significant (ns).
Figure 5. Suppressive Function of In Vitro G-CSF Stimulated CD4+CD25-T Cells
mRNA expression, this effect could not be observed at the protein level. Most importantly, functional analyses reveal that G-CSF stimulation of CD4+CD25- T cells in vitro do not induce an immune regulatory phenotype with suppressive potency. This observation is supported by the expression patterns of molecules associated with the suppressive function of Tregs like CD3946and TGF binding protein LAP.47 Low expression of LAP results in higher secretion of TGF and thus, enhancement of suppression.48 However, LAP is highly expressed after G-CSF stimulation in vitro, indicating a lower secretion of TGF, which is well in line with former results studying in vivo effects of G-CSF.14
Furthermore, G-CSF stimulation of CD4+CD25- T cells did not reduce expression of the IL7 receptor (CD127), also arguing against a suppressive phenotype as the expression level of CD127 is negatively correlating with the suppressive function of Tregs.49Interestingly, treatment of mononuclear cells with rabbit antithymocyte globulin leads to expansion of functional Tregs by converting CD4+CD25- T cells to CD4+CD25+ T cells with increased Foxp3 expression and IL10 secretion.50 Whereas rabbit antithymocyte globulin induces expression of GITR and CTLA4,51G-CSF treatment results in decreased mRNA expression levels of these activation/costimulatory marker molecules. In addition, protein expression of CD62L, CD69, and 4-1BB remained unaffected by G-CSF. Rutella and associates detected signs of T cell activation and the induction of a Tr1 phenotype after G-CSF stimulation in vivo with high secretion of IL10,14which we did not detect. In contrast, we demonstrate that direct G-CSF stimulation induces GATA3 and IL4 expression in donor CD4+ T cells after G-CSF treatment.12Moreover, CD4+T cells maintained their Foxp-CD127+phenotype also after repetitive G-CSF stimulation in vitro.
Formerly reported induction of Tregs after G-CSF application in vivo does not result from direct G-CSF stimulation of CD4+CD25-T cells. Therefore, G-CSF does not qualify for the induction and subsequent expansion of regulatory T cells in vitro under the described conditions. The development of cellular strategies for tolerance induction in hematopoietic stem cell and solid organ transplantation must rely on candidates other than G-CSF for efficient in vitro induction/expansion of Tregs.
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Diskussion -14-
3 Diskussion
Hintergrund der hier durchgeführten Untersuchungen ist, dass Tregs eine entscheidende Rolle für die Induktion und den Erhalt der Immuntoleranz spielen. Verschiedene experimentelle und klinische Studien haben gezeigt, dass der adoptive Transfer von Spender-Tregs eine Graft- versus-Host-Erkrankung verhindert und die Immunrekonstitution nach allogener HSCT begünstigt.24,26,27,31 Jedoch wird dieser neuartige zelluläre Ansatz zur Induktion einer Immuntoleranz durch die geringe Treg Zellzahl erschwert. Folglich wäre der adoptive Treg- Zelltransfer auf einzelne Anwendungen in der lymphopenischen Situation nach allogener HSCT reduziert. Diese Einschränkungen könnten durch die in vitro Induktion und Expansion von Tregs aufgehoben werden. Auch die repetitive Gabe von Treg-Zellinfusionen nach HSCT und der Einsatz von Tregs in der Organtransplantation setzt die Verfügbarkeit von Tregs in einer hohen Zellzahl voraus. Dieses dafür erforderliche Potenzial der Induktion und Expansion von Tregs in vitro wurde in der vorliegenden Arbeit evaluiert.
Immer mehr Hinweise belegen, dass G-CSF-induzierte Effekte nicht auf die myeloische Zelllinie beschränkt sind4, sondern auch vielfältige Modulationen adaptiver Immunreaktionen induzieren.32 Dies zeigt sich an der funktionellen Expression des G-CSF-Rezeptors auf T- Lymphozyten.12 Vor allem aber induziert G-CSF Veränderungen der Zytokininteraktionen19,33, eine Polarisierung der T-Zell-Funktion15,17,34,35 und eine Verstärkung von IL-10-produzierenden Tregs.36,37
Im Rahmen der Dissertationsarbeit wurden zunächst Genexpressionsanalysen von CD4+CD25--T-Zellen nach in vitro Stimulation mit G-CSF durchgeführt, um festzustellen, ob in vitro ein regulatorischer Foxp3+-T-Zell-Phänotyp induziert wird. Allerdings konnte gezeigt werden, dass unabhängig von der G-CSF-Applikation nach mitogener Stimulierung Foxp3 vermehrt exprimiert wird. Jedoch zeigte sich bei der quantitativen Analyse weiterer Treg- Zellen-assoziierter Gentranskripts eine signifikant erniedrigte Regulierung von CD127 und erhöhte Regulierung von CTLA-4 und CD39 in anti-CD3- und anti-CD28- stimulierten naiven T-Zellen mit und ohne G-CSF im Vergleich zu kultivierten T-Zellen ohne Stimulation.
Eine erhöhte-Regulierung von CTLA4 ist in stimulierten T-Zellen ohne Beigabe von G-CSF signifikant ausgeprägter, während die signifikante Veränderung bei den Genexprimierungsniveaus für CD127 und CD39 nicht G-CSF abhängig ist. Der Th2- Masterregulator GATA3 wurde nach der zusätzlichen G-CSF-Stimulation im Vergleich zur isolierten anti-CD3- und anti-CD28- Stimulation signifikant verstärkt exprimiert. IL10 wurde
Diskussion -15- nach der anti-CD3- und anti-CD28-Stimulation von CD4+CD25--T-Zellen mit und ohne G- CSF in vitro unverändert exprimiert (siehe Abbildung 1 und 2 in der Originalarbeit).
Zusätzlich wurden die Auswirkungen der G-CSF-Stimulation auch auf Proteinebene für Moleküle untersucht, die relevant sind für Treg-Zelldifferenzierung (CD127, Helios, Foxp3) und -funktion (CD39, CTLA-4, IL-10, LAP) sowie T-Zell-aktivierung/-Kostimulation (4- 1BB, CD62L, CD69) und deren Differenzierung (CD45RA, CD45RO). Dabei zeigte sich, dass die stimulierten T-Zellen Anzeichen einer Aktivierung (CD69, CD62L) aufweisen und membrangebundenes TGF-ß (LAP) exprimieren. Weniger als 20 % zeigen einen naiven T- Zellphänotyp (CD45RA), während ungefähr 10 % einem Gedächtnis-T-Zellphänotyp (CD45RO) ähneln (siehe Abbildung 3 in der Originalarbeit). Die Expression weiterer Tregassoziierter Markermoleküle, wie CTLA4, IL-10, CD127, CD39, 4-1BB und Helios ist unabhängig von G-CSF. In funktionellen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass G- CSF keinen Einfluss auf die T Zell Proliferation hat (siehe Abbildung 4 in der Originalarbeit).
Tregs weisen einen suppressiven Phänotyp auf und inhibieren die Proliferation weiterer T- Zellen. Allerdings führte im klassischen Suppressionsassay die zusätzliche Behandlung von T-Zellen mit G-CSF zu keiner Inhibition der Proliferation von T-Effektorzellen.
Obgleich die in vitro G-CSF-Stimulation von CD4+CD25--T-Zellen temporär zur Induktion der Foxp3 mRNA Expression führt, konnte dieser Effekt nicht auf Protein-Ebene beobachtet werden. Vor allem aber offenbaren die funktionelle Analysen, dass die G-CSF-Stimulation von CD4+CD25--T-Zellen in vitro keinen immunregulatorischen Phänotyp mit Suppressionsfähigkeit induziert. Diese Beobachtung wird durch die Expression solcher Gene gestützt, die mit der suppressiven Funktion von Tregs wie CD3946 und TGF-β-bindendes Protein LAP47 assoziiert sind. Eine geringe Expression von LAP führt zu einer höheren Sekretion von TGF-β und somit zu einer Verstärkung der Suppression.48 Die in vitro Stimulation mit G-CSF führt zur verstärkten LAP-Expression, was in einer verminderten TGF-β-Sekretion resultiert. Diese Beobachtung deckt sich mit früheren Ergebnissen.14 Darüber hinaus reduziert die G-CSF Stimulation nicht die Expression des IL7-Rezeptors (CD127). Diese spricht ebenfalls gegen einen suppressiven Phänotyp, da die Expression von CD127 negativ mit der suppressiven Funktion von Tregs korreliert.49 Interessanterweise führt die Behandlung von mononuklearen Zellen mit Kaninchen-Antithymozytenglobulin zur Expansion funktionaler Tregs, indem konvertierte CD4+CD25--T-Zellen verstärkt Foxp3 exprimieren und IL10 sezernieren.50 Während Kaninchen-Antithymozytenglobulin die Expression von GITR und CTLA4 induziert51, werden diese Gene nach der G-CSF-
Diskussion -16- Behandlung vermindert exprimiert. Desweiteren blieb auch die Expression von CD62L, CD69 und 4-1BB durch G-CSF unbeeinflusst. Rutella beschrieb die Aktivierung von T-Zellen infolge der G-CSF Stimulation und konnte die Induktion eines Tr1-Phänotyps mit hoher IL10 Produktion in vivo nachweisen14, was in der vorliegenden Studie nicht gezeigt werden konnte.
Im Gegensatz dazu konnte hier nachgewiesen werden, dass die direkte G-CSF-Stimulation die GATA3- und IL4-Expression in Spender-CD4+-T-Zellen induziert.12 Darüber hinaus behielten CD4+-T-Zellen ihren Foxp-CD127+-Phänotyp auch nach repetitiver G-CSF- Stimulation in vitro bei. Die Konversion von CD4+CD25--T-Zellen zu T-Zellen mit einem regulatorischen Phänotyp ist demzufolge nicht auf die direkte G-CSF-Stimulation zurückzuführen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass G-CSF nicht zur in vitro Induktion und Expansion von regulatorischen T-Zellen führt. Die Entwicklung zellulärer Strategien zur Toleranzinduktion in der hämatopoetischen SCT und Organ-Transplantation muss sich deshalb auf andere Kandidaten als G-CSF stützen.
So haben jüngste Forschungen eine Reihe vielversprechender Ansätze ermittelt, wie die in vivo und/oder in vitro –Induktion und Expansion von Tregs gefördert werden kann. Das Immunosuppressivum Rapamycin bietet einen selektiven Vorteil für das Treg- Zellwachstum38, während die All-Trans-Retinsäure (ATRA) die de novo Generation von Foxp3+-Tregs aus CD25--T-Zellen unterstützt.39 Diese Konversion zu Tregs kann auch in vitro in der Gegenwart von ATRA und TGFβ erzielt werden.40,41 Da eine hohe und stabile Foxp3-Expression für die suppressive Funktion von Tregs unverzichtbar ist42,43,44, haben sich hypomethylierende Agenzien wie Decitabin und Azacitidin als vielversprechende Wirkstoffe zur Induktion der Foxp3 Expression bei CD4+CD25--T-Zellen in vitro und in vivo herausgestellt. Die Induktion von Foxp3 in aktivierten CD4+CD25--T-Zellen generiert funktionale Tregs mit suppressiven Eigenschaften. Darüber hinaus lindert die in vivo Behandlung von Mäusen mit Azacitidin nach allogener SZT die Graft-versus-Host- Erkrankung, während der Graft-versus-Leukämie Effekt aufgrund der Induktion von Foxp3+ Tregs erhalten bleibt.45
Zusammenfassung und Ausblick -17-
4 Zusammenfassung und Ausblick
Der Einsatz von regulatorischen T-Zellen (Tregs) auf dem Gebiet der Organtransplantation und hämatopoetischen Stammzelltransplantation (SZT) spielt eine bedeutende Rolle bei der Entwicklung neuartiger zellulärer Strategien zur Toleranzinduktion. Aufgrund der geringen Zellzahl regulatorischer T-Zellen ist man derzeit bestrebt, Methoden zu etablieren, um regulatorische T-Zellen in vitro zu induzieren und expandieren.
In der vorliegenden Arbeit wurde der direkte Effekt von rekombinantem G-CSF auf CD4+CD25--T-Zellen in vitro untersucht. Hierfür wurden Treg spezifische Markermoleküle mittels quantitativer reverse Transkriptase-Polymerase- (PCR) und fluoreszenzaktivierter Zellanalysen untersucht. Die Suppressionskapazität von G-CSF stimulierten T-Zellen wurde mittels funktionaler Assays analysiert.
Nach der Stimulation mit G-CSF in vitro zeigen kinetische Analysen eine kurzfristig verstärkte Foxp3 mRNA-Expression. Weitergehende Analysen zur Proteinexpression und suppressorischen Funktion belegen jedoch, dass der direkte Kontakt mit G-CSF nicht zur Induktion eines regulatorischen T-Zell-Phänotyps führt. Folglich ist G-CSF nicht für die Entwicklung von Protokollen, die auf eine höhere Zellzahl regulatorischer T-Zellen für Immuninterventionsstudien bei der Organtransplantation und hämatopoetischen Stammzelltransplantation abzielen, geeignet. Vielmehr scheinen andere immunmodulatorische Substanzen wie Histondeacetylaseinhibitoren oder Differenzierungsagenzien wie All-Trans-Retinsäure einen vielversprechenden Ansatz zur Induktion und Expansion humaner Tregs darzustellen.
Literaturverzeichnis -18-
5 Literaturverzeichnis
(die Referenzangaben sind der Originalpublikation zu entnehmen)
Danksagung -19-
6 Danksagung
Herrn Prof. Dr. med. A. Ganser und Frau Prof. Dr. med. A. Franzke danke ich für die Überlassung des Themas dieser Arbeit und die ausgezeichneten materiellen und finanziellen Möglichkeiten, es zu bearbeiten.
Mein besonderer Dank gilt meiner Mentorin, Prof. Dr. med. A. Franzke, für die Hilfsbereitschaft, Unterstützung und Geduld, die sie mir während der langen Zusammenarbeit entgegenbrachte. Sie stand mir zur jeder Zeit mit Rat und Tat zur Seite und ermöglichte mir zahlreiche und interessante Einblicke in den Bereich der experimentellen Forschung und darüber hinaus auch in das klinische Fachgebiet der Hämatologie, Onkologie und Stammzelltransplantation. Dieses hat mein Studium der Humanmedizin und meinen weiteren beruflichen Werdegang außerordentlich bereichert.
Frau Dr. S. Ukena danke ich besonders für die zahlreichen Momente der Unterstützung und konstruktiven Diskussionen. Auch für die mühevolle Arbeit der Datenanalyse und des späteren Korrekturlesens möchte ich ihr herzlich danken.
Ich danke auch Dr. med. Philipp Ivanyi und Jens Grosse für die vielen fachlich anregenden und konstruktiven Gespräche.
Abschließend danke ich herzlichst meinem Ehemann, der mich während der langen Zeit mit aufmunternden Worten begleitet und mich stets in meinem Vorhaben unterstützt hat.
Lebenslauf -20-
7 Lebenslauf
Persönliche Daten
Name: Stefanie Schulze Lammers, geb. Lauszus Geburtsdatum: 23.10.1980
Geburtsort: Hannover Familienstand: verheiratet Nationalität: deutsch
Beruflicher Werdegang
11/2011- 08/2013 Truppenärztin im Sanitätszentrum Kerpen 02/2011 Erwerb der Zusatzbezeichnung Notfallmedizin 09/2010-10/2011 Truppenärztin im Sanitätszentrum Stadtallendorf
03/2010- 08/2010 Erste klinisch Verwendung im Bundeswehrzentralkrankenhaus Koblenz als Assistenzärztin: 6 Monate Tätigkeit auf einer internistischen Intensivstation
08/2008- 02/2010 Erste klinische Verwendung im Bundeswehrzentralkrankenhaus Koblenz als Assistenzärztin: 18Monate Tätigkeit auf einer internistischen Normalstation mit kardiologischem Schwerpunkt 10/2001- 05/2008 Beurlaubung aus dem aktiven Dienst zum Studium der
Humanmedizin an der Medizinischen Hochschule Hannover 01/2001- 09/2011 Militärische Ausbildung zum Saniätsoffizieranwärter
01/2001 Einstieg als Sanitätsoffizieranwärter in die Bundeswehr
Lebenslauf -21-
Schulische und akademische Ausbildung
05/2008 Erhalt der Approbation als Ärztin
01/2007- 01/2008 Praktisches Jahr an der Medizinischen Hochschule Hannover
04/2004 Ärztliche Vorprüfung
10/2001 Immatrikulation an der Medizinischen Hochschule Hannover zum Studium der Humanmedizin
10/1993- 04/2000 Erwerb der allgemeinen Hochschulreife
Publikationen
2013 Originalarbeit: Schulze Lammers et al. Characterization of Granulocyte colony stimulating factor for in vitro induction of regulatory T cells for cellular immune intervention in transplant medicine. Experimental and Clinical Transplantation 2013;2:169-175
2008 Poster: Lauszus et al. Stimulation of CD4+CD25- T lymphocytes with Granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) induces a regulatory phenotype. The 34th Annual Meeting of the European Group for Blood and Marrow Transplantation, Florence, Italien
Köln, den 21.09.2013
Stefanie Schulze Lammers
