Medizinischen Hochschule Hannover
Leptin induzierte Modulation der NK-Zell Migration und Aktivität bei normalgewichtigen und diät-induziert adipösen Ratten
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Matthias Hopfe aus Hannover
Hannover 2007
25.03.2009
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann Betreuer: Prof. Dr. Heike Nave
Referent: Prof. Dr. Anne Jörns
Koreferent: PD Dr. med. Matthias Bahr
Tag der mündlichen Prüfung: 25.03.2009
Promotionsausschussmitglieder:
Prof. Dr. Ernst Ungewickell PD Dr. Peter Claus
Prof. Dr. Roland Jacobs
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung... 1
1.1 Leptin... 1
1.2 Leptinrezeptoren (Ob-R)... 1
1.3 Die Funktion des Leptins... 3
1.4 Zielsetzung der Arbeit...... 11
2 Material und Methoden... 12
2.1 Versuchstiere und Haltung... 12
2.2 Implantation eines Venenkatheters in die Vena jugularis externa... 12
2.2.1 Operationsverfahren……… 12
2.2.2 Aufhängeapparat... 14
2.2.3 Pflege des Kathetersystems und postoperative Betreuung der Tiere…... 14
2.3 Versuchsdurchführung, Blutentnahme, Perfusion und Organentnahme…... 15
2.4 Immunologische Untersuchungen………... 16
2.4.1 Durchflusszytometer/Flourescence activated cell sorter (FACS)... 16
2.4.2 Immunhistologie... 17
2.4.3 NK-Zell-Zytotoxizitätstest (NK-Zell-Assay)... 18
2.5 Histologische Auswertung………... 19
2.6 Statistische Auswertung…... 20
3 Ergebnisse... 21
3.1 Quantitative Auswertung der Leukozytenpopulationen im peripheren Blut…... 21
3.1.1 Leukozyten……….…. 21
3.1.2 Granulozyten... 22
3.1.3 B-Lymphozyten... 23
3.1.4 T-Lymphozyten………... 24
3.1.4.1 T-Lymphozyten – Insgesamt……….. 24
3.1.4.2 CD4+ T-Lymphozyten... 25
3.1.4.3 CD8+ T-Lymphozyten... 26
3.1.5 Monozyten………..………..………….. 27
3.1.5.1 ED9+ W3/25+ 10/78+Monozyten ………...…… 28
3.1.6 NK-Zellen……….. 29
3.2 Quantitative, immunhistologische Untersuchung der NK-Zellpopulation in verschiedenen Organen……….. 30
3.2.1 Leber……….. 30
3.2.2 Lunge………... 32
3.2.3 Milz……… 34
3.3 Quantitative Darstellung der NK-Zellaktivität in Lunge, Milz und dem peripheren Blut………... 36
3.3.1 NK-Zellaktivität in der Lunge……… 36
3.3.2 NK-Zellaktivität in der Milz……….. 37
3.3.3 NK-Zellaktivität im peripheren Blut……….. 38
4 Diskussion... 39
5 Zusammenfassung... 48
6 Literaturverzeichnis... 49
7 Lebenslauf... 64
8 Erklärung... 65
9 Danksagung... 66
1 Einleitung 1.1 Leptin
Leptin (griechisch λεπτοσ, Leptos, dünn) ist ein 16-kDa großes Peptidhormon und Produkt des obese (ob) Gens, welches auf dem Chromosom 7 lokalisiert ist und aus 3 Exons und 2 Introns besteht. Das humane Leptin ist zu 84 % homolog mit dem der Maus. Die Codierungssequenz für die Leptin mRNA liegt auf dem zweiten und dritten Exon und umfasst 167 Aminosäuren, an deren terminalen Ende eine 21 aminosäurengroße Signalsequenz lokalisiert ist [Zhang et al. 1994].
Die Struktur des Proteins besteht aus vier α-helikalen Teilen und wird strukturell zu der Familie der langkettigen Zytokine gezählt, wie auch Interleukin (IL) 2, 3, 4, 5, 6, 10, 15, Erythropoetin, Granulocyten colony-stimulating factors (G-CSF), Wachstumshormon und Leukämie- Inhibitor Faktor (LIF). Am nächsten steht Leptin innerhalb dieser Familie jedoch dem IL-6, weil die helikalen Anteile des Peptidhormons sowohl lang- als auch kurzkettig sind [Ouyang & He 2003].
Die Expression des Leptin-Gens und anschließende Sekretion findet hauptsächlich im weißen Fettgewebe statt, wobei sie im subkutanen Fettgewebe höher ist als im viszeralen [Hube et al.
1996; Lonnqvist et al. 1997; Montague et al. 1997a] und bei Frauen um das zwei- bis dreifache höher als bei Männern mit gleichem Body-Mass-Index (BMI) [Maffei et al. 1995;
Considine et al. 1996]. Auch in anderen Geweben, wie in den Epithelzellen der Brustdrüsen [Chilliard et al. 2001], in der Mukosa der Magenschleimhaut [Bado et al. 1998], in Muskelzellen [Wang et al. 1998], der Plazenta [Senaris et al. 1997], im Testis, den Ovarien [Hoggard et al. 1997] sowie der Leber [Brabant et al. 2004] konnte die Synthese und Sekretion von Leptin in adulten Tieren nachgewiesen werden.
1.2 Leptinrezeptoren (Ob-R) Isoformen
Das Leptinrezeptorgen wurde erstmals 1995 im Plexus choroideus einer Maus auf dem Chromosom 4 entdeckt [Tartaglia et al. 1995]. Das humane Ob-R Gen ist dagegen auf dem Chromosom 1q31 lokalisiert und besteht aus 20 Exons [Hiroike et al. 2000]. Es codiert für sechs alternative Splicing- Formen (Ob-Ra-e) [Lee et al. 1996]. Diese Leptinrezeptorisoformen gehören zu der Suprafamilie der Zytokin Klasse I Rezeptoren und sind den Rezeptoren für IL-6, G-CSF und LIF im Glykoprotein 130, das als signaltransduzierende Untereinheit dient, sehr ähnlich. Alle Isoformen haben einen
identischen N-terminalen Liganden-Bindungsbereich, unterscheiden sich aber in der C- terminalen Region. Während die Ob-Ra, Ob-Rb, Ob-Rc und Ob-Rd Rezeptorisoformen eine kurze transmembranöse Region enthalten, fehlt diese beim Ob-Re [Zhang et al. 2005]. Im Jahre 1996 haben Wang et al. die kurze Rezeptorisoform Ob-Rf in der Ratte entdeckt, die im Unterschied zu den anderen kurzen Ob-R vor allem in der Leber und Milz vorkommt.
Diese strukturellen Unterschiede der verschiedenen Isoformen drücken sich in einer unterschiedlichen Funktionalität aus, wie nachfolgend gezeigt wird.
Die langkettige Leptinrezeptorisoform (Ob-Rb)
Die längste Form der Leptinrezeptoren wird hauptsächlich im Hypothalamus exprimiert.
Besonders im Nucleus (Ncl.) arcuatus, Ncl. ventromediale, Ncl. paraventriculare, Ncl.
dorsomediale, Ncl. ventropremammillare, sowie in lateralen Hypothalamusbereichen [Mercer et al. 1996; Fei et al. 1997]. Hier ist der Ob-Rb als Bindungsstelle für den Liganden Leptin essentiell für die Energiehomöostase [Zhang et al. 2005], die Gewichts- [Lee et al. 1996] und Thermoregulation [Zarjevski et al. 1993]. Aber auch in der Leber, peripheren Geweben, Muskeln, Herz, Nebennieren, Nieren, β-Zellen des Pankreas, Fettzellen, sowie Immunzellen [Kamohara et al. 1997; Auwerx & Staels 1998; Brabant et al. 2005] wird der Ob-Rb exprimiert.
Strukturell besitzt der Ob-Rb zusätzlich zur extrazellulären- und der kurzen hydrophoben transmembranösen Domäne eine aus 302 Aminosäuren bestehende intrazelluläre Domäne, an welcher zwei Sequenzen, Box1 und Box2, enthalten sind. Diese dienen zur Interaktion mit den Januskinasen (JAKs), Signalüberträgern, sowie dem Transkriptionsaktivator (STAT) [Lee et al. 1996]. Bindet Leptin an den Ob-Rb, kommt es zu einer Rekrutierung und Aktivierung von JAK 2. Diese befindet sich in der Nähe der intrazellulären Domäne und phosphoryliert ihrerseits den Tyrosinrest (Tyr1138) innerhalb der intrazellulären Domäne, was die Bindung von STAT 3 möglich macht [Zhang et al. 2005]. Folgend kommt es zu einer erneuten Phosphorylierung, Dimerisierung und anschließenden Translokation in den Nucleus und zur anschließenden Transkription der Zielgene. Obwohl diese JAK/STAT Signalkaskade die zentrale Rolle beim Ob-Rb Signaltransduktionsweg spielt, gibt es noch andere leptinvermittelte Kaskaden, wie die mitogen aktivierte Protein Kinase (MAPK), die Phosphatidylinositol-3-Kinase und die AMP aktivierende Protein Kinase, welche hier aber nur namentlich erwähnt werden sollen [Zhang et al. 2005].
Die kurzen Leptinrezeptorisoformen
Die kurzen Leptinrezeptoren Ob-Ra, Ob-Rc und Ob-Rd haben - genauso wie der Ob-Rb - eine intrazelluläre Domäne, welche allerdings aus 34 Aminosäuren besteht und nur die Sequenz der ersten Box aufweist. Sie sind somit nicht zur STAT-Aktivierung fähig, wohl aber zur MAPK-Kaskade [Bjørbæk et al. 1997]. Exprimiert werden diese Formen im Plexus choroideus, der Lunge und den Nieren. Sie sind aber auch in anderen Geweben nachweisbar [Tartaglia et al. 1995; Ghilardi et al. 1996]. Vor einigen Jahren konnte gezeigt werden, dass es eine erhöhte Expression von Ob-Ra in den cerebralen Mikrogefäßen gab, weshalb man heutzutage davon ausgeht, dass die beschriebene Isoform als Leptintransporter über die Blut- Hirn-Schranke dient [Bjørbæk et al. 1998a]. Eine weitere Aufgabe der kurzen Isoformen ist die Clearance von Leptin.
Die Clearance zu verzögern und das zur Verfügung stehende Leptin in der Blutzirkulation zu erhöhen, könnte die Funktion des Ob-Re sein. Er wird in peripheren Geweben, wie der Lunge, Leber, Niere, Dünndarm, Milz, Hoden, Magen, Herz und Fettgewebe in unterschiedlichen Konzentrationen exprimiert [Takaya et al. 1996], wobei es zu einer Feedback-Regulation mit Leptin kommt. Der Ob-Re besitzt, wie oben erwähnt, nur einen extrazellulären Teil, auf welcher eine leptinbindende Subdomäne lokalisiert ist, mit der sowohl Leptin im subkutanen Fettgewebe [Brabant et al. 2002], als auch frei zirkulierendes Leptin im Plasma an den Resten 323-640 gebunden werden kann [Fong et al. 1998; Zastrow et al. 2003]. Die Expression von Leptin korreliert signifikant mit dem BMI, wohingegen es sich beim Ob-Re genau umgekehrt verhält. Das lässt darauf schließen, dass eine erniedrigte Ob-Re Sekretion bzw. eine erniedrigte Konzentration an gebundenem Leptin ein Marker für eine Leptinresistenz darstellt [Brabant et al. 2002; Sandhofer et al. 2003; Misra et al. 2004].
1.3 Die Funktion des Leptins
Leptin hat zahlreiche zentrale- und periphere Effekte auf den Organismus, von denen hier nur einige wichtige genannt werden sollen. Zu den zentralen Funktionen gehören die Energiehomöostase und die Thermoregulation. In der Peripherie hat Leptin u.a. einen Einfluss auf den Fettstoffwechsel. So stimuliert es über einen auto- oder parakrinen Signalweg die Lipolyse von weißem Fettgewebe, es reguliert die Expression von Enzymen der β-Oxidation sowie den intrazellulären Triglyceridgehalt von Adipozyten [Fruhbeck et al. 1997; Muoio et al. 1997; Zhou et al. 1997]. Zudem spielt Leptin eine wichtige Rolle bei der Sekretion und Aktion von Insulin in der Hämatopoese und dem Immunsystem [Machteld et al. 2000;
Brabant et al. 2005].
Im Folgenden soll nun auf zwei Funktionen genauer eingegangen werden. Auf die vielleicht bisher am besten bekannteste Funktion des Leptins, der Gewichtsregulation und auf die für diese Arbeit besonders interessante Wirkung des Leptin auf das Immunsystem - speziell auf die natürlichen Killerzellen (NK-Zellen).
Gewichtsregulation durch Leptin
Die Steuerung der Gewichtsregulation geschieht im Hypothalamus. In dieser Region lagert sich Leptin an den hier stark exprimierten Ob-Rb Rezeptor an. Es kommt nachfolgend zur Aktivierung des JAK/STAT Signalweges, wie oben beschrieben. Dies führt anschließend zu einer Inhibition von appetitanregenden Neuropeptiden, wie dem Neuropeptid Y (NPY) und dem Agouti-Related Peptid [Kristensen et al. 1998] sowie zu einer Hochregulation der Expression von appetitzügelnden Neuropeptiden. Hierzu gehören das in der Adenohypophyse produzierte Proopiomelanocortin (POMC) sowie das kokain- und amphetaminregulierte Transkript, welches reichlich in den hypothalamischen Nuclei vorhanden ist [Kristensen et al.
1998].
Die entscheidende Rolle in der Gewichtsregulation spielt das NPY. Es wird im Ncl. arcuatus exprimiert und stimuliert die Nahrungsaufnahme, senkt die Thermogenese [Zarjevski et al.
1993] und ist der bis heute wichtigste Antagonist des Leptins. In diesem Zusammenhang konnte vor einigen Jahren gezeigt werden, dass eine intracerebroventrikuläre Bolusinjektion von Leptin bei dünnen Ratten eine Senkung der Sekretion von NPY im Ncl. arcuatus zur Folge hatte, welche mit einem Gewichtsverlust einherging [Cusin et al. 1996].
Die Adipositas ist definiert als ein Überschuss an körpereigenem Fett [Pi-Sunyer FX et al. 1999].
An ihr leiden global etwa 310 Millionen Menschen mit steigender Tendenz [International Obesity Task Force 2004]. Zur Klassifikation von Körperfett wird der so genannte BMI genutzt. Er ist definiert als Köpergewicht in Kilogramm, dividiert durch die Köpergröße zum Quadrat [Garrow & Webster 1985]. Die World
Health Organisation (WHO) teilt die Ernährungszustände basierend auf dem BMI in folgende Klassen ein (siehe Tabelle 1).
Es zeigte sich, dass sowohl der prozentuale Anteil an Körperfett [Zumoff et al. 1990;
Gallagher et al. 1996], als auch ein Anstieg der Morbidität und Mortalität in zahlreichen Klassifikation BMI (kg/m2) Normalgewicht 18,5 – 24,9 Übergewicht 25,0 – 24,9 Adipositas Grad I 30,0 – 34,9 Adipositas Grad II 35,0 – 34,9 Adipositas Grad III ≥ 40,0
Tabelle 1 :World Health Organisation (1998)
epidemiologischen Studien mit dem BMI korreliert [Lindsted et al., 1991; Manson et al. 1995;
Troiano et al. 1996; Allison et al. 1999b]. So ist ein Anstieg des viszeralen Fettgewebes mit Ansammlung in Leber, Pankreas und Muskeln stark assoziiert mit metabolischen Komplikationen [Kissebah et al. 1982] wie Hypertension, koronarer Herzerkrankung (KHK), Dyslipidemie, Gallenblasenerkrankungen, Schlaganfällen und verschiedenen malignen Entartungen, wie zum Beispiel Prostata-, Kolon- oder Mammakarzinome [Pi- Sunyer et al.
1993; Must et al. 1999; U.S. Department of Health and Human Services 2001]. Auch der Diabetes mellitus Typ II kann eine Folge der Adipositas sein [Bray et al. 2003], wobei Männer [Chan et al., 1994] und Frauen [Colditz et al. 1995] gleichermaßen betroffen sind. So ist zum Beispiel an Hand der Nurses’ Health Study mit mehr als 114.000 registrierten Probandinnen über einen Zeitraum von 14 Jahren herausgefunden worden, dass die Gefahr bei Frauen mit einem Body-Mass-Index von ≥35 kg/m2 einen Diabetes mellitus Typ II zu entwickeln um das 93-fache größer ist, als bei Frauen mit einem BMI von <22 kg/m2 [Colditz et al. 1995].
Die Ätiologie der menschlichen Adipositas ist weitgehend ungeklärt [Pi-Sunyer FX. 1999].
Es hat sich inzwischen gezeigt, dass es eine positive Korrelation zwischen der bis zu vierfach erhöhten zirkulierenden Leptinkonzentration [Zhang et al. 1994] und der Adipositas bezogen auf den BMI gibt [Considine et al. 1996; Maffei et al. 1995]. Dies spiegelt sich in einer erhöhten Expression von Leptin-mRNA im Fettgewebe adipöser Patienten, im Vergleich zu Normalgewichtigen wider [Hamilton et al. 1995]. Trotz des erhöhten Leptinspiegels, welcher physiologisch einen Gewichtsverlust mit sich bringen sollte, konnte gezeigt werden, dass das Verhältnis zwischen cerebrospinalem Leptin und Serumleptin bei Adipösen zu Gunsten des Serumleptins verschoben war [Caro et al. 1996]. Diese relative Leptinresistenz könnte nach neueren Erkenntnissen ihre Ursache im Fettstoffwechsel haben. So zeigte eine Studie, dass Triglyceride den Transport von Leptin über die Blut-Hirn-Schranke direkt inhibieren [Banks et al. 2004].
Eine andere Ursache der relativen Leptinresistenz könnte ein Mangel an Ob-Re sein, weil das an Ob-Re gebundene Leptin die aktive Form des Leptins darstellen könnte. So führte eine starke Ob-Re-Expression in leptindefizienten Mäusen (ob/ob-Mäusen) - bei exogener Leptinapplikation - zu einer verstärkten Reduzierung der Nahrungsaufnahme und des Körpergewichts [Huang et al. 2001]. Es zeigte sich weiterhin, dass bei adipösen Probanden im Vergleich zu Normalgewichtigen ein signifikant erhöhter Leptinspiegel zu Gunsten von freiem Leptin (FL) beobachtet werden konnte [Sinha et al. 1996] welcher sich durch eine erhöhte Freisetzung durch das subkutane Fettgewebe darstellte [Brabant et al. 2002]. Die
Hypothese wurde unterstützt durch eine weitere Studie bei der adipöse Patienten eine hypokalorische Diät bekamen. Hier sank der zirkulierende Leptinspiegel genauso wie die Expression von Leptin-mRNA im Fettgewebe. Erhöhte man anschließend die Plasma-Leptin- Konzentration bei gleichzeitiger isokalorischer Ernährung, so konnte das reduzierte Gewicht gehalten werden [Maffei et al. 1995].
Auch Mutationen auf dem Leptingen [Montague et al. 1997b] oder dem Leptin-Rezeptor- Gen könnten eine mögliche Ursache für die Adipositas sein [Clément et al. 1998]. So zeigte eine Studie mit ob/ob-Mäusen und Mäusen mit einer Defizienz von Ob-Rb (db/db Mäusen), dass es bei Applikation von rekombinantem Leptin zu einer Normalisierung des Körpergewichts durch erniedrigte Nahrungsaufnahme und einen erhöhten Energieverbrauch bei ob/ob Mäusen kam, nicht aber bei den db/db Versuchstieren [Campfield et al. 1995].
Hintergrund der anhaltenden Fettleibigkeit bei den db/db-Mäusen könnte eine aus einem Defekt des hypothalamischen Ob-Rb herrührende absolute Leptinresistenz sein. Eine Mutation des db Gens führt zu einer abnormen Version dieses Rezeptors, mit Verlust der intrazellulären Domäne und einer daraus resultierenden Störung der Signaltransduktion [Chen et al.1996]. Eine weitere Möglichkeit, weshalb adipöse Menschen auf Leptin resistent reagieren, könnte eine Überaktivität von SOCS-3 (suppressor of cytokine signaling-3) im Ncl.
arcuatus und im Ncl. dorsomedialis sein [Bjørbæk et al. 1998b]. SOCS-3 ist ein intrazelluläres Protein mit der möglichen Funktion eines negativen Feedbackregulators auf das Leptinsignal [Bjørbæk et al. 1999], weil sich bei SOCS-3 knockout Mäusen eine Erhöhung der leptininduzierten hypothalamischen STAT 3 Tyrosinphosphorylation zeigte sowie eine Induktion von POMC. Diese biochemischen Veränderungen gingen mit Gewichtsverlust sowie einer reduzierten Nahrungsaufnahme einher [Mori et al. 2004]. Dennoch ist zu sagen, dass genetische Mutationen des Leptinsystems sehr selten sind [Maffei et al. 1995; Considine et al. 1996].
Einfluss von Leptin auf das Immunsystem
Neben der Funktion der Gewichtsregulation, kann Leptin auch ein Bindeglied zwischen dem Ernährungsstatus des Organismus und dem Immunsystem sein [Lord et al. 1998; Matarese 2000]. So zeigte sich bei unterernährten Kindern ein erniedrigter Leptinspiegel, welcher assoziiert war mit einer Suppression der lymphoproliferativen Funktion [Palacio et al. 2002].
Dies konnte ebenfalls bei ob/ob-Mäusen bestätigt werden, bei denen es zu einer Reduktion von T- und B-Zellen [Howard et al. 1999] sowie von hepatischen Natürlichen-Killer-T- (NKT-) Zellen [Guebre-Xabier et al. 2000] gekommen war. Umgekehrt führte eine
Gewichtserhöhung zu einem signifikanten Anstieg des zirkulierden Leptinspiegels und der TH1 Aktivität (aus einer CD4+ T-Helferzelle durch Stimulation hervorgehende Effektorzelle mit Sekretion von Interferon-γ, IL-2 und Tumor-Nekrose-Faktor-β (TNF-β) [Faggioni et al.
2000]. Es kann deshalb die Hypothese formuliert werden, dass eine erniedrigte Serumleptinkonzentration zu einer erhöhten Infektanfälligkeit mit reduzierter T-Helfer-Zell- Funktion und direkten Effekten auf die Thymusfunktion führt [Lord et al. 1998; Howard et al.
1999]. Generell ist zu sagen, dass Leptin die Proliferation, Differenzierung und Funktion von hämatopoetischen Zellen bewirken kann [Bennet et al. 1996]. Dies konnte in einer in νitro Studie gezeigt werden, in der es bei Applikation von rekombinaten humanem Leptin zur Proliferation von humanen peripheren mononukleären Zellen im Blut (PBMC) kam [Santos- Alvarez et al. 1999]. In diesem Zusammenhang ist es wichtig zu erwähnen, dass lymphatische Organe, wie Knochenmark, Thymus und Lymphknoten alle Kontakt mit dem Fettgewebe haben, dessen in situ Leptinsekretion einen unterstützenden Einfluss auf die T- Zellhomöostase und die proinflammatorische Immunantwort hat [Matarese et al. 2002]. Dies konnte bei ob/ob-Mäusen und db/db-Mäusen verdeutlicht werden. Durch ihre Leptin- bzw.
Leptinrezeptor-Defizienz-induzierte Fettleibigkeit wiesen sie eine Thymus- und Lymphknotenatrophie auf, mit reduzierten Vorläuferzellen im Knochenmark und einer beeinträchtigten zellvermittelten Immunantwort. Dies lässt den Schluss zu, dass Leptin und Leptinrezeptoren ein Verbindung zwischen lymphatischen Zellen und Fettzellen darstellen [Matarese et al. 2002]. Des Weiteren stimuliert das Peptidhormon die Zytokinproduktion in Peritonealmakrophagen von Nagetieren [Gainsford et al. 1996], wie IL-6, IL-18 und TNF-α in vitro und in vivo [Faggioni et al. 2000].
Der Anteil der NK-Zellen an der Fraktion der mononukleären Zellen im peripheren Blut beträgt im Mittel 10–20 % [Miller 2001], wobei die genaue Anzahl immer speziesspezifisch ist. Die Zellen spielen eine wichtige Rolle in der frühen Abwehr von viralen- und bakteriellen Infektionen und von Tumorzellen [Papamichail et al. 2004]. Weiterhin produzieren sie eine Reihe von immunregulierenden Zytokinen wie IFN-γ, TNF-α, IL-2 und IL-10, sowie verschiedene andere Zytokine, welche eine sofortige Immunreaktion hervorrufen können [Smyth et al. 2001; Zhao et al. 2003]. Es können zwei NK-Zell-Populationen von einander abgegrenzt werden, die sich zum einen durch die Menge des exprimierten CD56 Antigens an ihrer Zelloberfläche unterscheiden und zum anderen durch das Vorhanden- bzw.
Nichtvorhandensein von CD16 (FcRγIII). Die NK-Zell-Population CD56dim, welche als die ausgereifte NK-Zell-Population gilt, verfügt über den fragment crystallizable (Fc)-Rezeptor CD16 und stellt die größte NK-Zell-Population mit ca. 90 % dar. Ruhende CD56dim weisen
die höchste Zytotoxizität auf [Robertson et al. 1990], im Gegensatz zu den CD56bright. Ihr Anteil an der gesamten NK-Zell-Population im peripheren Blut beträgt 10 % und weist neben einer hohen Proliferationsrate eine geringe Zytotoxizität auf. Dies drückt sich auch in einer geringen Expression der killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIR) aus [Miller et al.
1992; Farag et al. 2002]. Zudem fehlt den CD56bright Zellen die Fähigkeit CD16 zu bilden. Die Expression von IL-2 Rezeptoren [Nagler et al. 1990], c-kit [Carson et al. 1994] und einem Rezeptor für den T-Zell-Faktor 1 (TCF-1) [Toor et al. 2001] ist bei ihnen aber möglich.
Grundsätzlich fehlt NK-Zellen der T-Zell-Rezeptorkomplex (TCR) [Lanier et al. 1989], der den T-Zellen dazu dient kleine Bruchstücke von Antigenen zu erkennen, die über Major- Histocombatibility-Complex (MHC)-Moleküle (Synonym: HLA (human leukocyte antigens)) von kernhaltigen Zellen des Körpers präsentiert werden. So wird anschließend eine Immunreaktion ausgelöst. Dennoch haben NK-Zellen ein großes Rezeptorrepertoire, wie der Tabelle 2 (S. 10) zu entnehmen ist. Hierbei wird zwischen zwei Gruppen von Rezeptoren unterschieden. Die Erste interagiert nicht mit den MHC-Klasse-I-Molekülen, während die zweite Gruppe mit ihnen in Verbindung tritt, bei der es aber nicht wie beim TCR zur Antigenpräsentation kommt, sondern wie nachfolgend am Beispiel von KIR gezeigt wird, zu einer Überprüfung von Quantität und Qualität der MHC-Klasse-I-Moleküle durch die NK- Zellen. Die KIRs gehören zur Immunoglobulinsuprafamilie und besitzen zwei bis drei extrazelluläre Domänen. KIRs lassen sich in zwei Gruppen unterteilen, die sich durch ihre zytoplasmatischen Enden unterscheiden. KIRs mit einem langen Ende signaltransduzieren inhibitorische Signale, welche eine Zytolyse durch die NK-Zelle verhindern. Wohingegen KIRs mit einem kurzen zytoplasmatischen Ende aktivierende Signale erzeugen [Blassoni et al. 1996], was zur Ausschüttung zytotoxischer Granula aus der NK-Zelle führt mit anschließender Lyse der Zielzelle. Zu solch einem Vorgang kann es immer dann kommen, wenn die Regulation der MHC-Klasse-I-Moleküle, welche auf der Oberfläche jeder kernhaltigen Zellen exprimiert werden, zum Beispiel durch maligne Entartungen oder Infektionen gestört ist [Raulet et al. 1995; Lanier et al. 1997]. Wichtig ist dabei, dass die Aktivität der aktivierenden Rezeptoren durch die der inhibitorischen Rezeptoren gegenreguliert wird.
Die Rolle von Leptin auf die Entwicklung, das Zytotoxizitätsverhalten, die Migration in andere Gewebe und die Proliferation von NK-Zellen ist bis heute weitgehend unerforscht. Es konnte 2002 gezeigt werden, dass db/db Mäuse eine signifikante Suppression der NK-Zell- Funktion in Milz, Leber und Lunge aufwiesen [Tian et al. 2002]. Dies konnte ein Jahr später bei humanen NK-Zell-Linien bestätigt werden. Es zeigte sich, dass auf der Oberfläche dieser
humanen NK-Zellen sowohl die langen als auch kurzen Leptinrezeptorisoformen exprimiert wurden. Bei anschließender Gabe von rekombinatem humanem Leptin kam es zu einer Aktivierung der STAT3-Signalkaskade mit einer nachfolgenden Hochregulation der Genexpression für IL-2, dem NK-Zell-Wachstumshormon sowie dem Perforin, einem schnellen Apoptose-induzierenden Effektormolekül. So konnte eine Beziehung zwischen Leptin und der NK-Zellfunktion vermutet werden [Zhao et al. 2003], welche weiter zu erforschen ist. In der Literatur liegen bis dato keine Ergebnisse über das Proliferations- oder Migrationverhalten der NK-Zellpopulation in Abhängigkeit von Köpergewicht und Leptinspiegel vor.
Tabelle 2: Aktivierende (+) Rezeptor-Liganden-Bindung triggern die Zytotoxizität der NK-Zellen, während inhibierende (-) Rezeptoren eine Zytolyse durch sie verhindern.
Rezeptor- bezeichnung
Interaktion mit MHC Klasse I
+/- Funktion Literaturnachweis
KIR ja +/- Erkennen von HLA-ABC Wagtmann et al. 1995 CD94/NKG2A/B ja - Erkennen von HLA-ABCG
und 1b HLA-E
Braund et al. 1998 ; Leibson et al. 1998 ; Borrego et al. 1998 CD94/NKG2C/E ja + Erkennen von HLA-ABCG
und 1b HLA-E
Braund et al. 1998 ; Leibson et al. 1998 ; Borrego et al. 1998
NKG2D ja + Interaktion mit MICA,
welches ein Klasse I homolog darstellt und in Tumoren von Epithelien seinen Ursprung hat, wie z.B. des Darms, Niere, Prostata
Wu et al. 1999 ; Bauer et al. 1999
LIR/ILT ja - Meyaard et al. 1997
CD16
(Fc-Rezeptor)
nein + Bindet Fc-Teil von
Antikörpern und löst eine antikörperabhängige
Zytotoxizität aus.
Lanier 1998
CD2 nein + Erkennen des
Adäsionsliganden LFA-3
Tangye et al. 2000
β2 nein + Erkennen des intrazellulären Adhäsionsmoleküls-1
(ICAM-1)
Klein et al. 1990;
Melero et al. 1993
NKp46,44,30 nein + Lysieren von verschiedenen Tumorzelllinien, wobei NKp46 ausschließlich bei IL- 2 stimulierten NK-Zellen exprimiert wird.
Sivori et al. 1999
2B4 nein + Der Ligand für 2B4 ist CD
48. Die Bindung führt zur Zytokinsekretion und Lyse der Zielzelle.
Nakajima et Colonna 2000
LAIR-1 nein - Meyaard et al. 1997
1.4 Zielsetzung der Arbeit
Das Ziel dieser Arbeit ist es zu zeigen, in welcher Weise Leptin einen modulierenden Einfluss auf die NK-Zellpopulation hat. Durch die i.v. Applikation von Leptin, NaCl und Poly I:C, einem bekannten NK-Zellaktivator, sollen Unterschiede zwischen normalgewichtigen und diät-induziert adipösen Lewis-Ratten gezeigt werden. Zu diesem Zweck erfolgt mit Hilfe der analytischen Durchflußzytometrie (FACS) eine quantitative Bestimmung der NK- Zellpopulationen und anderer Leukozytensubpopulationen, wie z.B. den T-Zellen, welche der NK-Zell-Population in vielen Eigenschaften sehr ähnlich sind. Gleichzeitig soll mit Hilfe einer immunhistochemischen Färbung das Migrationsverhalten der NK-Zellen bei normalgewichtigen und adipösen Tieren in Lunge, Leber und Milz untersucht werden. Ein Zytotoxizitätstest soll anschließend klären, ob Leptin zu einer Modulation der Aktivität führt.
Zusammenfassend sollen also folgende Fragestellungen geklärt werden:
1. Wie ist die quantitative Wirkung von Leptin bei normalgewichtigen und diät- induziert adipösen Lewis-Ratten auf die NK-Zellen im Blut im Vergleich zu den Kontrollgruppen?
2. Wie ist die quantitative und qualitative Wirkung von Leptin bei normalgewichtigen vs. diät-induziert adipösen Lewis-Ratten auf die Population der NK-Zellen im venösen Blut?
3. Wie unterscheiden sich das Migrationsverhalten und die zytotoxische Aktivität der NK-Zellen in Lunge, Leber und Milz nach Leptinapplikation bei normalgewichtigen und diät-induziert adipösen Lewis-Ratten?
4. Wie stellt sich das Migrationsverhalten von NK-Zellen unter Polyinosinic- Polycytidylic-Acid (Poly I:C) Applikation bei normalgewichtigen und diät-induziert adipösen Lewis-Ratten dar?
5. Wie sieht es mit der therapeutischen Rolle von Leptin bei NK-Zell-vermittelten Immunprozessen aus?
2 Material und Methoden 2.1 Versuchstiere und Haltung
Für die Experimente wurden 18 männliche normalgewichtige Lewis-Ratten mit einem Körpergewicht zwischen 250 g und 290 g sowie 15 männliche diät- induziert adipöse Lewis- Ratten mit einem Körpergewicht zwischen 390 g und 470 g verwendet. Alle Tiere wurden unter standardisierten Bedingungen spezifisch pathogenfrei im zentralen Tierlaboratorium der Medizinischen Hochschule Hannover gehalten. In dem schallgeschützten Raum herrschte ein Hell-Dunkel-Zyklus von jeweils 12h (Tagzyklus von 7 Uhr bis 19 Uhr) und eine Raumtemperatur von 21 ± 1 °C. Der Käfigboden war mit Streu ausgelegt. Das Trockenfutter (Altromin 1234, Altromin GmbH, Lage, Deutschland) und das Trinkwasser standen allen Ratten ad libitum zur Verfügung. Zusätzlich hatten die diät- induzierten adipösen Ratten freien Zugang zu einer hochkalorischen Diät (C1057 fettreiche Diät, Altromin GmbH Lage, Deutschland) in einem Zeitraum von fünf Wochen. Die Tiere wurden in einem Käfig (40 × 26
× 15 cm) aus Propolycarbonat mit Gitterdeckel gehalten, in dem sie sich frei bewegen konnten. Alle in dieser Dissertation durchgeführten Versuche waren von der Bezirksregierung Hannover genehmigt (Aktenzeichen: 04/753).
2.2 Implantation eines Venenkatheters in die Vena jugularis externa 2.2.1 Operationsverfahren
Sowohl die Vorbereitung als auch das Verfahren zur Implantation des permanenten Venenkatheters in die Vena jugularis externa entsprach dem Verfahren nach Nave et al.
[1998]. Die Implantation dauerte ungefähr 60 Min. und wurde während des Tagzyklus durchgeführt, wobei sich die Implantation des Katheters für die normalgewichtigen Lewis- Ratten und die diät- induzierten adipösen Lewis-Ratten nicht unterschied.
Jedes Versuchstier wurde unter einer Glassglocke mit 10 ml Isofluran (Wirkstoff: Isofluran, Inhalationsnarkotikum; Abhott GmbH & CO. KG Wiesbaden, Deutschland) inhalativ kurzanästhesiert. Anschließend wurde der Ratte 0,2 ml eines Anästhetikums (0,35 ml Ketamin; Wirkstoff: Ketaminhydrochlorid, zur i.m. und i.v. Injektion; Dr. E. Gräub AG, Bern, Schweiz) + 0,05 ml Domitor (Wirkstoff: Medetomidinhydrochlorid, 10 ml; Pfizer GmbH Karlsruhe, Deutschland) in den rechten Hinterlauf intramuskulär injiziert und das Tier wieder vorsichtig in den Käfig zurückgelegt, um diesem weiteren Stress zu ersparen. Ab diesem Zeitpunkt war des Öfteren einer durch das Anästhetikum initiierter Opisthotonus zu
sehen. Nach einigen Minuten bekam das Tier dann weitere 0,2 ml des Anästhetikums intramuskulär in den linken Hinterlauf injiziert. Zur Dehydratationsprophylaxe wurde der Ratte 0,4 ml 5 % Dextroselösung (2,5mg Dextrose in 50 ml NaCl gelöst) subkutan appliziert.
Anschließend wurde auf die Kornea Bepanthen (Wirkstoff: Dexpanthenol; Hoffmann–La Roche AG Grenzach-Wyhlen, Deutschland)
aufgetragen, um ein Austrocknen, aufgrund des fehlenden Lidschlusses, zu verhindern.
Nach der Rasur und Desinfektion der Inzisionsbereiche auf dem Kopf sowie rechts supraklavikulär, wurden die Reflexe durch Druck auf die beiden Hinterläufe und an der Schwanzspitze getestet. Anschließend wurde ein subkutaner Hautschnitt rechts supraklavikulär gesetzt und das Subkutangewebe mit einer Schere auf ca.
2cm auseinanderdrängend erweitert und die Vena jugularis externa aufgesucht, welche nachfolgend von Bindegewebe frei präpariert wurde. Des Weiteren wurde vom lateralen Wundrand her ein subkutaner Tunnel bis zur Sutura sagittalis des Schädeldachs angelegt
und der vorbereitete Venenkatheter mit Hilfe einer Pinzette durch den Subkutantunnel gezogen. Als nächstes wurde ein Teflonring (innerer Ø 0,9 mm, äußerer Ø 2 mm, bezogen über die Forschungswerkstatt der Medizinischen Hochschule Hannover, Deutschland) 30 mm hinter der Katheterspitze fixiert, welcher als Abstandshalter fungierte, damit der Katheter nicht zu weit in den rechten Vorhof hinein rutschen konnte. Als nächstes wurde die Vena jugularis externa mit einer oberen- und einer unteren Ligatur (PGA- Faden geflochten, beschichtet, 70 cm lang, 3/0 USP; Catgut GmbH Markneukirchen, Deutschland) angehoben und mit einer mikrochirurgischen Schere eine Venotomie durchgeführt. Der Katheter wurde anschließend in die Vene eingeführt. Zum besseren Vorschieben des Katheters in den rechten Vorhof war die Elevation des rechten Vorderlaufs von großer Hilfe (Abb. 1). Der Katheter wurde dann 30 mm bis zum Teflonring vorgeschoben und anschließend überprüft, ob sich Blut über den Katheter aspirieren ließ. Schließlich erfolgte die Fixierung des Katheters innerhalb der Vene, mit Hilfe der beiden Ligaturen und ein anschließendes Ausspülen der
Abb.1: Röntgenaufnahme einer Ratte nach der Implantation eines Katheters in die rechte Vena jugularis externa
Drahtspirale i.v. -Katheter
Multiadapter
Gewicht Anschluss
Umlenkrolle
Käfigdeckel
Abb. 2: Schematische Darstellung des i.v.- Kathetermodells (modifiziert nach Nave et al. 1998)
Wunde mit 0,9 % NaCl-Lösung. Danach wurden die Wundränder mit einer fortlaufenden Naht verschlossen. Der nächste Abschnitt der Operation beinhaltet die Fixierung des Konus auf dem Schädeldach. Dazu wurde die Lewis-Ratte in ein stereotaktischen Apparat (Modell 900, Kopfe Instruments, Tujunga, USA)unter der Beobachtung der Lidschlussreflexe, welche Aufschluss über die richtige Fixierung der Fixierungselemente in den Meati akustici externi geben, eingespannt. Nun wurde, ausgehend von der Öffnung des subkutanen Tunnels der Schnitt nach rostral erweitert und mit einem Skalpell das Subkutangewebe und das Periost entfernt und somit der Schädeldach freigelegt. Nachfolgend wurden zwei Löcher (Ø 1,2 mm) in das linke und rechte Os parietale gebohrt und zwei Mikroschrauben eingesetzt, welche zur sicheren Fixierung des Katheters auf dem Schädeldach unabdingbar waren. Der am Katheter platzierte Spritzenkonus diente hierbei als Auflagevergrößerung der Drahtspirale. Die Mikroschrauben und der Spritzenkonus wurden letztendlich mit dem Auftragen von Zahnzement (Inhalt: Carboxylatzement; Eine Kapsel enthält mindestens eine Menge von 0,41 ml; 3M ESPE AG Seefeld, Deutschland) verbunden und garantieren so eine stabile Fixierung der Drahtspirale bzw. des Katheters. Zum Schluss wurden 0,2 ml einer PVP- Lösung (PVP (Polyrinlypyrolidone) 10 mg + 10 ml 0,9 % NaCl + 5 ml Liquemin®) in den Katheter appliziert, um eine längere Durchgängigkeit zu gewährleisten. Anschließend wurde der Konnektor mit einem Combi Stopper (Hersteller: B. Braun Melsungen AG Melsungen, Deutschland)verschlossen.
2.2.2 Aufhängeapparat
Der Aufbau des Aufhängeapparates kann Abb. 2 entnommen werden. Er sollte zum einen dabei helfen, einen leichten Zug auf die Drahtspirale auszuüben, so dass der Kopf des Tieres von dessen Gewicht befreit wurde und zum anderen das distale Ende der Drahtspirale vor Beschädigungen von Seiten der Ratte bewahren.
2.2.3 Pflege des Kathetersystems und postoperative Betreuung der Tiere
Postoperativ wurden die Tiere mit den Käfigen für 24 h auf elektrische Wärmematten mit einer Temperatur von 27°C gestellt. Aufgrund ihrer eingeschränkten Mobilität nach der
Operation bekamen die Versuchstiere zusätzlich Futter in den Käfig gelegt, um so eine sofortige Nahrungsaufnahme nach ihrem Erwachen (etwa 3-4 h) zu ermöglichen.
Die Tiere bekamen außerdem einen Tag vor und zwei Tage nach der Operation acht Tropfen Novalgin (Wirkstoff: Metamizol- Natrium × 1 H2O 50 ml Tropfen; Ratiopharm GmbH Ulm) ins Trinkwasser zwecks Analgesie. Am dritten postoperativen Tag wurde das Kathetersystem mit einer speziellen Spüllösung gespült [Nave et al. 1998], um den Katheter durchgängig zu halten und die Tiere an Volumenschwankungen, die die Infusionen mit sich bringen, zu gewöhnen. Das Spülen erfolgte jeden zweiten Tag.
2.3 Versuchsdurchführung, Blutentnahme, Perfusion und Organentnahme
Fünf Tage nach der Operation wurden den normalgewichtigen Lewis-Ratten (nw-L) 125 µg und den diät- induziert adipösen Tieren (ob-L) 175 µg rekombinantes humanes Leptin (NatuTec GmbH, Frankfurt, Deutschland) in 1 ml isotonem NaCl (0,9 %) i.v. über den Katheter mit Hilfe eines Perfusors (TSE Technical & Scientific Equipment GmbH Bad Homburg, Deutschland) innerhalb von 60 Min. appliziert. Die Kontrolltiere bekamen ebenfalls innerhalb von 60 Min. 1 ml isotones NaCl. Nach beendeter Applikation wurden die Katheter beider Versuchsgruppen mit 0,2 ml NaCl gespült. Vier Stunden später (gerechnet ab der ersten Viertelstunde nach Applikation) wurden die Tiere mit einem Anästhetikum (0,05 ml Domitor + 0,35 ml Ketamin) i.v über den Venenkatheter narkotisiert (s. Abb. 3). Den letzten zwei Versuchsgruppen wurde Poly I:C (2 mg/kg Körpergewicht) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland) in 0,2 ml Phosphate Buffered Saline (PBS) gelöst als Bolus 24 h vor Anästhesie i.v. verabreicht.
Nach der Narkose wurden Bauch und Thorax eröffnet. Durch die Punktion des linken Ventrikels wurde Vollblut gewonnen, welches in zwei EDTA- Röhrchen (2 ml und 3 ml) aufgeteilt worden war. Für den Chromium release assay dagegen, wurde eine mit Liquemin benetzte 10 ml Spritze verwendet. Anschließend fand eine Inzision des rechten
Abb. 3: Schematischer Ablauf von Leptinapplikation, Blutentnahme, Perfusion und Organentnahme am Beispiel eines beliebigen Versuchstieres
Herzohrs statt. Anschließend wurden 100 ml PBS und nachfolgend 100 ml 4 %-iges Paraformaldehyd in den linken Ventrikel perfundiert. Lunge, Leber und Milz wurden entnommen und unmittelbar in flüssigem Stickstoff gefroren und bis zur immunhistologischen Untersuchung in einer Kühlkammer bei –82°C archiviert. Während ein EDTA- Röhrchen mit Vollblut für die FACS- Analysen genutzt wurden, wurde das zweite EDTA-Röhrchen zentrifugiert und das daraus gewonnene Serum für weitere Analysen abpipettiert.
2.4 Immunologische Untersuchungen
2.4.1 Durchflusszytometer/Flourescence activated cell sorter (FACS)
Das Durchflusszytometer erlaubt die gleichzeitige Messung von Streulicht- und Fluoreszenzsignalen an einzelnen Zellen. Mit Hilfe des Streulichts kann die relative Zellgröße (Vorwärtsstreulicht (FSC)) und die intrazelluläre Granularität (Seitwärtsstreulicht SSC)) jeder Zelle ermittelt und so einer Subpopulation zugeordnet werden. Innerhalb dieser Zellpopulationen können die einzelnen Zellen mit konjugierten Antikörpern, deren Farbstoffe fluoreszieren (Fluorescein-isothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE) für Immunfluoreszenz) in Subpopulationen weiter unterteilt werden. So können in weniger als einer Minute mehr als zehntausend Zellen einer jeweiligen Population bzw. Subpopulation zugeordnet werden. Zur genaueren Abgrenzung der NK-Zellen von den restlichen Leukozytenpopulationen, wurden die Leukozyten mit dem Primärantikörper 10/78+ (NK-Zell-spezifischer Antikörper) markiert und diese Zellen anschließend gegated.
Probenvorbereitung
Messungen mit einem Durchflusszytometer erfordern Proben als Einzelsuspension in einer Konzentration von einer Million Partikel/ml.
Zu diesem Zweck wurden etwa 0,5-1 Mio. Zellen (in 50 µl) in jedes Well gegeben und diese anschließend mit 100 µl PBS, 1 % BSA sowie 0,1 % NaN gewaschen. Nachfolgend wurde die Titerplatte für zwei Minuten bei 1800 U/min zentrifugiert und im Anschluss der Überstand abgeschüttet, die Titerplatte getrocknet und die Sedimente etwa 15 Sekunden bei 1200U/min aufgeschüttelt. Jedem Well wurde dann 50 µl 10 %iges Humanserum beigefügt und anschließend bei 1000 U/min fünf Minuten lang durchgemischt. Im Anschluss wurde wieder mit 100 µl Waschmedium gespült, zentrifugiert und der Überstand abgeschüttet, abgetrocknet und resuspendiert. Nachfolgend wurde in jedes Well 50 µl des Primärantikörpers (s. Tabelle 3) hinzugegeben und anschließend 15 Sek. bei 1000 U/min aufgeschüttelt, 20-25 Min. bei 4
°C inkubiert sowie zwei weitere Male gewaschen wie oben beschrieben. Danach wurde in jedes Well 50 µl eines Sekundärantikörpers (s. Tabelle 3) hinzugefügt und das gleiche Procedere wie beim Primärantikörper durchgeführt. Nach dem letzten Aufschütteln wurden in jedes Well 100µl PBS, 0,1 % BSA sowie 0,1 % NaN hinzugegeben und die Zellsuspension anschließend in ein Falcon-Röhrchen zur FACS-Messung überführt. Alle Arbeiten wurden nach Zugabe des ersten Antikörpers auf Eis durchgeführt.
Subpopulation erster Primärantikörper zweiter Primärantikörper
B-Lymphozyten - OX 12FITC+
T-Lymphozyten R 73 PE+(Gesamtheit) -
CD4+ T-Lymphozyten - W3/25 BIO+
CD8+ T-Lymphozyten - OX 8 BIO+
Monozyten-Subpopulationen ED9 PE+ 10/78 FITC+/- W 3/25 BIO+/- OX 8 BIO+/- Natürliche Killer- (NK-)Zellen 10/78 PE+ OX 8 FITC+/-
R 73 BIO+/-
Tabelle 3: Leukozytensubpopulation, Primär- bzw. Sekundärantikörper (+ bedeutet: Antikörper bindet; -
bedeutet: Antikörper bindet nicht).
2.4.2 Immunhistologie
Für die Immunhistologie wurde 10/78+, ein Klon des Mouse Anti Rat CD161 (MCA1427)- Antikörper (Serotec, Oxford, GB), als Primärantikörper verwendet. 10/78+ erkennt in Ratten das CD161 Protein, auch bekannt als NKR-PI, ein 60kD großes Glykoprotein, welches in NK-Zellen sowie T-Zellpopulationen exprimiert wird. Dieser Antikörper entspricht dem Klon 3.2.3. in seiner antigenbindenden Eigenschaft [Serotec 2002].
Die Färbung der Gewebeschnitte erfolgte nach dem Alkalische-Phosphatase-Anti-Alkalische- Phosphatase (APAAP)-System. Dabei wurde der Primärantikörper nach Fixierung (1:1 Mischung; Methanol + Aceton, Merck, Darmstadt, Deutschland) und Trocknung der Schnitte auf die Proben und PBS (98,9 % PBS Seromed 182-10, 1 % BSA (Bovine Serum Albumin;
Serva 11930, 0,1 % Natriumacid Merck, Darmstadt, Deutschland) auf die Kontrollen aufgetragen und bei +4 °C über Nacht in einer Feuchtkammer inkubiert. Die Antikörper, die
nicht an das Antigen gebunden hatten, wurden abgespült und die Proben zweimal mit Tris- Buffered- Saline (TBS)-Tween (TBS + 0,05 % Tween-20 Serva) gewaschen. Dieser letzte Schritt der Spülung und Waschung wurde in den folgenden Schritten wiederholt.
Der Sekundär-Anti-Mausantikörper Z 259 (Dako, Hamburg, Deutschland) wurde anschließend für dreißig Minuten auf die Proben gegeben. Der Sekundär-Antikörper sowie der APAAP- Komplex (1:50 in TBS -Tween verdünnt; APAAP-Mouse Monoclonal Dako D651/1 ml, Hamburg, Deutschland) wurde wiederholt für jeweils 15 Minuten auf die Proben aufgetragen, bevor Fast Red (Sigma, München, Deutschland) als Substrat für die alkalische Phosphatase (20 mg Naphthol-AS-MX-Phosphat (Sigma, München, Deutschland) + 2 ml N,N-Dimethylformamide (Fluka 40240) + 98 ml 0,1 m Tris- Puffer pH 8,2 + 100 µl 1 m Levamisole; Sigma L 9756) für 35 Minuten auf den Gewebeschnitten inkubiert wurden. Nach der Gegenfärbung mit Mayers Hämalaun (Merck, Darmstadt, Deutschland) und zweimaliger Waschung mit PBS (9,55 g/l PBS in aqua dest.) wurden die Präparate mit Glycergel (Dako, Hamburg, Deutschland) eingedeckelt.
2.4.3 NK-Zell-Zytotoxizitätstest (NK-Zell-Assay)
Der NK-Zell-Assay, zur Bestimmung der Zytotoxizität von NK-Zellen, wurde in Kooperation mit Herrn Priv. Doz. Dr. Roland Jacobs vom Institut für Immunologie der Medizinischen Hochschule Hannover durchgeführt. Hierbei wurden Yac-Zellen, die als Targetzellen, dienten, mit Chrom markiert. Diese Zellen exprimieren kein MHC-I und lassen sich leicht permanent in Kultur halten. Aufgrund der Tatsache, dass den Yac-Zellen nun MHC-I fehlte, wurden sie von den NK-Zellen als pathogen eingestuft und lysiert, was zur Freisetzung des Chroms führte. Der anschließende Überstand konnte dann gemessen werden. Als Resultat erhielt man beim Auftragen der prozentualen Lyse gegen die E:T-Ratio einen sigmoiden Kurvenverlauf der Zytotoxizität, der mit Hilfe der von Krogh-Gleichung mathematisch transformiert und dadurch die Zytotoxizitätskurve linearisiert werden konnte. Auf diesem Weg erreichte man eine direkte Proportionalität zwischen Zell-Lyse und der Anzahl der eingesetzten Targetzellen [Jacobs 2005]. Um die Testergebnisse besser vergleichen zu können, wurden sie in lytische Units (LU) umgerechnet [Bryant et al. 1991].
Bevor mit dem NK-Zytotoxizitätstest begonnen werden konnte, musste das entnommene Blut und die Organe speziell vorbereitet werden. Hierzu wurde im Verhältnis 1:1 das Medium RPMI mit dem gewonnen Blut in einem Falcon- Röhrchen gemischt, was zu einer homogenen Suspension führte. Anschließend wurde ebenfalls im Verhältnis 1:1 Ficoll (Amerham Biosciences AB, Bjorkgatan 30 Uppsala, Sweden) beigefügt, so dass auf Grund der nun
heterogenen Mischung zwei Phasen entstanden (Ficoll am Boden und die Blut/Medium Mischung darüber).
Die Organe (Milz und Lunge) wurden jeweils in ein Sieb mit einer Petrischale gelegt und anschließend mit zwei Pinzetten gezupft und immer wieder mit Medium übergossen. In der Petrischale entstand eine Zellsuspension, die mit einer Pasteurpipette in ein Falcon-Röhrchen abpipettiert worden ist und wiederum Ficoll im Verhältnis 1:1 beigefügt wurde.
Nachfolgend wurden die Falcon-Röhrchen bei 400 G 18°C 30 Minuten zentrifugiert und anschließend das PBMC- Pellett, welches sich als dünner weißlicher Saum zwischen der verdünntem Plasma- und Erythrozyten/Granulozyten Schicht befand, mit Hilfe einer Pasteurpipette in ein Falcon- Röhrchen abpipettiert.
Den Zellen wurde nun im Verhältnis 1:2 Medium hinzugefügt und bei 400 G 10 Minuten zentrifugiert. Danach wurde das PBMC- Pelett noch einmal abpipettiert und der Waschschritt wiederholt. Nachfolgend wurde der Überstand abgenommen und dem nun von Thrombozyten und Ficoll-Resten gereinigtem PBMC- Pelett Medium (ca. 2 ml auf 20 ml Zellsuspension- bzw. Blutausgangsvolumen) hinzugefügt.
Vor dem Beginn des NK-Zell-Assay wurden die Yac-Zellen abzentrifugiert und mit radioaktivem Na2CrO4 (Natrium-Chromat) für eine Stunde inkubiert und nach dreimaligem Waschen auf 5x105 Zellen/ml eingestellt. Anschließend wurden die PBMCs (Effektorzellen) auf 3x106 Zellen/ml eingestellt und drei Verdünnungsstufen (1:15, 1:30, 1:60) hergestellt.
Jeweils drei Wells einer Spitzbodenplatte wurden mit je 100 µl der Zellsuspension und den drei Verdünnungen gefüllt und in jedes Well 50 µl Targetsuspension hinzugegeben. Zur Bestimmung der maximalen Chromfreisetzung wurde in drei weiteren Wells 100 µl Medium in 50 µl Targetzellsuspension inkubiert und anschließend 100 µl eines Detergentiums hinzugefügt, welches eine Lyse mit der gewünschten maximalen Chromfreisetzung der Targetzellen hervorruft. Anschließend wurde die Spitzbodenplatte leicht anzentrifugiert und es folgte eine vierstündige Inkubation. Während dieser Zeit sollte es zu spezifischen Targetzelllyse mit Chromfreisetzung kommen. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Zellen durch Zentrifugation am Plattenboden fixiert und 100 µl des Überstandes jedes Wells entnommen und nachfolgend die Zerfälle/min (cpm) in einem Gamma-Counter gemessen.
Hierbei dienten die jeweils drei Parallelansätze der zuverlässigen Mittelwertbestimmung.
2.5 Histologische Auswertung
Die Histologie wurde am Axiophot-Mikroskop (Zeiss, Jena, Deutschland) blind ausgewertet.
Verwendet wurde ein Objektiv mit 5 und 20-facher Vergrößerung. Die Präparate wurden
zunächst in der Übersichtsvergrößerung betrachtet, um die Qualität von Färbung und Schnitt zu beurteilen. Auf jedem Objektträger befanden sich 6-8 Schnitte, von denen fünf randomisiert zur Auszählung herangezogen worden sind. Die Schnittflächen der Organe variierten in ihrer Größe. So wurden die NK-Zellen in Leber und Milz auf einer Fläche von 25 Quadratmillimeter und in der Lunge von 15 Quadratmillimeter pro Organschnitt ausgezählt und anschließend die Kontroll- und Versuchsgruppen statistisch ausgewertet.
2.6 Statistische Auswertung
Alle Daten der quantitativen Auswertungen im Ergebnisteil sind dargestellt als Mittelwerte ± Standardfehler (standard error of the mean, SEM). Zur Analyse der Effekte von Leptin, NaCl und Poly I:C auf das Migrationsverhalten sowie die Modulation der Aktivität von NK-Zellen wurde eine ANOVA- Analyse durchgeführt, mit „Applikationssubstanz“ als Faktor und
„Anzahl der Zellen“ als abhängige Variable. Signifikante Effekte der Leptin- und Poly I:C- Applikation einer Gruppe (normalgewichtige Ratte bzw. diät-induzierte adipöse Ratten) gegenüber der jeweiligen Kontrollgruppe (NaCl) wurde in den dargestellten Abbildungen durch Sternchen markiert: * p < 0,05. Signifikante Effekte nach Leptin-, NaCl- und Poly I:C- Applikation der einen Gruppe (Normalgewichtige Ratten) gegenüber Leptin-, NaCl- und Poly I:C-Applikation der anderen Gruppe (diät-induzierte adipöse Ratten) wurden durch Rauten markiert: # p < 0,05. Signifikante Effekte von Leptin- gegenüber Poly I:C- Applikation der jeweiligen Gruppe wurden mit einem Paragraphenzeichen markiert: § p <0,05.
Die statistische Auswertung der vorliegenden Daten wurde mit Hilfe der Software StatView 5.0 für Windows durchgeführt. Die Software Prism 3.03 diente der anschließenden grafischen Aufarbeitung der Daten.
3 Ergebnisse
3.1 Quantitative Auswertung der Leukozytenpopulationen im peripheren Blut 3.1.1 Leukozyten
Vier (NaCl bzw. Leptin) bzw. 24 Stunden (Poly I:C) nach i.v. Applikation ist die Leukozytenzahl der normalgewichtigen Leptin-Versuchsgruppe signifikant (p < 0,001) um 65
% gegenüber der NaCl-Kontrollgruppe erhöht. Die normalgewichtige Leptin-Versuchsgruppe hat zudem mit etwa 18,5 % eine signifikant erhöhte Zellzahl gegenüber der diät-induziert adipösen Leptin-Versuchsgruppe. Ebenfalls signifikante Effekte (p < 0,001) sind bei den normalgewichtigen Ratten zwischen der Leptin und Poly I:C-Gruppe zu erkennen. Hierbei ist die Leukozytenzahl der normalgewichtigen Leptin-Versuchsgruppe um etwa 139 % höher, als die der Poly I:C-Gruppe, welche ihrerseits im Vergleich zur Kontrolle um etwa 31 % erniedrigt ist. Ähnliches gilt auch für die Poly I:C-Gruppe der diät-induziert adipösen Ratten, bei denen die Anzahl der Leukozyten gegenüber der diät-induzierten adipösen Leptin- Versuchsgruppe um 45 % signifikant erniedrigt ist. Die Zellzahl der diät-induzierten adipösen Leptin-Versuchsgruppe ist im Vergleich zur NaCl-Kontrolle um 66 % erhöht. Wohingegen die beiden NaCl-Versuchsgruppen sowie die beiden Poly I:C-Gruppen sich in der Leukozytenzahl kaum unterscheiden.
NaCl Leptin Poly I:C NaCl Leptin Poly I:C
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1
1 2 * §
no rm alg e wic htig adipö s
* # §
*
Leukozyten x 106 /ml Serum/Plasma
Abb. 4: Anzahl der Leukozyten im peripheren Blut nach i.v. Applikation. Signifikante Unterschiede der Leptin bzw. Poly I:C-Versuchsgruppe gegenüber der NaCl-Kontrollgruppe sind mit * markiert (p < 0,05).
Signifikante Unterschiede der adipösen gegenüber den normalgewichtigen Tiere in einer Gruppe sind mit # markiert (p < 0,05). Signifikante Unterschiede der Leptin- gegenüber der Poly I:C-Versuchsgruppe innerhalb einer Körpergewichtsgruppe sind mit § markiert (p < 0,05), (n=5-6)
NaCl Leptin Poly I:C NaCl Leptin Poly I:C 0
1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000
normalgewichtig adipös
* §
*# §
Granulozyten x 103 /ml Serum/Plasma
3.1.2 Granulozyten
Vier (NaCl bzw. Leptin) bzw. 24 Stunden (Poly I:C) nach i.v. Applikation ist die Granulozytenzahl der normalgewichtigen Leptin-Versuchsgruppe gegenüber der NaCl- Kontrollgruppe signifikant um etwa 189 % erhöht. Ebenfalls signifikant erhöht ist die Zellzahl der diät-induziert adipösen Leptin-Versuchsgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe, wobei die Differenz zwischen den beiden Gruppen einem Unterschied von 158 % entspricht.
Zwischen den beiden Leptinversuchsgruppen besteht ein signifikanter Unterschied. Hierbei ist die Granulozytenzahl der normalgewichtigen Leptin-Versuchsgruppe, um das 1,2-fache höher als die der diät-induziert adipösen Leptin-Versuchsgruppe. Sowohl die normalgewichtige Leptin-Versuchsgruppe als auch die diät-induziert adipöse Leptin-Versuchsgruppe unterscheiden sich signifikant in der Anzahl der Granulozyten gegenüber den jeweiligen Poly I:C-Gruppen. Sie ist mit 249 % bzw. 237 % deutlich erhöht.
Abb. 5: Anzahl der Granulozyten nach i.v. Applikation im peripheren Blut. Signifikante Unterschiede der Leptin bzw. Poly I:C-Versuchsgruppe gegenüber der NaCl-Kontrollgruppe sind mit * markiert (p < 0,05).
Signifikante Unterschiede der adipösen gegenüber den normalgewichtigen Tiere in einer Gruppe sind mit # markiert (p < 0,05). Signifikante Unterschiede der Leptin- gegenüber der Poly I:C-Versuchsgruppe innerhalb einer Körpergewichtsgruppe sind mit § markiert (p < 0,05), (n=5-6)
3.1.3 B-Lymphozyten
Vier (NaCl bzw. Leptin) bzw. 24 Stunden (Poly I:C) nach i.v. Applikation ist die B- Lymphozytenzahl der normalgewichtigen Leptin-Versuchsgruppe gegenüber der normalgewichtigen Poly I:C-Gruppe signifikant um das 1,8-fache erhöht. Signifikante Unterschiede gibt es auch zwischen den beiden Leptinversuchsgruppen. Die B-Lymphozyten der normalgewichtigen Leptin-Versuchsgruppe sind gegenüber der diät-induziert adipösen Leptin-Versuchsgruppe um das 1,4-fache signifikant erhöht.
NaCl Leptin Poly I:C NaCl Leptin Poly I:C 0
200 400 600 800 1000 1200 1400
§
#
normalgewichtig adipös
B-Lymphozyten x 103 /ml Serum/Plasma
Abb. 6: Anzahl der B-Lymphozyten nach i.v. Applikation im peripheren Blut. Signifikante Unterschiede der adipösen gegenüber den normalgewichtigen Tiere in einer Gruppe sind mit # markiert (p < 0,05).
Signifikante Unterschiede der Leptin- gegenüber der Poly I:C-Versuchsgruppe innerhalb einer Körpergewichtsgruppe sind mit § markiert (p < 0,05), (n=5-6)
3.1.4 T-Lymphozyten
3.1.4.1 T-Lymphozyten - Insgesamt
Vier (NaCl bzw. Leptin) bzw. 24 Stunden (Poly I:C) nach i.v. Applikation ist die T- Lymphozytenzahl der normalgewichtigen Leptin-Versuchsgruppe gegenüber der diät- induziert adipösen Leptin-Versuchsgruppe sowie der normalgewichtigen Poly I:C-Gruppe um etwa 46 % bzw. 69 % signifikant erhöht. Signifikant erniedrigt ist dagegen die Zahl der T- Lymphozyten der normalgewichtigen Poly I:C-Gruppe im Vergleich zur NaCl-Kontrolle um - 36%. Die T-Lymphozytenzahlen der beiden NaCl-Kontrollgruppen weisen ebenfalls signifikante Unterschiede auf. So hat die normalgewichtigen NaCl-Kontrollgruppe eine 40 % höhere Zellzahl gegenüber den adipösen Kontrolltieren.
NaCl Leptin Poly I:C NaCl Leptin Poly I:C 0
500 1000 1500 2000 2500 3000
normalgewichtig adipös
§
*
#
#
T-Lymphozyten x 103 /ml Serum/Plasma
Abb. 7: Anzahl der T-Lymphozyten nach i.v. Applikation im peripheren Blut. Signifikante Unterschiede der Leptin bzw. Poly I:C-Versuchsgruppe gegenüber der NaCl-Kontrollgruppe sind mit * markiert (p <
0,05). Signifikante Unterschiede der adipösen gegenüber den normalgewichtigen Tiere in einer Gruppe sind mit # markiert (p < 0,05). Signifikante Unterschiede der Leptin- gegenüber der Poly I:C- Versuchsgruppe innerhalb einer Körpergewichtsgruppe sind mit § markiert (p < 0,05), (n=5-6)
3.1.4.2 CD4+ T-Lymphozyten
Vier (NaCl bzw. Leptin) bzw. 24 Stunden (Poly I:C) nach i.v. Applikation ist die CD4+ T- Lymphozytenzahl der normalgewichtigen Leptin-Versuchsgruppe gegenüber der diät- induziert adipösen Leptin-Versuchsgruppe um 10 % erhöht und im Vergleich zur normalgewichtigen NaCl-Kontrolle um etwa 4,5 % erniedrigt. Es gibt aber zwischen der normalgewichtigen Leptin-Versuchsgruppe und der normalgewichtigen Poly I:C- Versuchsgruppe einen signifikanten Unterschied. Wie sich zeigt, ist hier die Zellzahl der normalgewichtigen Leptin infundierten Tiere um das 1,5-fach erhöht. Ebenfalls erhöht ist die CD4+ T-Lymphozytenzahl der diät-induziert adipösen Leptin-Versuchsgruppe mit 36 % gegenüber der diät-induziert adipösen Poly I:C-Gruppe und mit 15 % im Vergleich zu der NaCl-Kontrolle. Des Weiteren ist die Anzahl von CD4+-Zellen der normalgewichtigen NaCl- Kontrolle gegenüber der adipösen NaCl-Kontrollgruppe signifikant um das 1,4-fache erhöht.
NaCl Leptin Poly I:C NaCl Leptin Poly I:C 0
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
#
*
normalgewichtig adipös
§
CD4+ T-Lymphozyten x 103 /ml Serum/Plasma
Abb. 8: Anzahl der CD4+ T-Lymphozyten nach i.v. Applikation im peripheren Blut. Signifikante Unterschiede der Leptin bzw. Poly I:C-Versuchsgruppe gegenüber der NaCl-Kontrollgruppe sind mit * markiert (p < 0,05). Signifikante Unterschiede der adipösen gegenüber den normalgewichtigen Tiere in einer Gruppe sind mit # markiert (p < 0,05). Signifikante Unterschiede der Leptin- gegenüber der Poly I:C- Versuchsgruppe innerhalb einer Körpergewichtsgruppe sind mit § markiert (p < 0,05), (n=5-6)
3.1.4.3 CD8+ T-Lymphozyten
Vier (NaCl bzw. Leptin) bzw. 24 Stunden (Poly I:C) nach i.v. Applikation ist die CD8+ T- Lymphozytenzahl der normalgewichtigen Leptin-Versuchsgruppe um etwa 9 % gegenüber der diät-induziert adipösen Leptin-Versuchsgruppe und 2 % gegenüber der normalgewichtigen NaCl-Kontrollgruppe erhöht. Eine ähnliche Erhöhung ergibt sich auch bei der Zellzahl der diät-induziert adipösen Leptin-Versuchsgruppe, welche mit 3 % im Vergleich zur selbigen Kontrollgruppe erhöht ist. Es bleibt trotz der Unterschiede festzuhalten, dass die einzelnen Gruppen nicht signifikant zueinander sind.
NaCl Leptin Poly I:C NaCl Leptin Poly I:C
0 200 400 600 800 1000 1200
normalgewichtig adipös
CD8+ T-Lymphozyten x 103 /ml Serum/Plasma
Abb. 9: Anzahl der CD8+ T-Lymphozyten nach i.v. Applikation im peripheren Blut.
3.1.5 Monozyten
Vier (NaCl bzw. Leptin) bzw. 24 Stunden (Poly I:C) nach i.v. Applikation ist die Monozytenzahl der normalgewichtigen Leptin-Versuchsgruppe signifikant um 122 % gegenüber der normalgewichtigen Poly I:C-Versuchsgruppe erhöht, welche ihrerseits im Vergleich zur Kontrolle um etwa 40,5 % erniedrigt ist. Ebenfalls mit 82 % signifikant erhöht ist die Zellzahl der diät-induziert adipösen Leptin-Versuchsgruppe im Vergleich zur NaCl- Kontrolle. Wohingegen die Monozytenzahl der diät-induziert adipösen Poly I:C- Versuchsgruppe gegenüber der Leptin-Versuchsgruppe um 78,1 % bzw. gegenüber der NaCl- Kontrolle um 60 % signifikant erniedrigt ist. Die Zellzahl der normalgewichtigen Leptin- Versuchsgruppe ist mit 32,4 % gegenüber der NaCl-Kontrollgruppe erhöht. Die Monozytenzahl der diät-induziert adipösen Versuchsgruppe ist mit 21 % gegenüber dem normalgewichtigen Pendant erhöht.
NaCl Leptin Poly I:C NaCl Leptin Poly I:C
0 500 1000 1500 2000
2500 * §
normalgewichtig adipös
§
* Monozyten x 103 /ml Serum/Plasma
Abb. 10: Anzahl der Monozyten nach i.v. Applikation im peripheren Blut. Signifikante Unterschiede der Leptin bzw. Poly I:C-Versuchsgruppe gegenüber der NaCl-Kontrollgruppe sind mit * markiert (p < 0,05).
Signifikante Unterschiede der Leptin- gegenüber der Poly I:C-Versuchsgruppe innerhalb einer Körpergewichtsgruppe sind mit § markiert (p < 0,05), (n=5-6)
3.1.5.1 ED9+ W3/25+ 10/78+ Monozyten
Diese Monozyten wurden dreifach positive gegatedet und sind somit der Gruppe der aktivierten Monozyten zuzuordnen [Bedouni et al. 2001].
Vier (NaCl bzw. Leptin) bzw. 24 Stunden (Poly I:C) nach i.v. Applikation ist die Zellzahl der normalgewichtigen Leptin-Versuchsgruppe signifikant um das 4,3-fache gegenüber der normalgewichtigen Poly I:C-Versuchsgruppe erhöht. Ebenfalls erhöht, wenn auch nicht signifikant, ist die Anzahl der aktivierten Monozyten der normalgewichtigen Leptin- Versuchsgruppe gegenüber der NaCl-Kontrollgruppe mit 48 %. Die Zellzahl der normalgewichtigen Leptin-Versuchsgruppe ist im Vergleich zur Monozytenzahl der diät- induziert adipösen Leptin-Versuchsgruppe um 49 % erhöht.
NaCl Leptin Poly I:C NaCl Leptin Poly I:C
0 5 10 15 20 25 30 35 40
normalgewichtig adipös
§
ED9+ W3/25+ 10/78+ Monozyten x 103 /ml Serum/Plasma
Abb. 11: Anzahl der ED9+ W3/25+ 10/78+ Monozyten nach i.v. Applikation im peripheren Blut. Signifikante Unterschiede der Leptin- gegenüber der Poly I:C-Versuchsgruppe innerhalb einer Körpergewichtsgruppe sind mit § markiert (p < 0,05), (n=5-6)
