2.4.1 Durchflusszytometer/Flourescence activated cell sorter (FACS)
Das Durchflusszytometer erlaubt die gleichzeitige Messung von Streulicht- und Fluoreszenzsignalen an einzelnen Zellen. Mit Hilfe des Streulichts kann die relative Zellgröße (Vorwärtsstreulicht (FSC)) und die intrazelluläre Granularität (Seitwärtsstreulicht SSC)) jeder Zelle ermittelt und so einer Subpopulation zugeordnet werden. Innerhalb dieser Zellpopulationen können die einzelnen Zellen mit konjugierten Antikörpern, deren Farbstoffe fluoreszieren (Fluorescein-isothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE) für Immunfluoreszenz) in Subpopulationen weiter unterteilt werden. So können in weniger als einer Minute mehr als zehntausend Zellen einer jeweiligen Population bzw. Subpopulation zugeordnet werden. Zur genaueren Abgrenzung der NK-Zellen von den restlichen Leukozytenpopulationen, wurden die Leukozyten mit dem Primärantikörper 10/78+ (NK-Zell-spezifischer Antikörper) markiert und diese Zellen anschließend gegated.
Probenvorbereitung
Messungen mit einem Durchflusszytometer erfordern Proben als Einzelsuspension in einer Konzentration von einer Million Partikel/ml.
Zu diesem Zweck wurden etwa 0,5-1 Mio. Zellen (in 50 µl) in jedes Well gegeben und diese anschließend mit 100 µl PBS, 1 % BSA sowie 0,1 % NaN gewaschen. Nachfolgend wurde die Titerplatte für zwei Minuten bei 1800 U/min zentrifugiert und im Anschluss der Überstand abgeschüttet, die Titerplatte getrocknet und die Sedimente etwa 15 Sekunden bei 1200U/min aufgeschüttelt. Jedem Well wurde dann 50 µl 10 %iges Humanserum beigefügt und anschließend bei 1000 U/min fünf Minuten lang durchgemischt. Im Anschluss wurde wieder mit 100 µl Waschmedium gespült, zentrifugiert und der Überstand abgeschüttet, abgetrocknet und resuspendiert. Nachfolgend wurde in jedes Well 50 µl des Primärantikörpers (s. Tabelle 3) hinzugegeben und anschließend 15 Sek. bei 1000 U/min aufgeschüttelt, 20-25 Min. bei 4
°C inkubiert sowie zwei weitere Male gewaschen wie oben beschrieben. Danach wurde in jedes Well 50 µl eines Sekundärantikörpers (s. Tabelle 3) hinzugefügt und das gleiche Procedere wie beim Primärantikörper durchgeführt. Nach dem letzten Aufschütteln wurden in jedes Well 100µl PBS, 0,1 % BSA sowie 0,1 % NaN hinzugegeben und die Zellsuspension anschließend in ein Falcon-Röhrchen zur FACS-Messung überführt. Alle Arbeiten wurden nach Zugabe des ersten Antikörpers auf Eis durchgeführt.
Subpopulation erster Primärantikörper zweiter Primärantikörper
B-Lymphozyten - OX 12FITC+
T-Lymphozyten R 73 PE+(Gesamtheit) -
CD4+ T-Lymphozyten - W3/25 BIO+
CD8+ T-Lymphozyten - OX 8 BIO+
Monozyten-Subpopulationen ED9 PE+ 10/78 FITC+/- W 3/25 BIO+/- OX 8 BIO+/- Natürliche Killer- (NK-)Zellen 10/78 PE+ OX 8 FITC+/-
R 73 BIO+/-
Tabelle 3: Leukozytensubpopulation, Primär- bzw. Sekundärantikörper (+ bedeutet: Antikörper bindet;
-bedeutet: Antikörper bindet nicht).
2.4.2 Immunhistologie
Für die Immunhistologie wurde 10/78+, ein Klon des Mouse Anti Rat CD161 (MCA1427)-Antikörper (Serotec, Oxford, GB), als Primärantikörper verwendet. 10/78+ erkennt in Ratten das CD161 Protein, auch bekannt als NKR-PI, ein 60kD großes Glykoprotein, welches in NK-Zellen sowie T-Zellpopulationen exprimiert wird. Dieser Antikörper entspricht dem Klon 3.2.3. in seiner antigenbindenden Eigenschaft [Serotec 2002].
Die Färbung der Gewebeschnitte erfolgte nach dem Alkalische-Phosphatase-Anti-Alkalische-Phosphatase (APAAP)-System. Dabei wurde der Primärantikörper nach Fixierung (1:1 Mischung; Methanol + Aceton, Merck, Darmstadt, Deutschland) und Trocknung der Schnitte auf die Proben und PBS (98,9 % PBS Seromed 182-10, 1 % BSA (Bovine Serum Albumin;
Serva 11930, 0,1 % Natriumacid Merck, Darmstadt, Deutschland) auf die Kontrollen aufgetragen und bei +4 °C über Nacht in einer Feuchtkammer inkubiert. Die Antikörper, die
nicht an das Antigen gebunden hatten, wurden abgespült und die Proben zweimal mit Tris- Buffered- Saline (TBS)-Tween (TBS + 0,05 % Tween-20 Serva) gewaschen. Dieser letzte Schritt der Spülung und Waschung wurde in den folgenden Schritten wiederholt.
Der Sekundär-Anti-Mausantikörper Z 259 (Dako, Hamburg, Deutschland) wurde anschließend für dreißig Minuten auf die Proben gegeben. Der Sekundär-Antikörper sowie der APAAP- Komplex (1:50 in TBS -Tween verdünnt; APAAP-Mouse Monoclonal Dako D651/1 ml, Hamburg, Deutschland) wurde wiederholt für jeweils 15 Minuten auf die Proben aufgetragen, bevor Fast Red (Sigma, München, Deutschland) als Substrat für die alkalische Phosphatase (20 mg Naphthol-AS-MX-Phosphat (Sigma, München, Deutschland) + 2 ml N,N-Dimethylformamide (Fluka 40240) + 98 ml 0,1 m Tris- Puffer pH 8,2 + 100 µl 1 m Levamisole; Sigma L 9756) für 35 Minuten auf den Gewebeschnitten inkubiert wurden. Nach der Gegenfärbung mit Mayers Hämalaun (Merck, Darmstadt, Deutschland) und zweimaliger Waschung mit PBS (9,55 g/l PBS in aqua dest.) wurden die Präparate mit Glycergel (Dako, Hamburg, Deutschland) eingedeckelt.
2.4.3 NK-Zell-Zytotoxizitätstest (NK-Zell-Assay)
Der NK-Zell-Assay, zur Bestimmung der Zytotoxizität von NK-Zellen, wurde in Kooperation mit Herrn Priv. Doz. Dr. Roland Jacobs vom Institut für Immunologie der Medizinischen Hochschule Hannover durchgeführt. Hierbei wurden Yac-Zellen, die als Targetzellen, dienten, mit Chrom markiert. Diese Zellen exprimieren kein MHC-I und lassen sich leicht permanent in Kultur halten. Aufgrund der Tatsache, dass den Yac-Zellen nun MHC-I fehlte, wurden sie von den NK-Zellen als pathogen eingestuft und lysiert, was zur Freisetzung des Chroms führte. Der anschließende Überstand konnte dann gemessen werden. Als Resultat erhielt man beim Auftragen der prozentualen Lyse gegen die E:T-Ratio einen sigmoiden Kurvenverlauf der Zytotoxizität, der mit Hilfe der von Krogh-Gleichung mathematisch transformiert und dadurch die Zytotoxizitätskurve linearisiert werden konnte. Auf diesem Weg erreichte man eine direkte Proportionalität zwischen Zell-Lyse und der Anzahl der eingesetzten Targetzellen [Jacobs 2005]. Um die Testergebnisse besser vergleichen zu können, wurden sie in lytische Units (LU) umgerechnet [Bryant et al. 1991].
Bevor mit dem NK-Zytotoxizitätstest begonnen werden konnte, musste das entnommene Blut und die Organe speziell vorbereitet werden. Hierzu wurde im Verhältnis 1:1 das Medium RPMI mit dem gewonnen Blut in einem Falcon- Röhrchen gemischt, was zu einer homogenen Suspension führte. Anschließend wurde ebenfalls im Verhältnis 1:1 Ficoll (Amerham Biosciences AB, Bjorkgatan 30 Uppsala, Sweden) beigefügt, so dass auf Grund der nun
heterogenen Mischung zwei Phasen entstanden (Ficoll am Boden und die Blut/Medium Mischung darüber).
Die Organe (Milz und Lunge) wurden jeweils in ein Sieb mit einer Petrischale gelegt und anschließend mit zwei Pinzetten gezupft und immer wieder mit Medium übergossen. In der Petrischale entstand eine Zellsuspension, die mit einer Pasteurpipette in ein Falcon-Röhrchen abpipettiert worden ist und wiederum Ficoll im Verhältnis 1:1 beigefügt wurde.
Nachfolgend wurden die Falcon-Röhrchen bei 400 G 18°C 30 Minuten zentrifugiert und anschließend das PBMC- Pellett, welches sich als dünner weißlicher Saum zwischen der verdünntem Plasma- und Erythrozyten/Granulozyten Schicht befand, mit Hilfe einer Pasteurpipette in ein Falcon- Röhrchen abpipettiert.
Den Zellen wurde nun im Verhältnis 1:2 Medium hinzugefügt und bei 400 G 10 Minuten zentrifugiert. Danach wurde das PBMC- Pelett noch einmal abpipettiert und der Waschschritt wiederholt. Nachfolgend wurde der Überstand abgenommen und dem nun von Thrombozyten und Ficoll-Resten gereinigtem PBMC- Pelett Medium (ca. 2 ml auf 20 ml Zellsuspension- bzw. Blutausgangsvolumen) hinzugefügt.
Vor dem Beginn des NK-Zell-Assay wurden die Yac-Zellen abzentrifugiert und mit radioaktivem Na2CrO4 (Natrium-Chromat) für eine Stunde inkubiert und nach dreimaligem Waschen auf 5x105 Zellen/ml eingestellt. Anschließend wurden die PBMCs (Effektorzellen) auf 3x106 Zellen/ml eingestellt und drei Verdünnungsstufen (1:15, 1:30, 1:60) hergestellt.
Jeweils drei Wells einer Spitzbodenplatte wurden mit je 100 µl der Zellsuspension und den drei Verdünnungen gefüllt und in jedes Well 50 µl Targetsuspension hinzugegeben. Zur Bestimmung der maximalen Chromfreisetzung wurde in drei weiteren Wells 100 µl Medium in 50 µl Targetzellsuspension inkubiert und anschließend 100 µl eines Detergentiums hinzugefügt, welches eine Lyse mit der gewünschten maximalen Chromfreisetzung der Targetzellen hervorruft. Anschließend wurde die Spitzbodenplatte leicht anzentrifugiert und es folgte eine vierstündige Inkubation. Während dieser Zeit sollte es zu spezifischen Targetzelllyse mit Chromfreisetzung kommen. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Zellen durch Zentrifugation am Plattenboden fixiert und 100 µl des Überstandes jedes Wells entnommen und nachfolgend die Zerfälle/min (cpm) in einem Gamma-Counter gemessen.
Hierbei dienten die jeweils drei Parallelansätze der zuverlässigen Mittelwertbestimmung.