Natürlich vorkommende CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen

2.4.4.1 Entdeckung von Suppressor T-Zellen

Die erste Beschreibung von Suppressor T-Zellen erfolgte durch Nishizuka et al. im Jahre 1969.

In seinen Experimenten entwickelten Mäuse, die an Tag drei nach der Geburt thymektomiert wurden, verschiedenste Autoimmunerkrankungen. Diese Autoimmunerkrankungen traten nicht auf, wenn den Mäusen der Thymus schon vor dem zweiten Tag oder später als sieben Tage nach der Geburt entfernt wurde. Die Autoimmunerkrankungen thymektomierter Tiere konnten durch einen Transfer von Milzzellen oder reifen Thymozyten aus adulten Mäusen, spätestens zwei Wochen nach Thymektomie, verhindert werden (NISHIZUKA U. SAKAKURA, 1969). Damit wurde der Grundstein für die Idee einer im Thymus entstehenden, natürlich vorkommenden Population von Suppressor T-Zellen gelegt. Bereits ein Jahr später beschrieben Gershon und Kondo eine Subpopulation von T-Zellen, welche in der Lage war, neben B-Zellen und Antigenpräsentierenden Zellen, auch T-Zellen in ihrer Aktivierung zu supprimieren (GERSHON

U. KONDO, 1970, 1971). Nach dieser Publikation folgte in den 1970er und 1980er Jahren eine Flut von Publikationen über Suppressor T-Zellen (MURPHY ET AL., 1976; RICH U. DAVID, 1979; OKUDA ET AL., 1981; KIM ET AL., 1980).

Neben der biologischen Funktion dieser T-Zellen wurde auch ein zellkontakt-unabhängiger, auf löslichen Faktoren basierender Wirkmechanismus publiziert. Die meisten dieser löslichen suppressiven Faktoren enthielten Determinanten, welche durch eine damals postulierte I-J Region des MHC codiert wurden. Nachdem jedoch durch Klonierung des MHC die Existenz eines solchen I-J Locus ausgeschlossen werden konnte (KRONENBERG ET AL., 1983), wurde die gesamte Theorie der Suppressor T-Zellen fallen gelassen. Die Idee geriet so stark in Misskredit, dass viele Wissenschaftler den Terminus ’Suppressor T-Zellen’ nicht mehr verwendeten (MÖLLER, 1988; GREEN U. WEBB, 1993). Die bis dato gewonnenen, nicht widerlegten Daten wurden im Wesentlichen als sekundäre Effekte der Th1/Th2 Kreuz-Regulation interpretiert.

Erst Mitte der 1990er Jahre erweckte ein von SAKAGUCHI ET AL. (1995) publiziertes Experiment erneutes Interesse an Suppressor T-Zellen. Er konnte zeigen, dass das suppressive Potential in einem naiven Tier sich auf diejenigen CD4+ T-Zellen beschränken lässt, welche auch die α-Kette des IL-2-Rezeptors (CD25) auf ihrer Oberfläche exprimieren.

Diese als CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen bezeichneten Suppressorzellen stellen in einem naiven Tier ca. 5-10% der peripheren CD4+ T-Zellen. Ihr suppressives Potential konnte in einem adoptiven T-Zell-Transfermodell gezeigt werden. In diesem Modell wurden Autoimmunerkrankungen durch Transfer von CD4+CD25- T-Zellen in eine T-Zell-lose Maus induziert, die alleine durch den Kotransfer von CD4+CD25+ T-Zellen verhindert werden konnten. Dass diese CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen im Thymus entstehen (SHEVACH, 2002; ITOH ET AL., 1999; SEDDON U. MASON, 2000) und eine eigenständige Subpopulation von T-Zellen darstellen, zeigte die Wiederholung der von NISHIZUKA U. SAKAKURA (1969) durchgeführten Experimente an drei Tage alten thymektomierten Mäusen. Alleine der Transfer von CD4+CD25+ T-Zellen aus erwachsenen Mäusen verhinderte bei diesen Tieren die Entstehung von schweren Autoimmunerkrankungen (ASANO ET AL., 1996).

2.4.4.2 Thymusentstehung von CD4+CD25+ T-Zellen

Neben den oben erwähnten Versuchen von ASANO ET AL. (1996) stützen noch weitere Publikationen die Entstehung von CD4+CD25+Tregs im Thymus. ITOH ET AL. (1999) isolierte CD4+CD25+ Thymozyten mit einem sehr ähnlichen Phänotyp wie CD4+CD25+Tregs aus dem peripheren Blut. Sowohl CD4+CD25+Tregs in der Peripherie als auch CD4+CD25+

Thymozyten exprimieren neben CD25 die gleichen Oberflächenmoleküle, wie z.B. CTLA-4

oder GITR (MCHUGH ET AL., 2002; SHIMIZU ET AL., 2002). Sie erscheinen anerg und sind im Stande, in vitro sowohl die Proliferation von CD4+ als auch CD8+ T-Zellen zu supprimieren.

Depletion von CD4+CD25+ Thymozyten und der Transfer von CD4+CD25- Thymozyten in eine T-Zell-lose Maus führt analog zu dem von SAKAGUCHI ET AL. (1995) publizierten Experiment, zur Entstehung schwerer Autoimmunerkrankungen (ITOH ET AL., 1999).

Durch Interaktion mit Selbstantigen werden Thymozyten mit autoreaktiven T-Zell-Rezeptoren während der T-Zellreifung zu CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen transformiert (PICCA ET AL., 2006). Welche Signale im Thymus jedoch darüber entscheiden, ob ein T-Zell-Vorläufer sich zu einer regulatorischen oder reaktiven T-Zelle entwickelt, sind weitestgehend unbekannt.

Mäuse deren T-Zellen einen transgenen TZR exprimieren, der mit intermediärer Avidität ein im Thymus exprimiertes Autoantigen erkennt, zeigten zwar einen hohen Anteil an negativ selektierten T-Zell-Vorläufern, gleichzeitig stieg jedoch die Zahl der regulatorischen T-Zellen exponentiell an (JORDAN ET AL., 2001; KAWAHATA ET AL., 2002). Es wird heute angenommen, dass die CD4+CD25+ Tregs während ihrer Entwicklung im Thymus Alloantigen mit intermediärer Avidität erkennen, dies jedoch nicht zu ihrer Depletion führt.

Ob CD4+CD25+ Tregs aus einer spezifischen T-Vorläufer-Zelle entstehen, oder ob sich jeder Thymozyt potenziell zu einer CD4+CD25+Treg entwickeln kann, ist noch ungeklärt. Die Tatsache, dass CD4+CD25+Tregs ein genauso diverses TZR-Repertoire wie reaktive CD4+

T-Zellen besitzen, stützt eher die Theorie einer spezifischen Treg-Vorläuferzelle (HORI ET AL., 2002; SEDDON U. MASON, 1999; TAGUCHI U. NISHIZUKA, 1987; TAGUCHI ET AL., 1994;

GARZA ET AL., 2000).

Auch konnte bisher nicht befriedigend beantwortet werden, ob bei der Entstehung von CD4+CD25+ Tregs neben der intermediären Avidität ihrer TZR gegen Alloantigen noch weitere Signale eine Rolle spielen. Neuere Studien zeigen eine Beteiligung von akzessorische Molekülen. Versuche mit CD28 Knock-out Mäusen und die Blockade von CD28 durch CTLA-4-Immunglobulin zeigten, dass Interaktionen zwischen CD28 und B7 eine entscheidende Rolle bei der Entstehung im Thymus und/oder der Homeostase von CD4+CD25+Tregs in der Peripherie spielen (TANG ET AL., 2003; SALOMON ET AL., 2000). CD25- (IL-2 Rezeptor α-Kette), CD122- (IL-2 Rezeptorβ-Kette) und IL-2-Knock-out Mäuse sowie die Neutralisation von IL-2 durch Antikörper resultierte in schweren Autoimmunerkrankungen, die durch den adoptiven Transfer von CD4+CD25+Tregs verhindert werden konnten (MALEK ET AL., 2002; ALMEIDA ET AL., 2002; PAPIERNIK ET AL., 1998).

Durch diese Studien wurde auch die wichtige Bedeutung von IL-2 für die Entwicklung bzw.

Funktion von CD4+CD25+Tregs nachgewiesen.

2.4.4.3 Periphere Entstehung von CD4+CD25+ T-Zellen

Obwohl heutzutage die zentrale Entstehung von CD4+CD25+Tregs im Thymus als sicher gilt, wird bezweifelt, dass dies der einzige Weg ihrer Entstehung ist. Im Rahmen der altersbedingten Thymusinvolution sinkt auch die Zahl an thymusgenerierten Lymphozyten. Daher müßte bei einer ausschließlichen zentralen Entstehung die Zahl an CD4+CD25+Tregs mit der Zeit abnehmen (AKBAR ET AL., 2003). Dies ist jedoch nicht der Fall, es ist sogar ein altersbedingter Anstieg dieser Zellpopulation zu beobachten (GREGG ET AL., 2005). Neuere in vivo (WALKER ET AL., 2003) und vitro (YAMAZAKI ET AL., 2003) Experimente zeigen, dass eine Proliferation von CD4+CD25+Tregs trotz ihres anergen Phänotyps möglich ist. Diese Proliferation ist jedoch von der Anwesenheit von Cytokinen wie IL-2 abhängig, welche nicht von den Tregs selbst produziert werden. Neben dieser direkten Expansion von CD4+CD25+Treg besteht außerdem die Möglichkeit der Neuentstehung aus CD4+ T-Zellen nach Antigenpräsentation durch nichtprofessionelle Antigenpräsentierende Zellen, wie beispielsweise aktivierte T-Zellen (AKBAR ET AL., 2003). Bei der direkten Antigenpräsentation von T-Zelle zu T-Zelle, in der Abwesenheit von professionellen antigenpräsentierenden Zellen mit adäquater Kostimulation, nehmen die T-Zellen einen regulatorischen Phänotyp an (LOMBARDI ET AL., 1994; TAAMS ET AL., 1998, 1999).

2.4.4.4 Immunologischer Phänotyp der regulatorischen T-Zelle

Bei den natürlich vorkommenden Tregs handelt es sich um eine Subpopulation der CD4+

T-Zellen, die das Antigen CD25 (α-Kette des IL-2-Rezeptors) koexprimiert (SAKAGUCHI ET AL., 1995). Im Rahmen der T-Zellaktivierung steigt durch die Expression derα-Kette die Affinität des Rezeptors für IL-2 deutlich an (SAITO U. HONJO, 1990; SUGAMURA, 1994).

Daher wurde CD25 lange Zeit hauptsächlich als Marker für aktivierte T-Zellen angesehen.

Da bis heute für CD4+CD25+Tregs kein spezifisches Oberflächenmolekül beschrieben wurde und auch aktivierte CD4+ T-Zellen CD25 exprimieren, können diese Zellen nur durch ihre funktionellen Eigenschaften charakterisiert werden. Die charakteristische Eigenschaft dieser Zellen ist, dass sie in vitro nach Stimulation über ihren TZR weder IL-2 produzieren noch proliferieren (SHEVACH, 2002; SU ET AL., 2004). Sie sind jedoch in der Lage antigenunabhängig aber zellkontaktabhängig sowohl die Proliferation als auch die Cytokinproduktion von aktivierten CD4+ und CD8+ T-Zellen zu supprimieren (TAKAHASHI ET AL., 1998; SHEVACH ET AL., 2001; THORNTON U. SHEVACH, 2000; PICCIRILLO U. SHEVACH, 2001). Bei menschlichen Lymphozyten wird von den CD4+CD25^low+ Tregs mit schwacher CD25 Expression zusätzlich eine CD4+CD25^high+ T-Zellsubpopulation mit starker CD25 Expression und ausgeprägter Suppressorfunktion abgegrenzt (BAECHER-ALLAN

ET AL., 2001).

Obwohl in gesunden, nicht-immunisierten Tieren CD25 immer noch ein sehr guter Marker für CD4+CD25+Tregs ist, bleibt eines der größten Probleme bei der Erforschung dieser Zellen die genaue Identifizierung durch Moleküle, welche exklusiv auf ihrer Zelloberfläche exprimiert werden. Zwar wurden neben CD25 verschiedene Oberflächenmoleküle, wie GITR (MCHUGH ET AL., 2002; SHIMIZU ET AL., 2002) oder CTLA-4 (SAKAGUCHI, 2004) mit CD4+CD25+Tregs assoziiert, jedoch findet man diese Moleküle auch auf verschiedenen Aktivierungs-, Differenzierungs- und Entwicklungsstadien von reaktiven CD4+ T-Zellen (VALZASINA ET AL., 2005; TAKEDA ET AL., 2004; MCHUGH ET AL., 2002; SHIMIZU ET AL., 2002; HUANG ET AL., 2004; ERMANN ET AL., 2005; READ ET AL., 1998; SINGH ET AL., 2001; HERBELIN ET AL., 1998; GONZALEZ ET AL., 2001; GAVIN ET AL., 2002; BRUDER ET AL., 2004).

Der forkhead/winged helix transciption Factor (Foxp3) wird, verglichen mit anderen CD4+ T-Zellen, sehr stark von CD4+CD25+Tregs exprimiert (HORI ET AL., 2003;

FONTENOT ET AL., 2003). Mäuse, welche eine natürlich auftretende Mutation im Foxp3-Gen tragen (scurfy-Maus), entwickeln schwere Autoimmunerkrankungen, die sogar verheerender verlaufen, als nach Depletion von CD4+CD25+Tregs in naiven Mäusen (BRUNKOW ET AL., 2001). Das entsprechende Krankheitsbild beim Menschen wird IPEX-Syndrom (immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome) genannt und führt, genau wie bei der scurfy-Maus, zum raschen Tod Neugeborener (WILDIN ET AL., 2002; LYON ET AL., 1990; BLAIR ET AL., 1994; GODFREY ET AL., 1991). CD4+ T-Zellen aus scurfy-Mäusen zeigen eine Hyperresponsivität auf TZR-Stimulus, benötigen zu ihrer Aktivierung keine kostimulatorischen Signale und produzieren nach Aktivierung sehr große Mengen an IL-2 und anderen Cytokinen (SCHUBERT ET AL., 2001). Zwar zeigt die scurfy-Maus eine stark erhöhte Zahl CD4+CD25+ T-Zellen, es wird jedoch angenommen, dass es sich hierbei um aktivierte CD4+ T-Zellen handelt.

Kürzlich konnte gezeigt werden, dass CD4+ T-Zellen nach Transduktion mit Foxp3 sowohl den anergen Phänotyp als auch die bisher beschriebenen Oberflächenmolekülen von CD4+CD25+Tregs sowie regulatorische Eigenschaften in vitro und in vivo zeigen (KHATTRI ET AL., 2003; FONTENOT ET AL., 2003). Somit scheint Foxp3 ein wichtiger molekularer Schalter für die Entwicklung und Funktion von CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen zu sein.

2.4.4.5 Mechanismen der Suppression

Die Bestimmung des Mechanismus der supprimierenden Wirkung führt bei in vitro und in vivo Untersuchungen zu unterschiedlichen Ergebnissen. In vitro zeigen die Tregs eine Zellkontakt

abhängige, jedoch weitgehend Zytokin unabhängige Hemmung (TAKAHASHI ET AL., 1998;

SURI-PAYER U. CANTOR, 2001; PICCIRILLO ET AL., 2002). So konnte gezeigt werden, dass in vitro TGF-β nicht an der kontaktabhängigen Suppression von CD4+ T-Zellen durch CD4+CD25+ Tregs beteiligt ist (PICCIRILLO ET AL., 2002). TAKAHASHI ET AL. (2000) und SHIMIZU ET AL. (2002) vermuten eine Hemmung durch die Oberflächenmoleküle CTLA-4 und GITR. Die Rolle des immunsuppressiven Cytokins TGF-β wurde lange Zeit kontrovers diskutiert. Bei in vivo Versuchen führt sowohl die Blockade von IL-10 als auch TGF-β zu einem Verlust der Suppressorfunktion (JOSIEN ET AL., 1998; HARA ET AL., 2001), wodurch eine Beteiligung von Zytokinen nicht vollständig ausgeschlossen werden kann. Neueste Arbeiten konnten in einem Colitis-Transfermodell zeigen, das TGF-βzwar entscheidend an der Hemmung colitogener Effektor-T-Zellen beteiligt ist, dieses jedoch nicht durch CD4+CD25+

Tregs produziert wird (FAHLÉN ET AL., 2005). Weiterhin konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass CD4+CD25+ Tregs aus TGF-β-defizienten Mäusen mit CD4+CD25+ Tregs aus Wildtyp Mäusen vergleichbare suppressive Eigenschaften besitzen, so dass eine Rolle von TGF-βbei der CD4+CD25+ Treg-vermittelten Suppression in vitro und in vivo ausgeschlossen werden kann. Nichts desto trotz ist TGF-βein entscheidendes immunmodulatorisches Cytokin, welches neben seinen direkten immunsuppressiven Eigenschaften eine wichtige Rolle bei der Entstehung und Funktion von Tr1- und Th3-Zellen einnimmt (RONCAROLO ET AL., 2001;

WEINER, 2001).

Nach einer spezifischen T-Zell-Rezeptor vermittelten Aktivierung scheint die Suppression eher antigenunspezifisch zu sein (THORNTON U. SHEVACH, 2000). Obwohl die Grundlage des suppressiven Mechanismus bis heute nicht verstanden ist, scheint einer der wichtigsten Prozesse die Hemmung der endogenen IL-2 Produktion in aktivierten T-Zellen zu sein (THORNTON U. SHEVACH, 1998; MALEK U. BAYER, 2004; THORNTON ET AL., 2004a,b). Im Einklang mit diesen Ergebnissen steht, dass alle bisher beschriebenen Mechanismen zur Durchbrechung der CD4+CD25+Treg vermittelten Suppression z.B. durch Kostimulation über CD28 oder GITR, in aktivierten T-Zellen eine starke IL-2 Produktion induzieren (THORNTON U. SHEVACH, 1998;

STEPHENS ET AL., 2004; BIN JI ET AL., 2004; ZHENG ET AL., 2004; TAKEDA ET AL., 2004; VALZASINA ET AL., 2005). Daneben scheint neueren Studien zufolge IL-2 auch für die Homeostase von CD4+CD25+Tregs in der Peripherie essentiell zu sein (FONTENOT ET AL., 2005).