Für die In-vitro-Suppressionassays wurden ausschließlich frisch isolierte Lymphozyten verwendet. Daher wurden nur Tiere ausgewertet, bei denen ausreichend Probenmaterial zur Verfügung stand, wodurch sich das Probenkontingent auf jeweils 4 Tiere pro Gruppe reduzierte. Wells, deren Ergebnisse auf Verunreinigungen hindeuteten, wurden von der Auswertung ausgeschlossen. Die Proliferation der Lymphozyten wurde über die Aufnahme von 3H-Thymidin in die Lymphozyten gemessen. Die Ergebnisse wurden in Ausschlägen pro Minute (counts/min) gemessen und werden als Stimulationsindex (SI) im Vergleich zum Mediumblindwert angegeben. Der SI berechnet sich nach der Formel:
SI = Reaktionswert−Mediumblindwert Mediumblindwert .
Es wurden getrennt die Indizes der Reaktionen von Empfängerlymphozyten gegen Spenderantigen, unbekanntem Alloantigen (Hausschwein) sowie unspezifischem Mitogen (PHA-M) mit und ohne Zusatz von CD25+ Lymphozyten ausgewertet. Für die beiden Gruppen wurden die nach Transplantation erhobenen Proben miteinander verglichen, bei denen die Reinheit der isolierten CD25+ Lymphozyten mindestens 80 % betrug.
Abbildung 4.13: FACS ERGEBNISS EINER REINHEITSKONTROLLE. Beispielhafte Darstellung von isolierten CD25 positiven Lymphozyten eines Langzeitüberlebers.
Suppression im Verhältnis 1:7
Isolierte CD25+ Lymphozyten waren in einem Verhältnis von 1:7 in beiden Gruppen und für alle Raktionsansätze in der Lage, die Proliferation von Empfängerlymphozyten signifikant bis auf den Mediumblindwert zu senken. Die Proliferation von Empfängerlymphozyten gegen Spenderantigen wurde schwach signifikant (p < 0,05), die gegen unbekanntes Alloantigen und unspezifisches Mitogen signifikant (p < 0,01) gehemmt.
Langzeitüberleber (SI: 3,23) zeigten ohne Zugabe von CD25+ Lymphozyten im Vergleich zu Abstoßern (SI: 4,99) eine geringere Reaktion auf Spenderantigen. Dieser Unterschied war jedoch nicht signifikant.
Suppression im Verhältnis 1:70
In keinem der Reaktionsansätze war bei Langzeitüberlebern oder Abstoßern durch die Zugabe von CD25+ Lymphozyten im Verhältnis von 1:70 eine deutliche Proliferationshemmung zu beobachten.
Abbildung 4.14: PROLIFERATION VON EMPFÄNGERLYMPHOZYTEN (R) IN DER GEMISCHTEN LYMPHOZYTENKULTUR. Suppression der Stimulation durch Spenderantigen (S, oben), unbekanntes Alloantigen (HS, mitte) und unspezifisches Mitogen (PHA-M, unten) bei Zugabe von isolierte CD25+
Lymphozyten in den Verhältnissen 1:7 und 1:70. [LZÜ n=4; Abstoßer n=4;
x±SEM]¯
5.1 Versuchsmodell
Die Verhinderung von Abstoßungsreaktionen und die Induktion einer spenderspezifischen Transplantattoleranz sind zwei verwandte, aber dennoch zu unterscheidende Phänomene. Beide sollten immunologisch getrennt voneinander betrachtet werden (GIANELLO U. SACHS, 1996).
Dies ist nur im Tiermodell möglich, denn in der Klinik stehen alle Transplantatempfänger unter dauerhafter immunsuppressiver Medikation.
Zahlreiche Tiermodelle zur Lungentransplantation sind in der Literatur beschrieben. In Nagern sind viele Toleranzinduktionsprotokolle erfolgreich (OKADA ET AL., 1998; YASUFUKU ET AL., 2001; SHIRAISHI ET AL., 2002; WEKERLE ET AL., 2002; CHALERMSKULRAT ET AL., 2006).
Deren Einsatz in der Klinik jedoch scheitert in den meisten Fällen bereits durch eine fehlende Übertragbarkeit auf Großtiermodelle. Als klinisch übertragbar beschreibt Haverich (HAVERICH ET AL., 1986) sowohl die bilaterale als auch die Einzellungentransplantation bei Hunden und Primaten. Beide sind allerdings sehr aufwendig und kostenintensiv in der Durchführung. Sie sind mit einer hohen perioperativen Mortalität belastet (HOYER ET AL., 1980), außerdem ist unter Tierschutz- und Tierhaltungsgesichtspunkten die Verwendung von Primaten, aber auch Hunden, erschwert. Bedeutende Vorteile sprechen hier für die Verwendung von Schweinen (MCKENZIE, 1996; TUMBLESON U. SCHOOK, 1996). Aufgrund ihrer Zuchteigenschaften sind größere Gruppen von Tieren vergleichbaren Alters, Gewichts und genetischer Ausstattung erhältlich. Entscheidender Vorteil gegenüber Versuchsmodellen an Mäusen und Ratten ist, dass das Schwein sowohl in seiner Immunologie als auch kardiopulmonalen Physiologie dem Menschen nahe steht (MCKENZIE, 1996) und daher als präklinisches Modell geeignet ist.
In diesem Versuchsaufbau wurden pro Operation zwei Tiere benötigt, da kein Austausch der linken Lungen von weiblichen und männlichen Schweinen erfolgte, sondern die Eber nach der Lungenentnahme getötet wurden. Die Begründung hierfür liegt zum einen in der Operationsmethode: Die Naht der Bronchusanastomose erfolgt in teleskopierender Technik.
Um dabei eine möglichst großzügige Überlappung von Spender- und Empfängerbronchus zu erreichen, ist eine Absetzung des Spenderbronchus möglichst nahe der Bifurcatio tracheae, auf Empfängerseite jedoch eine tracheaferne Durchtrennung des Bronchus principalis nötig.
Gleiches gilt für die Operationstechnik an der venösen linksatrialen Vorhofanastomose.
Dies macht eine wechselseitige Transplantation unmöglich. Zum anderen ist die Art des Geschlechtsmismatchs am Transplantatüberleben beteiligt: Die Immunreaktion weiblicher Empfänger auf männliche Spenderlungen ist in der Regel schwerer als im umgekehrten Fall (ROBERTS ET AL., 2004). Die hier gewählten Spender-Empfängerpaare stellten eine Konstellation dar, die bewusst gewählt wurde, um Toleranz unter möglichst ungünstigen Bedingungen zu induzieren. Dies erleichtert auch eine spätere Übertragung in die Klinik, denn aufgrund der stetig abnehmenden Zahl verfügbarer Spenderlungen ist es heute nicht immer möglich, eine optimale Verpaarung von Spender und Empfänger vorzunehmen.
Alle Spender-Empfängerpaare waren MHC I inkompatibel. Aber nicht nur das Vorhandensein, sondern auch der Grad des MHC Mismatchs hat erheblichen Einfluss auf das Transplantatüberleben (HARJULA ET AL., 1987; GIANELLO U. SACHS, 1996). Deshalb wurden die Tiere im Rahmen der Operationsplanung einer weitreichenden Typisierung auf porcine MHC I Allele unterzogen (741110, DC12, DC45, DC80, DC89, FJ13W9, FJ33W12, HO4, W12, untersucht in der Vet. Med. Univ. Kopenhagen) und anschließend nach größtmöglicher MHC I Inkompatibilität verpaart. Bei nierentransplantierten Minipigs reicht jedoch ein gematchter MHC Locus aus, um eine Transplantattoleranz zu erzeugen.
Als besonders erfolgreich wird dabei das MHC II Matching beschrieben (GIANELLO U. SACHS, 1996). Retrospektiv wurden deshalb wie unter 3.2.2 beschrieben exemplarisch vier langzeitüberlebende Tiere für das MHC II Antigen SLA II-DQB typisiert. Alle Spender-Empfängerpaare wiesen dabei Unterschiede in 16 bis 18 Basenpaaren auf. Auch wenn diese Unterschiede keine Aussagen zur Vollständigkeit der MHC II Inkompatibilität zulassen, belegen sie dennoch eine genetische Vielfalt in der verwendeten Schweinepopulation.
Somit kann also ein verlängertes Transplantatüberleben aufgrund ungewollter Inzucht der Spender-Empfängerpaare weitestgehend ausgeschlossen werden.
Die verwendeten Spenderorgane sind in experimentellen Modellen in der Regel ideal, d.h.
von jungen, gesunden Tieren, deren Vorgeschichte mit dem klinischen Organspender nicht vergleichbar ist. Diese Organe weisen sehr heterogene Vorschädigungen durch Lungenödeme, hirntodinduzierte neurohormonelle Dysregulation, Emphyseme, pulmonale Hypertonien, Lungenembolien, Kontusionen als Folge von Unfällen oder beatmungsinduzierte Pneumonien auf (GOTTLIEB ET AL., 2004). Die Verwendung idealer Organe dient zwar der Erzeugung konsistenter Versuchsergebnisse, entspricht jedoch nicht den Verhältnissen bei klinischen Organspenden.
Die Verwendung von Tieren mit unterschiedlichen einleitenden Protokollen beinhaltet die Möglichkeit, dass bei den einzelnen Tieren unterschiedliche Gründe für die Transplantattoleranz vorliegen. Insbesondere bei Tieren mit spenderspezifischer Zelltransfusion
ist die Beteiligung eines toleranzinduzierenden Chimärismus möglich. Die Untersuchung auf CD4+CD25+ Tregs wurde ohne Berücksichtigung der einleitenden Protokolle angefertigt, woraus größere Unterschiede innerhalb der Gruppen und damit höheren Standardabweichungen resultieren.
In beiden Gruppen wurde ein Teil der Tiere einer immunsuppressiven Bestrahlungstherapie unterzogen, wodurch sämtliche Zellen des peripheren Blutes eine deutliche Reduktion erfuhren.
Für eine aussagekräftige Auswertung der Blutbilder, sowie der absoluten Zellzahlen war es daher von essentieller Bedeutung, dass die Anteile an bestrahlten und nicht bestrahlten Tieren in beiden Gruppen annähernd gleich waren. Dies wurde durch die Auswahl von 6 bestrahlten (60 %) und 4 unbestrahlten (40 %) für die Langzeitüberlebergruppe, sowie 12 bestrahlten (57 %) und 9 unbestrahlten (43 %) in der Abstoßergruppe gewährleistet. Die gleichzeitige Auswertung der Werte aller Tiere innerhalb einer Gruppe resultierte wiederum in höheren Standardabweichungen. Dieser Versuchsansatz wurde bewusst so gewählt, denn die bisherigen Untersuchungen im Rahmen des Projekts verdeutlichen, dass durch kein Protokoll die konsistente Erzeugung von LZÜ möglich war, das Transplantatüberleben also nicht ausschließlich vom Induktionsregime abhängig ist. Deshalb sollte im Rahmen dieser Doktorarbeit nach Faktoren gesucht werden, die Tieren aus verschiedensten Gruppen, aber mit ähnlichem Transplantatüberleben, gemeinsam sind.