Das Ziel dieser Arbeit ist es zu zeigen, in welcher Weise Leptin einen modulierenden Einfluss auf die NK-Zellpopulation hat. Durch die i.v. Applikation von Leptin, NaCl und Poly I:C, einem bekannten NK-Zellaktivator, sollen Unterschiede zwischen normalgewichtigen und diät-induziert adipösen Lewis-Ratten gezeigt werden. Zu diesem Zweck erfolgt mit Hilfe der analytischen Durchflußzytometrie (FACS) eine quantitative Bestimmung der NK-Zellpopulationen und anderer Leukozytensubpopulationen, wie z.B. den T-Zellen, welche der NK-Zell-Population in vielen Eigenschaften sehr ähnlich sind. Gleichzeitig soll mit Hilfe einer immunhistochemischen Färbung das Migrationsverhalten der NK-Zellen bei normalgewichtigen und adipösen Tieren in Lunge, Leber und Milz untersucht werden. Ein Zytotoxizitätstest soll anschließend klären, ob Leptin zu einer Modulation der Aktivität führt.
Zusammenfassend sollen also folgende Fragestellungen geklärt werden:
1. Wie ist die quantitative Wirkung von Leptin bei normalgewichtigen und diät-induziert adipösen Lewis-Ratten auf die NK-Zellen im Blut im Vergleich zu den Kontrollgruppen?
2. Wie ist die quantitative und qualitative Wirkung von Leptin bei normalgewichtigen vs. diät-induziert adipösen Lewis-Ratten auf die Population der NK-Zellen im venösen Blut?
3. Wie unterscheiden sich das Migrationsverhalten und die zytotoxische Aktivität der NK-Zellen in Lunge, Leber und Milz nach Leptinapplikation bei normalgewichtigen und diät-induziert adipösen Lewis-Ratten?
4. Wie stellt sich das Migrationsverhalten von NK-Zellen unter Polyinosinic-Polycytidylic-Acid (Poly I:C) Applikation bei normalgewichtigen und diät-induziert adipösen Lewis-Ratten dar?
5. Wie sieht es mit der therapeutischen Rolle von Leptin bei NK-Zell-vermittelten Immunprozessen aus?
2 Material und Methoden 2.1 Versuchstiere und Haltung
Für die Experimente wurden 18 männliche normalgewichtige Lewis-Ratten mit einem Körpergewicht zwischen 250 g und 290 g sowie 15 männliche diät- induziert adipöse Lewis-Ratten mit einem Körpergewicht zwischen 390 g und 470 g verwendet. Alle Tiere wurden unter standardisierten Bedingungen spezifisch pathogenfrei im zentralen Tierlaboratorium der Medizinischen Hochschule Hannover gehalten. In dem schallgeschützten Raum herrschte ein Hell-Dunkel-Zyklus von jeweils 12h (Tagzyklus von 7 Uhr bis 19 Uhr) und eine Raumtemperatur von 21 ± 1 °C. Der Käfigboden war mit Streu ausgelegt. Das Trockenfutter (Altromin 1234, Altromin GmbH, Lage, Deutschland) und das Trinkwasser standen allen Ratten ad libitum zur Verfügung. Zusätzlich hatten die diät- induzierten adipösen Ratten freien Zugang zu einer hochkalorischen Diät (C1057 fettreiche Diät, Altromin GmbH Lage, Deutschland) in einem Zeitraum von fünf Wochen. Die Tiere wurden in einem Käfig (40 × 26
× 15 cm) aus Propolycarbonat mit Gitterdeckel gehalten, in dem sie sich frei bewegen konnten. Alle in dieser Dissertation durchgeführten Versuche waren von der Bezirksregierung Hannover genehmigt (Aktenzeichen: 04/753).
2.2 Implantation eines Venenkatheters in die Vena jugularis externa 2.2.1 Operationsverfahren
Sowohl die Vorbereitung als auch das Verfahren zur Implantation des permanenten Venenkatheters in die Vena jugularis externa entsprach dem Verfahren nach Nave et al.
[1998]. Die Implantation dauerte ungefähr 60 Min. und wurde während des Tagzyklus durchgeführt, wobei sich die Implantation des Katheters für die normalgewichtigen Lewis-Ratten und die diät- induzierten adipösen Lewis-Lewis-Ratten nicht unterschied.
Jedes Versuchstier wurde unter einer Glassglocke mit 10 ml Isofluran (Wirkstoff: Isofluran, Inhalationsnarkotikum; Abhott GmbH & CO. KG Wiesbaden, Deutschland) inhalativ kurzanästhesiert. Anschließend wurde der Ratte 0,2 ml eines Anästhetikums (0,35 ml Ketamin; Wirkstoff: Ketaminhydrochlorid, zur i.m. und i.v. Injektion; Dr. E. Gräub AG, Bern, Schweiz) + 0,05 ml Domitor (Wirkstoff: Medetomidinhydrochlorid, 10 ml; Pfizer GmbH Karlsruhe, Deutschland) in den rechten Hinterlauf intramuskulär injiziert und das Tier wieder vorsichtig in den Käfig zurückgelegt, um diesem weiteren Stress zu ersparen. Ab diesem Zeitpunkt war des Öfteren einer durch das Anästhetikum initiierter Opisthotonus zu
sehen. Nach einigen Minuten bekam das Tier dann weitere 0,2 ml des Anästhetikums intramuskulär in den linken Hinterlauf injiziert. Zur Dehydratationsprophylaxe wurde der Ratte 0,4 ml 5 % Dextroselösung (2,5mg Dextrose in 50 ml NaCl gelöst) subkutan appliziert.
Anschließend wurde auf die Kornea Bepanthen (Wirkstoff: Dexpanthenol; Hoffmann–La Roche AG Grenzach-Wyhlen, Deutschland)
aufgetragen, um ein Austrocknen, aufgrund des fehlenden Lidschlusses, zu verhindern.
Nach der Rasur und Desinfektion der Inzisionsbereiche auf dem Kopf sowie rechts supraklavikulär, wurden die Reflexe durch Druck auf die beiden Hinterläufe und an der Schwanzspitze getestet. Anschließend wurde ein subkutaner Hautschnitt rechts supraklavikulär gesetzt und das Subkutangewebe mit einer Schere auf ca.
2cm auseinanderdrängend erweitert und die Vena jugularis externa aufgesucht, welche nachfolgend von Bindegewebe frei präpariert wurde. Des Weiteren wurde vom lateralen Wundrand her ein subkutaner Tunnel bis zur Sutura sagittalis des Schädeldachs angelegt
und der vorbereitete Venenkatheter mit Hilfe einer Pinzette durch den Subkutantunnel gezogen. Als nächstes wurde ein Teflonring (innerer Ø 0,9 mm, äußerer Ø 2 mm, bezogen über die Forschungswerkstatt der Medizinischen Hochschule Hannover, Deutschland) 30 mm hinter der Katheterspitze fixiert, welcher als Abstandshalter fungierte, damit der Katheter nicht zu weit in den rechten Vorhof hinein rutschen konnte. Als nächstes wurde die Vena jugularis externa mit einer oberen- und einer unteren Ligatur (PGA- Faden geflochten, beschichtet, 70 cm lang, 3/0 USP; Catgut GmbH Markneukirchen, Deutschland) angehoben und mit einer mikrochirurgischen Schere eine Venotomie durchgeführt. Der Katheter wurde anschließend in die Vene eingeführt. Zum besseren Vorschieben des Katheters in den rechten Vorhof war die Elevation des rechten Vorderlaufs von großer Hilfe (Abb. 1). Der Katheter wurde dann 30 mm bis zum Teflonring vorgeschoben und anschließend überprüft, ob sich Blut über den Katheter aspirieren ließ. Schließlich erfolgte die Fixierung des Katheters innerhalb der Vene, mit Hilfe der beiden Ligaturen und ein anschließendes Ausspülen der
Abb.1: Röntgenaufnahme einer Ratte nach der Implantation eines Katheters in die rechte Vena jugularis externa
Drahtspirale
Wunde mit 0,9 % NaCl-Lösung. Danach wurden die Wundränder mit einer fortlaufenden Naht verschlossen. Der nächste Abschnitt der Operation beinhaltet die Fixierung des Konus auf dem Schädeldach. Dazu wurde die Lewis-Ratte in ein stereotaktischen Apparat (Modell 900, Kopfe Instruments, Tujunga, USA)unter der Beobachtung der Lidschlussreflexe, welche Aufschluss über die richtige Fixierung der Fixierungselemente in den Meati akustici externi geben, eingespannt. Nun wurde, ausgehend von der Öffnung des subkutanen Tunnels der Schnitt nach rostral erweitert und mit einem Skalpell das Subkutangewebe und das Periost entfernt und somit der Schädeldach freigelegt. Nachfolgend wurden zwei Löcher (Ø 1,2 mm) in das linke und rechte Os parietale gebohrt und zwei Mikroschrauben eingesetzt, welche zur sicheren Fixierung des Katheters auf dem Schädeldach unabdingbar waren. Der am Katheter platzierte Spritzenkonus diente hierbei als Auflagevergrößerung der Drahtspirale. Die Mikroschrauben und der Spritzenkonus wurden letztendlich mit dem Auftragen von Zahnzement (Inhalt: Carboxylatzement; Eine Kapsel enthält mindestens eine Menge von 0,41 ml; 3M ESPE AG Seefeld, Deutschland) verbunden und garantieren so eine stabile Fixierung der Drahtspirale bzw. des Katheters. Zum Schluss wurden 0,2 ml einer PVP- Lösung (PVP (Polyrinlypyrolidone) 10 mg + 10 ml 0,9 % NaCl + 5 ml Liquemin®) in den Katheter appliziert, um eine längere Durchgängigkeit zu gewährleisten. Anschließend wurde der Konnektor mit einem Combi Stopper (Hersteller: B. Braun Melsungen AG Melsungen, Deutschland)verschlossen.
2.2.2 Aufhängeapparat
Der Aufbau des Aufhängeapparates kann Abb. 2 entnommen werden. Er sollte zum einen dabei helfen, einen leichten Zug auf die Drahtspirale auszuüben, so dass der Kopf des Tieres von dessen Gewicht befreit wurde und zum anderen das distale Ende der Drahtspirale vor Beschädigungen von Seiten der Ratte bewahren.
2.2.3 Pflege des Kathetersystems und postoperative Betreuung der Tiere
Postoperativ wurden die Tiere mit den Käfigen für 24 h auf elektrische Wärmematten mit einer Temperatur von 27°C gestellt. Aufgrund ihrer eingeschränkten Mobilität nach der
Operation bekamen die Versuchstiere zusätzlich Futter in den Käfig gelegt, um so eine sofortige Nahrungsaufnahme nach ihrem Erwachen (etwa 3-4 h) zu ermöglichen.
Die Tiere bekamen außerdem einen Tag vor und zwei Tage nach der Operation acht Tropfen Novalgin (Wirkstoff: Metamizol- Natrium × 1 H2O 50 ml Tropfen; Ratiopharm GmbH Ulm) ins Trinkwasser zwecks Analgesie. Am dritten postoperativen Tag wurde das Kathetersystem mit einer speziellen Spüllösung gespült [Nave et al. 1998], um den Katheter durchgängig zu halten und die Tiere an Volumenschwankungen, die die Infusionen mit sich bringen, zu gewöhnen. Das Spülen erfolgte jeden zweiten Tag.
2.3 Versuchsdurchführung, Blutentnahme, Perfusion und Organentnahme
Fünf Tage nach der Operation wurden den normalgewichtigen Lewis-Ratten (nw-L) 125 µg und den diät- induziert adipösen Tieren (ob-L) 175 µg rekombinantes humanes Leptin (NatuTec GmbH, Frankfurt, Deutschland) in 1 ml isotonem NaCl (0,9 %) i.v. über den Katheter mit Hilfe eines Perfusors (TSE Technical & Scientific Equipment GmbH Bad Homburg, Deutschland) innerhalb von 60 Min. appliziert. Die Kontrolltiere bekamen ebenfalls innerhalb von 60 Min. 1 ml isotones NaCl. Nach beendeter Applikation wurden die Katheter beider Versuchsgruppen mit 0,2 ml NaCl gespült. Vier Stunden später (gerechnet ab der ersten Viertelstunde nach Applikation) wurden die Tiere mit einem Anästhetikum (0,05 ml Domitor + 0,35 ml Ketamin) i.v über den Venenkatheter narkotisiert (s. Abb. 3). Den letzten zwei Versuchsgruppen wurde Poly I:C (2 mg/kg Körpergewicht) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland) in 0,2 ml Phosphate Buffered Saline (PBS) gelöst als Bolus 24 h vor Anästhesie i.v. verabreicht.
Nach der Narkose wurden Bauch und Thorax eröffnet. Durch die Punktion des linken Ventrikels wurde Vollblut gewonnen, welches in zwei EDTA- Röhrchen (2 ml und 3 ml) aufgeteilt worden war. Für den Chromium release assay dagegen, wurde eine mit Liquemin benetzte 10 ml Spritze verwendet. Anschließend fand eine Inzision des rechten
Abb. 3: Schematischer Ablauf von Leptinapplikation, Blutentnahme, Perfusion und Organentnahme am Beispiel eines beliebigen Versuchstieres
Herzohrs statt. Anschließend wurden 100 ml PBS und nachfolgend 100 ml 4 %-iges Paraformaldehyd in den linken Ventrikel perfundiert. Lunge, Leber und Milz wurden entnommen und unmittelbar in flüssigem Stickstoff gefroren und bis zur immunhistologischen Untersuchung in einer Kühlkammer bei –82°C archiviert. Während ein EDTA- Röhrchen mit Vollblut für die FACS- Analysen genutzt wurden, wurde das zweite EDTA-Röhrchen zentrifugiert und das daraus gewonnene Serum für weitere Analysen abpipettiert.
2.4 Immunologische Untersuchungen
2.4.1 Durchflusszytometer/Flourescence activated cell sorter (FACS)
Das Durchflusszytometer erlaubt die gleichzeitige Messung von Streulicht- und Fluoreszenzsignalen an einzelnen Zellen. Mit Hilfe des Streulichts kann die relative Zellgröße (Vorwärtsstreulicht (FSC)) und die intrazelluläre Granularität (Seitwärtsstreulicht SSC)) jeder Zelle ermittelt und so einer Subpopulation zugeordnet werden. Innerhalb dieser Zellpopulationen können die einzelnen Zellen mit konjugierten Antikörpern, deren Farbstoffe fluoreszieren (Fluorescein-isothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE) für Immunfluoreszenz) in Subpopulationen weiter unterteilt werden. So können in weniger als einer Minute mehr als zehntausend Zellen einer jeweiligen Population bzw. Subpopulation zugeordnet werden. Zur genaueren Abgrenzung der NK-Zellen von den restlichen Leukozytenpopulationen, wurden die Leukozyten mit dem Primärantikörper 10/78+ (NK-Zell-spezifischer Antikörper) markiert und diese Zellen anschließend gegated.
Probenvorbereitung
Messungen mit einem Durchflusszytometer erfordern Proben als Einzelsuspension in einer Konzentration von einer Million Partikel/ml.
Zu diesem Zweck wurden etwa 0,5-1 Mio. Zellen (in 50 µl) in jedes Well gegeben und diese anschließend mit 100 µl PBS, 1 % BSA sowie 0,1 % NaN gewaschen. Nachfolgend wurde die Titerplatte für zwei Minuten bei 1800 U/min zentrifugiert und im Anschluss der Überstand abgeschüttet, die Titerplatte getrocknet und die Sedimente etwa 15 Sekunden bei 1200U/min aufgeschüttelt. Jedem Well wurde dann 50 µl 10 %iges Humanserum beigefügt und anschließend bei 1000 U/min fünf Minuten lang durchgemischt. Im Anschluss wurde wieder mit 100 µl Waschmedium gespült, zentrifugiert und der Überstand abgeschüttet, abgetrocknet und resuspendiert. Nachfolgend wurde in jedes Well 50 µl des Primärantikörpers (s. Tabelle 3) hinzugegeben und anschließend 15 Sek. bei 1000 U/min aufgeschüttelt, 20-25 Min. bei 4
°C inkubiert sowie zwei weitere Male gewaschen wie oben beschrieben. Danach wurde in jedes Well 50 µl eines Sekundärantikörpers (s. Tabelle 3) hinzugefügt und das gleiche Procedere wie beim Primärantikörper durchgeführt. Nach dem letzten Aufschütteln wurden in jedes Well 100µl PBS, 0,1 % BSA sowie 0,1 % NaN hinzugegeben und die Zellsuspension anschließend in ein Falcon-Röhrchen zur FACS-Messung überführt. Alle Arbeiten wurden nach Zugabe des ersten Antikörpers auf Eis durchgeführt.
Subpopulation erster Primärantikörper zweiter Primärantikörper
B-Lymphozyten - OX 12FITC+
T-Lymphozyten R 73 PE+(Gesamtheit) -
CD4+ T-Lymphozyten - W3/25 BIO+
CD8+ T-Lymphozyten - OX 8 BIO+
Monozyten-Subpopulationen ED9 PE+ 10/78 FITC+/- W 3/25 BIO+/- OX 8 BIO+/- Natürliche Killer- (NK-)Zellen 10/78 PE+ OX 8 FITC+/-
R 73 BIO+/-
Tabelle 3: Leukozytensubpopulation, Primär- bzw. Sekundärantikörper (+ bedeutet: Antikörper bindet;
-bedeutet: Antikörper bindet nicht).
2.4.2 Immunhistologie
Für die Immunhistologie wurde 10/78+, ein Klon des Mouse Anti Rat CD161 (MCA1427)-Antikörper (Serotec, Oxford, GB), als Primärantikörper verwendet. 10/78+ erkennt in Ratten das CD161 Protein, auch bekannt als NKR-PI, ein 60kD großes Glykoprotein, welches in NK-Zellen sowie T-Zellpopulationen exprimiert wird. Dieser Antikörper entspricht dem Klon 3.2.3. in seiner antigenbindenden Eigenschaft [Serotec 2002].
Die Färbung der Gewebeschnitte erfolgte nach dem Alkalische-Phosphatase-Anti-Alkalische-Phosphatase (APAAP)-System. Dabei wurde der Primärantikörper nach Fixierung (1:1 Mischung; Methanol + Aceton, Merck, Darmstadt, Deutschland) und Trocknung der Schnitte auf die Proben und PBS (98,9 % PBS Seromed 182-10, 1 % BSA (Bovine Serum Albumin;
Serva 11930, 0,1 % Natriumacid Merck, Darmstadt, Deutschland) auf die Kontrollen aufgetragen und bei +4 °C über Nacht in einer Feuchtkammer inkubiert. Die Antikörper, die
nicht an das Antigen gebunden hatten, wurden abgespült und die Proben zweimal mit Tris- Buffered- Saline (TBS)-Tween (TBS + 0,05 % Tween-20 Serva) gewaschen. Dieser letzte Schritt der Spülung und Waschung wurde in den folgenden Schritten wiederholt.
Der Sekundär-Anti-Mausantikörper Z 259 (Dako, Hamburg, Deutschland) wurde anschließend für dreißig Minuten auf die Proben gegeben. Der Sekundär-Antikörper sowie der APAAP- Komplex (1:50 in TBS -Tween verdünnt; APAAP-Mouse Monoclonal Dako D651/1 ml, Hamburg, Deutschland) wurde wiederholt für jeweils 15 Minuten auf die Proben aufgetragen, bevor Fast Red (Sigma, München, Deutschland) als Substrat für die alkalische Phosphatase (20 mg Naphthol-AS-MX-Phosphat (Sigma, München, Deutschland) + 2 ml N,N-Dimethylformamide (Fluka 40240) + 98 ml 0,1 m Tris- Puffer pH 8,2 + 100 µl 1 m Levamisole; Sigma L 9756) für 35 Minuten auf den Gewebeschnitten inkubiert wurden. Nach der Gegenfärbung mit Mayers Hämalaun (Merck, Darmstadt, Deutschland) und zweimaliger Waschung mit PBS (9,55 g/l PBS in aqua dest.) wurden die Präparate mit Glycergel (Dako, Hamburg, Deutschland) eingedeckelt.
2.4.3 NK-Zell-Zytotoxizitätstest (NK-Zell-Assay)
Der NK-Zell-Assay, zur Bestimmung der Zytotoxizität von NK-Zellen, wurde in Kooperation mit Herrn Priv. Doz. Dr. Roland Jacobs vom Institut für Immunologie der Medizinischen Hochschule Hannover durchgeführt. Hierbei wurden Yac-Zellen, die als Targetzellen, dienten, mit Chrom markiert. Diese Zellen exprimieren kein MHC-I und lassen sich leicht permanent in Kultur halten. Aufgrund der Tatsache, dass den Yac-Zellen nun MHC-I fehlte, wurden sie von den NK-Zellen als pathogen eingestuft und lysiert, was zur Freisetzung des Chroms führte. Der anschließende Überstand konnte dann gemessen werden. Als Resultat erhielt man beim Auftragen der prozentualen Lyse gegen die E:T-Ratio einen sigmoiden Kurvenverlauf der Zytotoxizität, der mit Hilfe der von Krogh-Gleichung mathematisch transformiert und dadurch die Zytotoxizitätskurve linearisiert werden konnte. Auf diesem Weg erreichte man eine direkte Proportionalität zwischen Zell-Lyse und der Anzahl der eingesetzten Targetzellen [Jacobs 2005]. Um die Testergebnisse besser vergleichen zu können, wurden sie in lytische Units (LU) umgerechnet [Bryant et al. 1991].
Bevor mit dem NK-Zytotoxizitätstest begonnen werden konnte, musste das entnommene Blut und die Organe speziell vorbereitet werden. Hierzu wurde im Verhältnis 1:1 das Medium RPMI mit dem gewonnen Blut in einem Falcon- Röhrchen gemischt, was zu einer homogenen Suspension führte. Anschließend wurde ebenfalls im Verhältnis 1:1 Ficoll (Amerham Biosciences AB, Bjorkgatan 30 Uppsala, Sweden) beigefügt, so dass auf Grund der nun
heterogenen Mischung zwei Phasen entstanden (Ficoll am Boden und die Blut/Medium Mischung darüber).
Die Organe (Milz und Lunge) wurden jeweils in ein Sieb mit einer Petrischale gelegt und anschließend mit zwei Pinzetten gezupft und immer wieder mit Medium übergossen. In der Petrischale entstand eine Zellsuspension, die mit einer Pasteurpipette in ein Falcon-Röhrchen abpipettiert worden ist und wiederum Ficoll im Verhältnis 1:1 beigefügt wurde.
Nachfolgend wurden die Falcon-Röhrchen bei 400 G 18°C 30 Minuten zentrifugiert und anschließend das PBMC- Pellett, welches sich als dünner weißlicher Saum zwischen der verdünntem Plasma- und Erythrozyten/Granulozyten Schicht befand, mit Hilfe einer Pasteurpipette in ein Falcon- Röhrchen abpipettiert.
Den Zellen wurde nun im Verhältnis 1:2 Medium hinzugefügt und bei 400 G 10 Minuten zentrifugiert. Danach wurde das PBMC- Pelett noch einmal abpipettiert und der Waschschritt wiederholt. Nachfolgend wurde der Überstand abgenommen und dem nun von Thrombozyten und Ficoll-Resten gereinigtem PBMC- Pelett Medium (ca. 2 ml auf 20 ml Zellsuspension- bzw. Blutausgangsvolumen) hinzugefügt.
Vor dem Beginn des NK-Zell-Assay wurden die Yac-Zellen abzentrifugiert und mit radioaktivem Na2CrO4 (Natrium-Chromat) für eine Stunde inkubiert und nach dreimaligem Waschen auf 5x105 Zellen/ml eingestellt. Anschließend wurden die PBMCs (Effektorzellen) auf 3x106 Zellen/ml eingestellt und drei Verdünnungsstufen (1:15, 1:30, 1:60) hergestellt.
Jeweils drei Wells einer Spitzbodenplatte wurden mit je 100 µl der Zellsuspension und den drei Verdünnungen gefüllt und in jedes Well 50 µl Targetsuspension hinzugegeben. Zur Bestimmung der maximalen Chromfreisetzung wurde in drei weiteren Wells 100 µl Medium in 50 µl Targetzellsuspension inkubiert und anschließend 100 µl eines Detergentiums hinzugefügt, welches eine Lyse mit der gewünschten maximalen Chromfreisetzung der Targetzellen hervorruft. Anschließend wurde die Spitzbodenplatte leicht anzentrifugiert und es folgte eine vierstündige Inkubation. Während dieser Zeit sollte es zu spezifischen Targetzelllyse mit Chromfreisetzung kommen. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Zellen durch Zentrifugation am Plattenboden fixiert und 100 µl des Überstandes jedes Wells entnommen und nachfolgend die Zerfälle/min (cpm) in einem Gamma-Counter gemessen.
Hierbei dienten die jeweils drei Parallelansätze der zuverlässigen Mittelwertbestimmung.
2.5 Histologische Auswertung
Die Histologie wurde am Axiophot-Mikroskop (Zeiss, Jena, Deutschland) blind ausgewertet.
Verwendet wurde ein Objektiv mit 5 und 20-facher Vergrößerung. Die Präparate wurden
zunächst in der Übersichtsvergrößerung betrachtet, um die Qualität von Färbung und Schnitt zu beurteilen. Auf jedem Objektträger befanden sich 6-8 Schnitte, von denen fünf randomisiert zur Auszählung herangezogen worden sind. Die Schnittflächen der Organe variierten in ihrer Größe. So wurden die NK-Zellen in Leber und Milz auf einer Fläche von 25 Quadratmillimeter und in der Lunge von 15 Quadratmillimeter pro Organschnitt ausgezählt und anschließend die Kontroll- und Versuchsgruppen statistisch ausgewertet.
2.6 Statistische Auswertung
Alle Daten der quantitativen Auswertungen im Ergebnisteil sind dargestellt als Mittelwerte ± Standardfehler (standard error of the mean, SEM). Zur Analyse der Effekte von Leptin, NaCl und Poly I:C auf das Migrationsverhalten sowie die Modulation der Aktivität von NK-Zellen wurde eine ANOVA- Analyse durchgeführt, mit „Applikationssubstanz“ als Faktor und
„Anzahl der Zellen“ als abhängige Variable. Signifikante Effekte der Leptin- und Poly I:C- Applikation einer Gruppe (normalgewichtige Ratte bzw. diät-induzierte adipöse Ratten) gegenüber der jeweiligen Kontrollgruppe (NaCl) wurde in den dargestellten Abbildungen durch Sternchen markiert: * p < 0,05. Signifikante Effekte nach Leptin-, NaCl- und Poly I:C- Applikation der einen Gruppe (Normalgewichtige Ratten) gegenüber Leptin-, NaCl- und Poly I:C-Applikation der anderen Gruppe (diät-induzierte adipöse Ratten) wurden durch Rauten markiert: # p < 0,05. Signifikante Effekte von Leptin- gegenüber Poly I:C- Applikation der jeweiligen Gruppe wurden mit einem Paragraphenzeichen markiert: § p <0,05.
Die statistische Auswertung der vorliegenden Daten wurde mit Hilfe der Software StatView 5.0 für Windows durchgeführt. Die Software Prism 3.03 diente der anschließenden grafischen Aufarbeitung der Daten.
3 Ergebnisse
3.1 Quantitative Auswertung der Leukozytenpopulationen im peripheren Blut 3.1.1 Leukozyten
Vier (NaCl bzw. Leptin) bzw. 24 Stunden (Poly I:C) nach i.v. Applikation ist die Leukozytenzahl der normalgewichtigen Leptin-Versuchsgruppe signifikant (p < 0,001) um 65
% gegenüber der NaCl-Kontrollgruppe erhöht. Die normalgewichtige Leptin-Versuchsgruppe hat zudem mit etwa 18,5 % eine signifikant erhöhte Zellzahl gegenüber der diät-induziert adipösen Leptin-Versuchsgruppe. Ebenfalls signifikante Effekte (p < 0,001) sind bei den normalgewichtigen Ratten zwischen der Leptin und Poly I:C-Gruppe zu erkennen. Hierbei ist die Leukozytenzahl der normalgewichtigen Leptin-Versuchsgruppe um etwa 139 % höher, als die der Poly I:C-Gruppe, welche ihrerseits im Vergleich zur Kontrolle um etwa 31 % erniedrigt ist. Ähnliches gilt auch für die Poly I:C-Gruppe der diät-induziert adipösen Ratten, bei denen die Anzahl der Leukozyten gegenüber der diät-induzierten adipösen Leptin-Versuchsgruppe um 45 % signifikant erniedrigt ist. Die Zellzahl der diät-induzierten adipösen Leptin-Versuchsgruppe ist im Vergleich zur NaCl-Kontrolle um 66 % erhöht. Wohingegen die beiden NaCl-Versuchsgruppen sowie die beiden Poly I:C-Gruppen sich in der Leukozytenzahl kaum unterscheiden.
NaCl Leptin Poly I:C NaCl Leptin Poly I:C
0
Abb. 4: Anzahl der Leukozyten im peripheren Blut nach i.v. Applikation. Signifikante Unterschiede der Leptin bzw. Poly I:C-Versuchsgruppe gegenüber der NaCl-Kontrollgruppe sind mit * markiert (p < 0,05).
Signifikante Unterschiede der adipösen gegenüber den normalgewichtigen Tiere in einer Gruppe sind mit #
Signifikante Unterschiede der adipösen gegenüber den normalgewichtigen Tiere in einer Gruppe sind mit #