3.6.1 Blutentnahme
Innerhalb der ersten 28 Tage nach Transplantation erfolgte die Blutabnahme über den Venenverweilkatheter zu den in Abb. 3.3 angegebenen Zeitpunkten. Bei Bedarf passte man die Probenintervalle individuell an. Nach Katheterexplantation wurde zu den Röntgenterminen am narkotisierten Tier der Venenwinkel zwischen Vena jugularis externa und interna punktiert.
Die Probennahme beinhaltete 2 ml heparinisiertes Vollblut zur Blutgasbestimmung sowie 3x20 ml heparinisiertes Vollblut für die internen Laboruntersuchungen (siehe 3.8) mit einem Heparingehalt (LiqueminR Roche Pharma, Reinach, Schweiz) von 40 internationalen Einheiten (IU) pro ml Blut. Zudem entnahm man 1,5 ml EDTA-Blut für das Differentialblutbild sowie 1 ml Serum zur Bestimmung der Nierenparameter.
Die zentralvenöse Blutgasmessung (AVL OMNI Modular System, Graz, Österreich) diente der Kontrolle der kardiopulmonalen Funktion über den Sauerstoffpartialdruck und die Sauerstoffsättigung. Die Differentialzellbilder wurden in der Klinik für Kleine Klauentiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover manuell erstellt. Hier waren vor allem Leukozytenzahl und Verschiebungen der Leukozytenfraktionen sowie die Thrombozytenzahl von Interesse.
Die photometrische Bestimmung von Harnstoff- und Kreatininspiegeln (Klinik für Kleine Klauentiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover) ermöglichte die frühzeitige Diagnostik von Nierenschäden infolge nephrotoxischer Nebenwirkungen der immunsuppressiven Therapie.
Eosinophilie im peripheren Blut ist ein früher und spezifischer Marker für die Abstoßung von Nieren- und Lebertransplantaten (TRULL ET AL., 1998). Auch in Herz- und Lungentransplantierten besteht ein signifikanter Zusammenhang zwischen erhöhten Zahlen eosinophiler Granulozyten und beginnender akuter Abstoßung (YOUSEM, 1992; TRULL ET AL., 1998). Eine Lymphozytose ist bereits in der beginnenden vaskulären Phase feststellbar, also zu einem Zeitpunkt, an dem noch keine auffälligen Gewebeschäden sichtbar sind.
Damit gibt das Differentialblutbild schon sehr früh erste Hinweise auf eine beginnende
Abbildung 3.3: BLUTABNAHME INNERHALB DER ERSTEN 28 POSTOPERATIVEN TAGE
(POD). Differentialzellbilder (Diff) dienten der frühen diagnostischen Abgrenzung von Entzündung und akuter Abstoßung. Eine regelmäßige Kontrolle der Immunsuppressivaspiegel (IS) ermöglichte die Einstellung auf einem konstanten Level. Nierenparameter (NP) wurden zur Erkennung nephrotoxischer Nebenwirkungen der immunsuppressiven Medikation erhoben.
Die internen Laboruntersuchungen beinhalteten durchflusszytometrische Analysen (FACS) sowie die gemischte Lymphozytenkultur (MLR).
Akutabstoßung, wesentlich früher als das Röntgenbild, etwa zeitgleich mit der BAL und nur geringgradig später als die Histologie (WESTRA ET AL., 1991). Diese Tatsache macht es zu einem wichtigen Parameter in der Diagnose akuter Abstoßungen.
3.6.2 Röntgenologische Untersuchung des Thorax (RöTx)
An folgenden postoperativen Tagen (POD) wurden Röntgenaufnahmen des Thorax (Rotalix tube housing ROT 350 10, Phillips Deutschland) angefertigt, um das Transplantat im Seitenvergleich mit der nativen Lunge darzustellen: POD 7, 28, 42, 70, 90, im Anschluss daran alle 6 Wochen oder bei klinisch auffälligen Schweinen. Um eine möglichst objektive Bewertung zu gewährleisten, wurde die Ausprägung vorhandener Verschattungen anhand einer Skala von 0 (vollständige seitengleiche Belüftung) bis 4 (homogene Verschattung der linken Lunge bei unveränderter rechter Lunge) eingestuft. Die Bewertung nahm ein unabhängiger Gutachter (Dr.
Jost Niedermeyer, Abt. Pneumologie der MHH) vor.
Häufig korrelieren röntgenologische Befunde mit dem klinischen Status des Patienten nach Lungentransplantation. Verschattungen im Transplantat sind vor allem in fortgeschrittenen Stadien von Abstoßungsreaktionen deutliche Hinweise. Die röntgenologische Darstellung des Thorax im perioperativen Zeitraum und im Folgeverlauf ermöglicht auch die Diagnose von
Komplikationen (Pleuraerguss, Pneumothorax), die durch invasive Maßnahmen, also iatrogen, entstehen (SCHMIDT ET AL., 1994).
3.6.3 Bronchoskopie
Zu den Röngtenzeitpunkten erfolgte eine bronchoskopische Untersuchung der Lunge mittels eines Olympus P10 Kinderbronchoskops mit einer Olympus CLK-3 Kaltlichtquelle (Olympus, Tokio, Japan). Über den Beatmungstubus wurde das Bronchoskop eingeführt um das makroskopische Erscheinungsbild (Farbe, Oberflächenbeschaffenheit und Flüssigkeitsansammlung) der Lungen im Seitenvergleich nach den Kriterien zu bewerten. Des Weiteren konnten so endobronchiale Verlegungen durch Sekret oder Blutkoagel abgesaugt werden.
Bei lungentransplantierten Patienten ist es möglich, das Transplantat mit wenig invasivem Aufwand direkt in Augenschein zu nehmen. Während einer bronchoskopischen Untersuchung werden die Suffizienz der Bronchusanastomose sowie die Vitalität der Transplantatschleimhaut beurteilt. Außerdem dient sie der Entnahme von bronchoalveolärer Lavage (BAL) und transbronchialer Biopsien (TBB). Diese sind in der frühzeitigen Diagnose von Lungenentzündungen und akuten Abstoßungsreaktionen wichtige Methoden (ZANNINI ET AL., 1993).
3.6.4 Bronchoalveoläre Lavage (BAL)
Im Rahmen der Bronchoskopie wurde eine BAL in Lingulaposition, d.h. im linken Oberlappen (Pars caudalis lobi cranialis), entnommen. Insgesamt erfolgte dabei die Instillation von 6x20 ml körperwarmer 0,9 % NaCl-Lösung (Maco Pharma Internat. GmbH, Langen, Deutschland).
Jedes Aliquot wurde, um ein Kollabieren des Lungensegments zu verhindern, separat vorsichtig aspiriert und aufgefangen. Nach Verwerfen der ersten 20 ml standen, abhängig vom Reflux, insgesamt 80-100 ml bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit (BALF) für die Analysen zur Verfügung. Die Pneumologie der Medizinischen Hochschule Hannover erstellte mittels Standardtechniken ein manuelles Differentialzellbild, des Weiteren wurden die Lymphozyten der BALF durchflusszytometrisch untersucht. Regelmäßige mikrobiologische Untersuchungen dienten dem Ausschluss von Pneumonien.
Die BALF eines gesunden, nicht transplantierten Patienten hat bei individuell variabler absoluter Zellzahl eine charakteristische prozentuale Zusammensetzung der Zellpopulationen.
Makrophagen machen mit 81,4-90,1 % den überwiegenden Anteil aus, 8,1-16,4 % sind Lymphozyten, 0,7-2,7 % neutrophile Granulozyten, bis zu 2 % eosinophile Granulozyten
und weniger als 2 % Epithelzellen (SUTINEN ET AL., 1995). Erhöhte absolute Zellzahlen und Neutrophilien in den ersten drei Monaten nach Lungentransplantation lassen sich vor dem Hintergrund einer Interaktion immunkompetenter Spender- und Empfängerzellen sowie einer Schädigung des Transplantats im Rahmen der Operation erklären (neutrophile Alveolitis) (ZEEVI ET AL., 1985; TIROKE ET AL., 1999). In Phasen akuter Abstoßung steigt aber neben der absoluten Zellzahl vor allem der Anteil an Lymphozyten (YAGYU U. FURUSE, 1992) und eosinophilen Granulozyten (YOUSEM, 1992). Erhöhte Zahlen an neutrophilen Granulozyten sind mit chronischen Abstoßungsreaktionen (BOS) oder bakterielle Pneumonien, wobei letztere durch mikrobiologische Untersuchungen ausgeschlossen werden können (WARD ET AL., 1998;
TIKKANEN ET AL., 2001).
Neben morphologischen Abweichungen entwickeln sich im Rahmen postoperativer Komplikationen auch phänotypische Veränderungen im Zellbild, die durchflusszytometrisch messbar sind. Von Interesse sind dabei T-Helferzellen (CD4+) und T-Effektor-Zellen (CD8+). Im Vergleich zum Blut ist in der BALF der Anteil der CD4+ Lymphozyten geringer, hier sind CD8+ T-Zellen die dominierende Lymphozytenpopulation. Im Falle akuter Abstoßungsreaktionen erhöht sich der prozentuale Anteil der CD8+ T-Zellen gegenüber dem Normwert weiter (WHITEHEAD ET AL., 1995; CRIM ET AL., 1996).
3.6.5 Transbronchiale Biopsie (TBB)
Bei Auftreten akuter Abstoßungsreaktionen infiltrieren Lymphozyten und Plasmazellen das perivaskuläre und peribronchiale Lungengewebe. Die histologische Ausdehnung der akuten Abstoßungsreaktion ist frühzeitig an der hoch spezifischen zellulären Infiltration des Transplantats erkennbar. Deshalb ist die TBB der Goldstandard in der Diagnose der akuten Abstoßung (TIKKANEN ET AL., 2001). 1990 wurde von der International Society for Heart and Lung Transplantation (ISHLT) ein einheitliches Bewertungsschema für die Histologie der pulmonalen Transplantatabstoßung eingeführt, um die Zusammenarbeit und die Kommunikation zwischen Klinik und Pathologie zu erleichtern. Dieses ISHLT-Grading ist in seiner 1995 überarbeiteten Form bis heute gültig (YOUSEM ET AL., 1996).
Die histologische Klassifikation der akuten Abstoßung basiert auf der Präsenz perivaskulärer und interstitieller mononukleärer Zellinfiltrate. Die Menge der mononukleären Zellen, die die Blutgefäße umgeben, lässt Rückschlüsse auf den Schweregrad der Reaktion zu, denn bei fortgeschrittener Abstoßung infiltrieren die Zellen auch die angrenzenden Alveolarsepten. Die Klassifikation erfolgt, international einheitlich, anhand des folgenden Bewertungsschemas:
In Grad A0 (keine akute Abstoßung) ist das Lungenparenchym im histologischen Präparat frei von mononukleären Infiltraten, Hämorrhagien oder Nekrosen. Eine minimale akute
Abstoßung (A1) ist gekennzeichnet durch vereinzelte perivaskuläre Ringe aus Lymphozyten und plasmazytoiden Zellen. Sie sind, im Gegensatz zur milden akuten Abstoßung (A2), in kleinen Vergrößerungen (40 x) mikroskopisch nicht sichtbar. Im Stadium A2 ist das Lungenendothel bereits hyperplastisch oder regenerativ verändert („Endotheliasis“).
Entzündungszellen infiltrieren das perivaskuläre Interstitium (vaskuläre Phase), allerdings befinden sich noch keine mononukleären Zellen in den Alveolarsepten oder den Alveolen. In der Phase der moderaten akuten Abstoßung (A3) umgeben breite Schichten mononukleärer Zellen die Blutgefäße, eosinophile und neutrophile Granulozyten infiltrieren die perivaskulären und peribronchialen Alveolarsepten und Alveolen (alveoläre Phase). Im Endstadium, der schweren akuten Abstoßung (A4) befinden sich diffuse mononukleäre Infiltrate um die Blutgefäße, im Interstitium und in den Alveolen. Ausgedehnte Pneumozytenschäden sind sichtbar, einhergehend mit Parenchymnekrosen, Hämorrhagien und Neutrophilien.
Im Rahmen der Bronchoskopie wurden mittels einer Biopsiezange (FB-19C, Olympus, Tokio, Japan) 3-5 transbronchiale Biopsien (TBB) aus dem Ober- und Unterlappen der linken Lunge entnommen und nach Formalinfixierung und HE-Färbung im Pathologischen Institut der MHH von einem unabhängigen Gutachter (Dr. Florian Länger, Pathologie der MHH) nach der Yousom Skala der ISHLT beurteilt (siehe??).
Bei thrombozytopenischen bestrahlten Tieren (<100.000 Thrombozyten/µl Vollblut) wurde die Entnahme von BAL und TBB auf einen späteren Zeitpunkt verschoben.
3.6.6 Elektive Euthanasie
Eine einseitige Verschattung im Röntgenbild≥L3, die histologisch nachgewiesene Abstoßung in der TBB (A2-A4), Lymphozytose (Blut >16 G/l, BAL >17 %) und/oder Eosinophilie (Blut >1,3 G/l, BAL >3 %) sowie stark eingeschränktes Allgemeinbefinden waren Parameter, die zur Entscheidung für eine elektive Euthanasie herangezogen wurden. Die Schweine wurden mit 0,1 mg/kg KM Tiletamin und 0,1 mg/kg KM Zolazepam sediert und nach vollständiger Blutprobennahme (8x20 ml heparinisiertes Vollblut, Serum, EDTA, Blutgase) mit einer intravenösen Sturzinjektion von 1ml/kg KM Pentobarbital (Eutha 77 ad us. vet.[N]
Injektionslösung, A. Ziegler AG, Sellenbüren, Schweiz) getötet.
3.6.7 Autopsie
Nach der äußeren Begutachtung des Tiers wurde unter sterilen Bedingungen eine Autopsie vorgenommen. Einer medianen Sternotomie folgte die Darstellung und Entnahme des Herz-Lungen-Paketes. Die Probennahme aus beiden Lungen erfolgte an 4 unterschiedlichen
Stellen pro Lungenlappen (2x2x2 cm große Gewebestücke). Nach Formalinfixierung wurden diese Präparate im Institut für Pathologie der MHH in Standardtechnik in Parafin eingebettet und HE gefärbt. Die Befundung erfolgte durch einen unabhängigen Gutachter (Dr. Florian Länger, Institut für Pathologie der MHH) nach den Kriterien der ISHLT wie unter 3.6.5 beschrieben. Nach medianer Eröffnung der Bauchhöhle erfolgte deren sorgfältige Exploration, da infolge der Immunsuppression eine erhöhte Tumorinzidenz besteht. Aus Leber, Milz und Niere wurden Proben oben genannter Größe entnommen. In Verdachtsfällen weitete man die Probenentnahme auf auffällige Organe aus.