Eidg. Anstalt für das forstliche Versuchswesen, CH-8903 Birmensdorf
Nr. 154, 1976
Heidi Keller
Histologische und physiologische Untersuchungen an Forstpflanzen in einem Fluorschadensgebiet
Mit
12Abbildungen und
13Tabellen
Die Eidg. Anstalt für das forstliche Versuchswesen hat den Zweck, durch wissenschaftliche Versuche, Untersuchungen und Beobachtungen der schweize- rischen Forstwirtschaft in ihrem vollen Umfange eine sichere Grundlage zu verschaffen (Bundesbeschluss betreffend die Gründung der EAFV) .
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Untersuchungen an Forstpflanzen in einem Fluorschadensgebiet
KURZZUSAMMENFASSUNG
zwei Fichtenklone sowie weitere klonisierte Forst- pflanzen (laubwerfende Arten) wurden in einem Fluor-Im- missionsgebiet, in verschiedenen Abständen vom Emittenten, ausgesetzt. Im Mittelpunkt der Untersuchungen stand die Wirkung des erhöhten Fluorgehaltes in der Luft auf den Stoffwechsel der Pflanzen. Dabei wurden den beiden Fich- tenklonen verschiedene Dünger verabreicht (NH4N03, K2S04), um zu ermitteln, ob der Ernährungszustand der Pflanzen deren Fluorempfindlichkeit beeinflussen könne.
Neben einigen phänologischen und histologischen Untersuchungen galten unsere Betrachtungen vor allem der Peroxydaseaktivität, dem Gehalt an Chlorophyll a und b, der Konzentration reduzierender Zucker, freier Amino- säuren und der Phenole. Ausserdem wurden die Wasserbe- ziehungen einiger Laubbäume beobachtet.
Heidi Keller
HISTOLOGISCHE UND PHYSIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN AN FORSTPFLANZEN
IN EINEM FLUORSCHADENSGEBIET
Mit 12 Abbildungen und 13 Tabellen
Bericht Nr. 154 der Eidgenössischen Anstalt für das forstliche Versuchswesen CH 8903 Birmensdorf
Herausgeber: Dr. W. Bosshard, Direktor April 1976
Anschrift der Verfasserin:
Frau Dr. H. Flückiger-Keller, Baumgartenweg 15, CH 4124 Schönenbuch
Diese Arbeit wurde am 21. Januar 1974 von der Philosophisch-Naturwissen- schaftlichen Fakultät der Universität Basel als Dissertation angenommen.
INHALT
KURZZUSAMMENFASSUNG
VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN VERZEICHNIS DER TABELLEN 1 EINLEITUNG
2 FRAGESTELLUNG
3 HISTOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN 3.1 Kristallbildungen
3.1.1 Material und Methodik 3.1.2 Resultate
3.1.3 Diskussion 3.2 Thyllenbildung
3.2.1 Material und Methodik 3.2.2 Resultate
3.2.3 Diskussion 4 PHYSIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN
4.1 Peroxydase
4.1.1 Material und Methodik 4.1.2 Resultate
4.1.3 Diskussion 4.2 Chlorophyll
4.2.1 Material und Methodik 4.2.2 Resultate
4.2.3 Diskussion
4.3 Zucker, Aminosäuren, Phenole (Gerbsäuren) 4.3.1 Material und Methodik
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11 14 14 14 15 15 17 17 18 18 20 20 20 22 26 26 26 27 32 33 33 4.3.1.1 Zuckerbestimmung nach der Anthronmethode 34 4.3.1.2 Bestimmung der freien Aminosäuren 34 4.3.1.3 Bestimmung des Totalphenolgehaltes 35
4.3.1.4 Chromatogramme 36
4.3.2 Resultate 4.3.3 Diskussion 4.4 Wasserhaushalt
4.4.1 Material und Methodik 4.4.1.1 Saugspannung
4.4.1.2 Oeffnungszustand der Stomata
36 38 47 47 47 47
4.4.2 Resultate 4.4.3 Diskussion 5 AUSWIRKUNGEN DER DÜNGUNG 6 SCHLUSSFOLGERUNGEN 7 ZUSAMMENFASSUNG
RESUME RIASSUNTO SUMMARY
8 LITERATURVERZEICHNIS VERDANKUNG
6
Seite 48 58 60 63 64 67 70 74 78 82
VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN
1 Fluorgehalte der Luft in verschiedenen Entfernungen vom Emittenten im Jahre 1973
2 Peroxydaseaktivität in Fichtennadeln
3 Gesamtchlorophyllgehalt in den Nadeln gedüngter Fichten im Verlaufe einer Vegetationsperiode unter F-Immissionseinfluss 4 Gehalt an Chlorophyll a und b i n den Nadeln gedüngter Fichten
im Verlaufe einer Vegetationsperiode unter F-Immissionsein- fluss
5 Gehalt an Inhaltsstoffen bei Lärche, Platane und Birke in verschiedener Entfernung vom Emittenten
6 Zuckergehalt in den Nadeln gedüngter Fichten im Verlaufe einer Vegetationsperiode unter F-Immissionseinfluss
7 Totalphenolgehalt in den Nadeln gedüngter Fichten im Verlaufe einer Vegetationsperiode unter Einfluss von F-Immissionen 8 Gehalt freier Aminosäuren in den Nadeln gedüngter Fichten im
Verlaufe einer Vegetationsperiode unter Einfluss von F-Immissionen
9 Verhältnis des Gehaltes an freien Aminosäuren und an Zucker in den Nadeln gedüngter Fichten im Verlaufe einer Vegeta- tionsperiode
10 Gehalt an Trockensubstanz in Fichtennadeln gedüngter und ungedüngter Bäume im Verlaufe einer Vegetationsperiode unter Einfluss von F-Immissionen
11 Saugspannung im Verlaufe eines Tages in Abhängigkeit von Standort und Distanz vom Emittenten bei Schwarzerle, Birke und Platane
12 Oeffnungszustand der Stomata in Abhängigkeit von Tageszeit und Standort bei Platane, Birke und Schwarzerle
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VERZEICHNIS DER TABELLEN
1 Bildung von F-haltigen Kristallen im Zellsaft von Kartof- felsprossen in AbhängigkeitvonSteighöhe und Konzentration der angebotenen NaF-Lösung
2 Anzahl der im Herbst gebildeten Thyllen pro Blattstiel- Querschnitt unter starkem bzw. schwachem Fluor-Immissions- einfluss
3 Einfluss des Ernährungszustandes auf die Peroxydase- aktivität von Fichten
4 Gesamtchlorophyllgehalt in den Nadeln gedüngter Fichten im Verlaufe einer Vegetationsperiode unter F-Immissionseinfluss 5 Gehalt an Chlorophyll a und bin den Nadeln gedüngter Fichten
im Verlaufe einer Vegetationsperiode unter F-Immissions- einfluss
6 Zuckergehalt in den Nadeln K-gedüngter, N-gedüngter und ungedüngter Fichten im Verlaufe einer Vegetationsperiode 7 Gesamtphenolgehalt in den Nadeln K-gedüngter, N-gedüngter
und ungedüngter Fichten im Verlaufe einer Vegetations- periode
8 Gehalt an freien Aminosäuren in den Nadeln K-gedüngter, N-gedüngter und ungedüngter Fichten im Verlaufe einer Vegetationsperiode
9 Trockensubstanz von Nadeln K-gedüngter, N-gedüngter und ungedüngter Fichten im Verlaufe einer Vegetationsperiode 10 Saugspannung im Verlaufe eines Tages in Abhängigkeit von
der Distanz vom Emittenten bei Schwarzerle, Birke und Platane
11 Saugspannung im Verlaufe eines Tages in Abhängigkeit von der Distanz vom Emittenten bei Schwarzerle, Birke und Platane
12 Saugspannung am frühen Nachmittag in Abhängigkeit von der Distanz vom Emittenten bei Schwarzerle, Birke und Platane 13 Oeffnungszustand der Stomata in Abhängigkeit von Tageszeit
und Distanz vom Emittenten bei Platane, Birke und Schwarzerle
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l EINLEITUNG
Schon im letzten Jahrhundert befassten sich Wissenschaf- ter mit dem Rauchschadenproblem. Die praktische Bedeutung auf den Gebieten der Lufthygiene, der Land- und der Forstwirt- schaft ist indessen in der Schweiz erst in letzter Zeit, im Zusammenhang mit der fortschreitenden Industrialisierung, ei- ner breiteren Oeffentlichkeit bewusst geworden.
Vor allem in den vergangenen 20 Jahren sind zahlreiche Bücher und Hunderte von Einzelveröffentlichungen über die Schädlichkeit gewisser Abgase und über Massnahmen zur Verhü- tung weiterer Schäden erschienen. Es seien hier nur einige Zu- sammenstellungen der jeweils neuesten Literatur erwähnt:
THOMAS (1951), KELLER (1964) ,(GARBER 1967 und 1973).
Immissionsschäden treten besonders augenfällig an Wäl- dern in Erscheinung. Das bedeutet nicht, dass krautige Pflan- zen nicht ebenso empfindlich auf Schadgase reagieren können.
In der Landwirtschaft besteht aber meistens die Möglichkeit, auf rauchhärtere Sorten umzustellen, was in Wäldern, bedingt durch das hohe wirtschaftliche Alter der Forstpflanzen, pro- blematischer ist.
Neben den akuten Schädigungen, bei denen oft weite Wald- gebiete durch das Einwirken hoher Schadstoffkonzentrationen zerstört werden, können durch geringe Konzentrationen, die langfristig wirksam sind, chronische Schädigungen auftreten.
Diese lassen sich oftmals an sichtbaren Symptomen wie Chloro- sen, Nekrosen, Verformungen der Blätter, verkümmerter Wuchs oder verfrühter Blattfall erkennen. Diese chronischen Schädi- gungen brauchen nicht unbedingt zum Absterben der Bäume zu führen; sie stellen aber stets einen bedeutenden ästhetischen und wirtschaftlichen Schaden dar. Als Gegenmassnahme kommt für die Urproduktion in solchen Gebieten wohl nur eine Neuauf- forstung mit rauchhärteren Baumarten in Frage.
10
An die Zonen mit sichtbaren akuten oder chronischen Schä- digungen schliesst sich eine solche mit unsichtbaren Schädi- gungen an. Hier fällt den physiologischen Untersuchungsmetho- den eine praktische Bedeutung zu: Die Beeinträchtigung der Assimilation, der Enzymaktivitäten oder Störungen im Wasser- haushalt zeigen eine Gefahr an, der möglicherweise mit geziel- ten Gegenmassnahmen, wie z.B. einer Düngung, die die physiolo- gischen Funktionen optimal unterstützt, noch rechtzeitig be- gegnet werden kann.
2 FRAGESTELLUNG
In der vorliegenden Arbeit wurde mit histologischen und physiologischen Testmethoden versucht, unsichtbare Schädigun- gen in einem Fluorschadengebiet nachzuweisen und, bei einem Teil der Pflanzen, die Wirkung verschiedener Dünger auf diese Schädigungssymptome zu untersuchen.
Zum Schutze vor Fluorirnrnissionen wurde schon von THOMAS (1961) eine Spritzung von Forstpflanzen mit Kalkmilch angewen- det, wodurch sich die Schäden erheblich gemildert haben sollen.
Die oberflächlich haftenden Ca-Ionen vermögen offenbar die Fluorionen zu binden und dadurch so zu inaktivieren, dass das schwerlösliche CaF 2 kaum mehr ins Blatt einzudringen vermag.
Es stellt sich deshalb die Frage, ob Ca durch eine entspre- chende Düngung in dem Masse in der Pflanze angereichert werden könne, dass es die durch die Spaltöffnungen eindringenden Fluorionen abfangen und neutralisieren könnte. In diesem Falle dürften sich die typischen Kristallformen mikroskopisch auffin- den und möglicherweise sogar im Gewebe lokalisieren lassen.
Verschiedentlich wurde darauf hingewiesen, dass fluorbe- einflusste Pflanzen einen gestörten Wasserhaushalt aufweisen.
Besonders zu erwähnen ist hier die Arbeit von NAVARA (1972), in welcher bei relativ geringen Fluorkonzentrationen in der Luft eine deutliche Erhöhung der Transpiration am frühen Nach- mittag festgestellt wurde. Dieser Befund stimmte auch überein mit den Beobachtungen KOCHS (1957), der mit
so
2-begasten Fich- ten arbeitete. Ein Ansteigen der Transpiration lässt sich, bei vergleichbaren klimatischen Bedingungen, nur durch eine Verän- derung des Saugspannungsgefälles zwischen Pflanze und Boden erklären. Diese kann z.B. auf osmotischem Wege oder durch eine Störung des Spaltenschlussmechanismus eintreten. Auch histolo- gische Veränderungen im Leitsystem können die Transpiration be- einflussen. POOVAIAH und WIEBE (1969) konnten an fluorbegasten Geranien eine Zunahme der Thyllenbildung in den Gefässen fest- stellen; allerdings erst nachdem die Pflanzen mehr oder weni-12
ger deutlich sichtbare Schädigungen aufwiesen. Wir stellten uns daher die Frage, ob auch Forstpflanzen an ihrem natürli- chen Standort ähnlich reagieren.
Eine weitere Möglichkeit, Genaueres über den gestörten Wasserhaushalt zu erfahren, sind Saugspannungsmessungen in Zu- sammenhang mit dem Oeffnungszustand der Stomata. Bei schwer geschädigten Blättern soll die Saugspannung stark absinken
(HALBWACHS, 1968). Bei kleinen F-Gehalten in der Luft, bei de- nen noch keine äusserlich sichtbaren Schädigungen auftreten, könnten die Verhältnisse aber anders liegen. MAJERNIK (1970) hat z.B. nach SO2-Einwirkung eine Vergrösserung der Spalten- weite beobachtet, ein Verhalten, das in bezug auf F-Immissio- nen noch zu untersuchen wäre.
Enzyme reagieren besonders empfindlich auf Immissionen.
Als geeigneter Rauchschadenindikator hat sich nach KELLER und SCHWAGER (1971) und KELLER (1974) die Peroxydase erwiesen.
Die Aktivität dieses Enzyms wird nicht nur bei zunehmender Al- terung der Pflanze, sondern auch bei zunehmender Luftverschmut- zung gesteigert. Diese in-vivo-Resultate stehen allerdings im Widerspruch zu den Untersuchungen von HEWITT und NICHOLAS
(1963), die in vitro eine fluorinduzierte Hemmung der Peroxy- daseaktivität beobachteten. Im Rahmen der vorliegenden Unter- suchungen wurde die Peroxydase herangezogen, um festzustellen, erstens,ob die Pflanzen von Fluor beeinflusst seien und zwei- tens, ob sich die Peroxydaseaktivität unter dem Einfluss einer Düngung verändert. Nach NIKOLAEVSKIJ (1970) ist bei rauchhar- ten Bäumen im Sommer eine Erhöhung, bei weniger resistenten Bäumen hingegen eine Senkung der Peroxydaseaktivität zu erwar- ten.
Auf die Chlorophyllsynthese sollen F-Immissionen einen hemmenden Einfluss ausüben, ohne das Verhältnis Chlorophyll a/b wesentlich zu verändern (WEINSTEIN, 1961; WARTERESIEWICZ, 1968). Es sollte daher untersucht werden, ob die Verminderung dieses Blattfarbstoffes, welcher bei der Photosynthese uner-
lässlich und damit für die Pflanze lebensnotwendig ist, durch eine Düngung behoben werden kann.
Die nachgewiesene Verminderung der Photosynthese unter F-Einfluss (KELLER, 1973a, b) lässt einen gestörten Stoffwech- sel erwarten, der sich möglicherweise durch Veränderungen im Gehalt gewisser Inhaltstoffe erkennen liesse. Als Folge davon könnten unter Umständen Sekundär-Schädigungen durch Insekten oder Mikroorganismen auftreten; vor allem eine Veränderung des Zucker/Aminosäuren-Verhältnisses soll in dieser Richtung wir- ken (SCHWENKE, 1962). Der Zuckergehalt in F-begasten Bohnen- und Tomatenpflanzen ging bei den in-vitro-Versuchen von WEIN- STEIN (1961) zurück. Einen sehr grossen Einfluss soll das Fluor auf die einzelnen freien Aminosäuren (AS) verschiede- ner Pflanzen ausüben; selbst in nicht sichtbar geschädigten Blättern konnte ein eindeutiger Anstieg des AS-Gehaltes nach- gewiesen werden (ARNDT, 1970). Erhöhte Gerbstoffgehalte wur- den bei Forstpflanzen festgestellt, die F-Immissionen ausge- setzt waren (YEE-MEILER, 1974). Eine Erhöhung der Gerbstoff- gehalte wurde auch als Reaktion auf Pilzbefall bei Tomaten festgestellt (MATTA et al., 1967). Es stellte sich daher die Frage, ob unterschiedliche natürliche Gehalte an Gerbstoffen, Zucker bzw. freien Aminosäuren verschiedener Arten in einer Beziehung zu ihrer Immissionsresistenz stehen könnten.
Für die forstliche Praxis bedeutsam ist die Frage, ob durch eine Düngung die Widerstandskraft von Waldbäumen gestei- gert werden kann. Die darüber bisher veröffentlichte Literatur ist recht widersprüchlich, doch scheint es weitgehend gesi- chert, dass die Düngung nur in Gebieten mit schwachen Immissio- nen Aussicht auf Erfolg hat. Hinweisen auf den günstigen Ein- fluss einer N-Düngung, vgl. z.B. ZAHN (1963), DÄSSLER (1968), stehen Untersuchungen mit negativen Resultaten, z.B. MATERNA
(1962), RANFT (1966), McCUNE et al. (1966), gegenüber.
14 3 HISTOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN
3.1 Kristallbildungen
3.1.1 Material und Methodik
In Vorversuchen musste, zur späteren Identifikation, zu- erst die Bildung von Fluoridkristallen unter verschiedenen Be- dingungen beobachtet werden. Als Versuchspflanzen wurden Mauer- pfeffer ( Sedum spec.) und Kartoffel ( Solanum tuberosum) gewählt, da sich beide Arten, zumindest in ihren oberirdischen Teilen, durch einen hohen Gehalt an gelöstem oder leicht löslichem Kal- zium auszeichnen.
Es wurde an Mauerpfeffer untersucht, ob Fluor, welches in Form von NaF auf die Blattoberfläche gesprüht wurde, ins Blattinnere einzudringen vermag. Bei einer Topfpflanze mit drei Aesten wurden zu diesem Zweck zwei Aeste periodisch wäh- rend 14 Tagen mit je 7.5 ml 2% NaF-Lösung besprüht; ein Ast wurde als Kontrolle unbesprüht belassen. Nach dieser Zeit wur- de dem Blatt Zellsaft entnommen, wobei darauf geachtet wurde, dass dieser nicht mit der besprühten Blattoberfläche in Berüh- rung kam. Dieser Zellsafttropfen wurde zuerst frisch, dann in eingetrocknetem Zustand auf CaF2-Kristalle untersucht.
In Zellsaftproben aus Blättern und Sprossen von Kartoffel- stauden aus einem F-Immissionsgebiet konnte keine Kristallisa- tion festgestellt werden. Offenbar war die Immissionsdauer zu kurz bzw. die Konzentration zu gering oder das Fluor lag in anderer Form gebunden vor.
Um die Reaktion mit Ca überhaupt verfolgen zu können, musste auf irgend eine Weise eine grössere Menge an Fluor ins Pflanzeninnere verfrachtet werden. Dies liess sich am besten erreichen, indem die Wurzeln von Kartoffelpflanzen abgeschnit- ten und der Sprossteil direkt in NaF-Lösung eingestellt wurde, so dass die Fluorionen mit dem Transpirationsstrom in den
Spross gelangen konnten. Ein selektives Zurückhalten des Fluors durch die Wurzel konnte auf diese Weise vermieden wer- den.
Nachdem die Schnittstellen der Sprosse drei Tage lang ca.
2 cm tief in je 90 ml 0.001 - 1 M NaF-Lösung eingetaucht waren, zeigten sie mit steigendem Fluorgehalt eine abnehmende Turges- zenz. In verschiedener Entfernung zur ersten Schnittstelle
(Steighöhe) wurden sodann Querschnitte auf die Bildung fluor- haltiger Kristalle untersucht.
3.1.2 Resultate
Es zeigten sich äussere Schädigungen, vor allem an den Sprossenden der besprühten Aeste des Mauerpfeffers. Der Spross war stellenweise braun verfärbt und eingeschnürt und die jüng- sten Blätter waren teilweise völlig vertrocknet. Trotzdem fan- den sich keine CaF2-Kristalle, weder in frischen, noch in ein- getrockneten Zellsafttropfen.
Wie Tabelle 1 zeigt, fiel NaF, das in grossen Mengen von den Kartoffelsprossen aufgenommen worden war, als solches im Zellsaft aus. Bei niedrigen Konzentrationen wurde stets zu- erst MgF2 und erst nachher CaF2 gebildet.
3.1.3 Diskussion
Auf der Blattoberfläche vonSedum hatte sich eine Salzkru- ste gebildet, die ausschliesslich aus NaF bestand. Die auf- gesprühte Fluoridlösung konnte in der gewählten hohen Konzen- tration offenbar nicht oder kaum durch die Spaltöffnungen bzw.
durch die Cuticula ins Blatt eindringen. Der wachsartige Ueber- zug der Sukkulentenblätter mochte ebenfalls hinderlich gewesen sein. Kleinere Sprühkonzentrationen hätten das Eindringen mögli- cherweise erleichtert, doch wurden die Versuche,der weit grös- seren praktischen Bedeutung wegen, an Kartoffeln weitergeführt.
16
Tabelle 1 Bildung von F-haltigen Kristallen im Zellsaft (inkl. Xylem- flüssigkeit) von Kartoffelsprossen,in Abhängigkeit von Steig- höhe und Konzentration der angebotenen NaF-Lösung
Kristallbildung: ++ deutlich, + schwach, - nicht erfassbar
NaF-Konzentration F-haltige Steighöhe
Kristalle
im Zellsaft 5 cm 10 cm 15 cm 20 cm
Nullprobe NaF -
-
--
MgF2 -
- - -
CaF2
-
-- -
10-)M NaF -
-
--
MgF2 ++ + + +
CaF2 + -
- -
10 -2 M NaF - -
-
-MgF2 ++ ++ + +
CaF2 ++ -
- -
10-lM NaF * ++ ++ ++ ++
MgF2 - -
- -
CaF2 - -
-
-1 M NaF * ++ ++ ++ ++
MgF2
- - - -
CaF2 -
- -
-* Die NaF-Kristalle gingen nicht in Lösung, sondern lagen schon im fri- schen Zellsaft vor. Die MgF2-Kristalle und die CaF2-Kristalle bildeten sich oft erst 40 bis 60 Minuten nach der Zellsaftentnahme.
Da aber auch hier erst hohe Fluorgehalte zu einer deutli- chen Kristallbildung führten, muss diese mikroskopische Unter- suchungsmethode als ungeeignet betrachtet werden. Nach JACOB- SON (1962) soll nur ein geringer Anteil des ins Blatt eindrin- genden Fluors organisch gebunden werden, so dass sich vermu- ten lässt, dass sowohl eine Ca- als auch eine Mg-Düngung
entgiftend wirken könnte, sofern diese zweiwertigen Ionen von der Pflanze überhaupt vermehrt aufgenommen und in die Assirni- lationsorgane transportiert würden.
Es fragt sich, ob die Resistenz gewisser Pflanzen u.a. in einem Zusammenhang stehen könnte mit dem natürlichen Ca- bzw.
Mg-Gehalt in deren oberirdischen Teilen. In der Arbeit von JUVAN (1967) erwiesen sich z.B. der Ca-arme Mais als besonders empfindlich gegenüber F-Immissionen, was in einer erheblichen Ertragsverminderung zum Ausdruck kam; Kartoffeln zeigten hinge- gen überhaupt keine Reaktion.
3.2 Thyllenbildung
Thyllen entstehen durch das Einwachsen von Holzparenchyrn- zellen in einzelne Gefässe der Leitbündel. Sie treten normaler- weise erst im Herbst, vor dem Blattfall, in den Blattstielen auf. POOVAIAH (1969) zeigte an F-begasten Geranien, dass die Thyllenbildung durch F induziert werden kann.
3.2.1 Material und Methodik
Im Feldversuch wurden Blattstielproben von einem Standort mit relativ starken Fluorimmissionen verglichen mit solchen von einem Standort mit geringen Fluorimmissionen (Nullprobe).
Es handelte sich bei den Versuchspflanzen durchwegs um kloni- siertes Material, damit die individuellen genetisch bedingten·
Unterschiede weitgehend ausgeschaltet werden konnten.
Vertopfte Robinien ( Robinia pseudaaaaia ) , Schwarzerlen ( AZ.nus gZ.utinosa ) , Birken ( Betul.a verruaosa) und Platanen ( PZ.ata- nus spec.) waren in verschiedenen Abständen zur Emissionsquel- le, in der Hauptwindrichtung, in Waldlichtungen gesetzt wor- den. Die Zusammensetzung der humosen Topferde (60% Torf, 30%
Waldkornpost, 10% Gartenerde) war dank der grossen Pufferkapazi-
18
tät geeignet, über Jahre hinweg einen einigermassen konstante pH-Wert zu gewährleisten, trotz der sauren HF-Abgase, welche von Nadeln und Blättern ausgefiltert und mit jedem Regen in den Boden gespült werden.
3.2.2 Resultate
Bei den ersten Stichproben, die Ende Ju.li entnommen wur- den, konnte noch nirgends eine Thyllenbildung nachgewiesen werden. Die Resultate einer zweiten Probeentnahme, Ende Okto- ber, sind in Tabelle 2 zusammengestellt. Zur mikroskopischen Untersuchung genügte in der Regel ein schwaches Erwärmen der Glycerinpräparate, um alle Luft aus den Schnitten zu verdrän- gen und damit die Thyllen deutlich sichtbar zu machen.
3.2.3 Diskussion
Ein gestörter Wasserhaushalt, wie er in F-Immissionsge- bieten bei Forstpflanzen auftritt, kann verschiedene Ursacher haben: Zum Beispiel könnte der Ferntransport des Wassers im Xylem durch die zunehmende Reibung, welche als Folge der Thy:
lenbildung durch die Veränderung der Oberflächenstruktur auf·
tritt, stark gehindert werden oder in einzelnen Gefässen gan:
zum Erliegen kommen.
Wie die Resultate zeigen, scheinen jedoch F-Gehalte, di, noch keine sichtbaren Schädigungen hervorrufen, auch die Thy:
lenbildung nicht anzuregen. Bei den Kontrollpflanzen waren s, gar durchwegs mehr Thyllen gebildet worden, was möglicherwei:
mit der geringeren Luftfeuchtigkeit am Kontrollstandort zusai menhängen könnte.
Tabelle 2 Anzahl der im Herbst gebildeten Thyllen pro Blattstiel- Querschnitt unter starkem bzw. schwachem Fluorimmissions- Einfluss (Distanz vom Emittent), geerntet am 30.10.1973 n: Anzahl der untersuchten Blattstielquerschnitte
x:
Mittelwerte±s: Standardabweichung
Distanz vom Baumart n
x
Emittent
400 m Robinie 26 2.3
2'000 m Robinie 34 3.3
500 m Schwarzerle 49 1.2
2'000 m Schwarzerle 40 2.0
500 m Birke 47
o.o
2'000 m Birke 46 0.3
500 m Platane 47 2.0
2'000 m Platane 41 6.0
±s
1.78 2. 71
1.28 1. 54
-
0.76
1.59 2.65
Bei den Robinien wurden 6 bis 7 Blattstiele, bei den Erlen, Birken und Pla- tanen 10 Blattstiele pro Versuchsfläche untersucht.
20 4 PHYSIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN 4.1 Peroxydase
Die Peroxydase ist ein Enzym, dem eine entgiftende Wir- kung zugeschrieben wird, da es den Sauerstoff von Peroxyden, die in höheren Konzentrationen als Zellgifte wirken,auf Akzep- toren übertragen kann.
4.1.1 Material und Methodik
Als Versuchspflanzen wurden vertopfte Fichten ( Piaea abies) verwendet, und zwar je ein Klon eines etwa 120 Jahre alten und eines jungen, ca. 40 jährigen Mutterbaumes. Insgesamt standen 35 Pfropflinge zur Verfügung (17 vom alten und 18 vom jungen Klon), welche in 1'100 m Entfernung vom Fluoremittenten expo- niert wurden. Diese Fichten waren bereits seit drei Jahren den F-Immissionen ausgesetzt. Im April des Versuchsjahres 1973 wurden sie mit Melophen 0.2% (ca. 0.5 !/Pflanze) gegen Befall mit der Gallenlaus behandelt. Ausserdem erhielten sämtliche Pflanzen eine Grunddüngung mit 1 1 0.5% Ammonnitrat. Darauf wurden sie in 3 Gruppen aufgeteilt und ab Mai 1973 differen-
ziert gedüngt:
Gruppe I
Gruppe II
6 Fichten vom alten und 6 vom jungen Klon wurde monatlich (von Mai bis September) je 1 1 1% NH4NO3 verabreicht. In den vergan- genen zwei Jahren hatten 2/3 der Bäume N- Dünger, 1/3 Mg-Dünger erhalten.
6 Fichten vom alten und 6 vom jungen Klon wurde monatlich je 1 1 1% K2
so
4 verab- reicht. In den vorangegangenen zwei Jahren hatten 2/3 der Bäume K-Dünger, 1/3 Mg-Dün- ger erhalten.Gruppe III 5 Fichten vom alten und 6 vom jungen Klon erhielten nur demineralisiertes Wasser mit einem Zusatz von 10% Leitungswasser, Auch in den vorangegangenen zwei Jahren war ihnen kein Dünger verabreicht worden.
Aufarbeiten der Proben
Die Nadelproben wurden in einem verschliessbaren Plastik- beutel in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur Auf- arbeitung bei -18° gelagert. 0.5 g Blattmaterial wurde in 50 ml Phosphatpuffer nach Sörensen (pH 7.0) mit einem Zusatz von Triton-X-100 0.1%) mit einem Hochfrequenzstabmixer Polytron PT 20 homogenisiert und anschliessend durch einen Filter
(Schleicher und Schuell No 5892) abgenutscht.
Photometrische Bestimmung der Peroxydaseaktivität
Die Bestimmungsmethode erfolgte in Anlehnung an LÜCK (1962) und BAR-AKIVA und LAVON (1968): Dem Pflanzenextrakt wird Wasserstoffperoxyd und Pyrogallol zugefügt. Die im Ex- trakt enthaltene Peroxydase überträgt den Sauerstoff des Peroxyds auf das Pyrogallol, wobei Purpurogallin gebildet wird. Die Zunahme an Purpurogallin, welche als Extinktions- zunahme pro Zeiteinheit bei der Wellenlänge 470 nm gemessen wird, gilt als Mass für die Peroxydaseaktivität, Zur photome- trischen Bestimmung stand ein Spectrophotometer Vitatron UFD mit Magnetrührwerk zur Verfügung.Die Messungen wurden bei 18°c durchgeführt. Für die Herstellung der Bestimmungslösung wur- den 5 ml des Homogenates mit 3 ml 0.5 M Pyrogallol (Merck p.a.
612) mit bidestilliertem Wasser auf 25 ml gestellt. Von die- ser Probe wurden je 3 ml in zwei Küvetten mit eingelegtem Mag- netrührer pipettiert. Der Bestimmungslösung in der einen Kü- vette wurde 0,05 ml bidestilliertes Wasser zugefügt und diese als Nullprobe verwendet. In die andere Küvette wurde 0.05 ml einprozentiges Wasserstoffperoxyd gespritzt und sofort die Stoppuhr gedrückt. Die Ex~inktion der laufend gerührten Probe wurde bei 470 nm 3 Minuten lang verfolgt. Als Aktivitätsmass
22
wurde die Extinktionszunahme zwischen der zweiten und dritten Minute gewählt.
4.1.2 Resultate
Um den Einfluss der Jahreszeit, der Düngung und des F-Ge- haltes in der Luft darstellen zu können, müssen zuerst die un- gefähren F-Gehalte des Standortes bekannt sein, an dem die Versuche durchgeführt wurden.
Abbildung 1 zeigt im Juli 1973 einen bemerkenswerten An- stieg des F-Gehaltes in grösseren Distanzen vom Werk. Bei 1'400 m Entfernung handelt es sich um einen Standort, der im Windschatten eines dichten Bestandes liegt, und der deshalb etwas tiefere Werte aufweist. Die untersuchten Fichten standen 1'100 m vom Emittenten entfernt, so dass sich die Fluorgehalte am ehesten mit jenen in 1'250 m Distanz vergleichen lassen.
Aus Abbildung 2 geht hervor, dass die Peroxydaseaktivität Ende Juli in der Regel leicht höher liegt als Ende August, aber tiefer als Ende Oktober. Im Spätherbst kann bei K-Düngung eine schwache, bei N-Düngung eine stärkere Steigerung der Peroxydaseaktivität gegenüber ungedüngter Fichten beobachtet werden. Bedeutende Unterschiede, die sich in einer Aktivierung der Peroxydase äussern, weist nur der junge N-gedüngte Klon auf, sowohl im Juli, bei erhöhten F-Immissionen, als auch im Okt0ber, bei fortgeschrittener Alterung. Diese Resultate stim- men mit jenen von KELLER (1974) überein.
Wie Tabelle 3 zeigt, ist der Anstieg der Peroxydaseakti- vität bei den gedüngten Fichten nicht signifikant verschieden von dem der ungedüngten Kontrollpflanzen. Tendenzen lassen sich aber deutlich ablesen.
mg F/dm2 in 30 Tagen -0.3
500 m -0.2
vom Emittenten -0.1
-0
1'250 m -0.2
vom Emittenten -0.1
-0
1'400 m -0.2
vom Emittenten -0.1
-o
1'600 m -0.2
vom Emittenten -0.1
-0
2'000 m -0.2
vom Emittenten -0.1
-0 I II III IV V VI VII VIII IX
Abbildung 1: Fluorgehalte der Luft in verschiedenen Entfernungen vom Emit- tenten im Jahre 1973 (nach Angaben der Eidg. Forschungsan- stalt für Agrikulturchemie und Umwelthygiene, Liebefeld, und dem Kant. Hygieneinstitut, Genf. Modifizierte Harding-Methode).
Tabelle 3 Aenderung der Peroxydaseaktivität zwischen der zweiten und dritten Minute in den Nadeln K-gedüngter, N-gedüngter und ungedüngter Fichten (alter und junger Klon)
Erntedatum
27. 7.73
29. 8.73
30.10.73
n: -1 LIE • min t:
Behandlung
Kontrolle K-Düngung N-Düngung Kontrolle K-Düngung N-Düngung Kontrolle K-Düngung N-Düngung
n
5 6 6 5 5 4 5 5 5
Anzahl Proben pro Bedingung
Differenz zwischen E nach 3' und E nach 2' mit dem t-Test wurde geprüft, ob sich die Peroxydaseaktivität gedüngter Pflanzen von der ungedüngter Kontrollpflanzen (Kontrol- le) signifikant unterscheidet
alter Fichtenklon junger Fichtenklon LIE • min -1 t n
LIE • min -1 t
0.160 - 6 0.132
-
0.183 0.804 6 0.108 1.235
0.218 1.132 6 0.162 1.233
0.126
-
3 0.123 -0.136 0.506 6 0.117 0.360
0.150 1. 756 6 0.130 0.154
0.228
-
5 0.220-
0.284 1.607 6 0.238 0.437
0.274 1.353 6 0.345 3.607
"'
...
E470 run
E,nde Juli Ende August Ende Oktober
-1.0 -0.8
0 -0.6
-0.4 -0.2 -0 -0.8 -0.6 +K
-0.4 -0.2 -0 -0.8 -0.6 +N
-0.4 -0.2 -0 0 30 60 90 180 0 30 60 90 180 0 30 60 90 180 sec Abbildung 2: Peroxydaseaktivität in Fichtennadeln, gemessen als Extinktionswert
bei 470 run (geerntet Ende Juli, Ende August und Ende Oktober 1973).
- - - - a l t e r Klon ---junger Klon
0 Nullprobe (ungedüngt) +K K-gedüngt
+N N-gedüngt
26 4.1.3 Diskussion
Die Peroxydase gehört zu den Enzymen, deren prosthetische Gruppe ein an Protoporphyrin komplex gebundenes Eisenatom ent- hält. Wenn die Annahme von RECKENDORFER (1961) stimmt, dass freie F-Ionen mit diesem Eisen reagieren, müsste die Peroxyda- seaktivität folglich gehemmt werden. In den vorliegenden Un- tersuchungen konnte aber eine Steigerung festgestellt werden.
Offenbar stehen den F-Ionen noch andere Akzeptoren zur Verfü- gung, mit denen sie schwerlösliche Verbindungen eingehen kön- nen. Es wäre auch denkbar, dass die Blockierung eines physio- logischen Gegenspielers der Peroxydase diese indirekt aktivie- ren könnte. Zum Beispiel sinkt die Peroxydaseaktivität in jun- gen Fichtennadeln rapide mit einsetzendem Streckungswachstum und nimmt erst ab Spätsommer wieder zu (KELLER, 1974). Es lässt sich deshalb ein Zusammenhang zwischen dem Auxingehalt und der Wirksamkeit der Peroxydase vermuten. So zeigten ORDIN und SKOE (1963), dass das Längenwachstum von Avena-Koleoptil- stückchen in einer IES-haltigen gepufferten Glucose-Lösung von der Dauer abhängig war, während der die Gewebe in einer 0.01 N NaF-Lösung "vorkonditioniert" worden waren. Schon nach sechs Stunden konnte gegenüber den Kontrollen, die ebensolang in 0.01 N Na2SO4-Lösung eingelegt waren, eine ca.80prozentige Hemmung des Längenwachstums festgestellt werden.
Weitere Untersuchungen über den Einfluss des Fluors auf Wuchsstoffe und deren Zusammenhang mit der Peroxydase wären vermutlich sehr aufschlussreich.
4.2 Chlorophyll
4.2.1 Material und Methodik
Es wurden dieselben Fichten verwendet wie im vorangegan- genen Abschnitt. Die Nadelproben wurden bei der Ernte tiefge- froren und bis zur Aufbereitung bei -18° C gelagert. 0.5 g
Frischgewicht wurde zusammen mit einer Spatelspitze Na2CO3 mit einem Hochfrequenz-Stabmixer Polytron PT 20 in 50 ml 80pro- zentigem Aceton homogenisiert. Das Homogenat wurde verschlos- sen, dunkel und kühl gestellt und das Chlorophyll über Nacht extrahiert. Der klare Extrakt wurde auf 50 ml gestellt und die Extinktionswerte bei den Wellenlängen 647 nm und 664 nm be- stimmt. Dazu stand ein UV-Spectrophotometer Unicam SP 1700 zur Verfügung. Nach ZIEGLER und EGLE (1965) wurden Chlorophyll a und b einzeln photometrisch bestimmt und der absolute Gehalt berechnet.
4.2.2 Resultate
In Abbildung 3 fällt die starke Senkung des Chlorophyll- gehaltes Ende Juli auf. Die Messungen von Ende Juni zeigen, dass der Gehalt durch die Düngung um etwa 10 bis 20% erhöht worden war (wenn auch statistisch nicht gesichert). Auf die erhöhten Fluorimmissionen im Juli reagierten die gedüngten Fichten aber eher empfindlicher.
Interessant ist die unterschiedliche Regeneration des Chlorophylls: Während die Chlorophyllsynthese bei den K-ge- düngten Bäumen rasch wieder in Gang gesetzt wurde, erholten sich der alte ungedüngte sowie der junge N-gedüngte Klon nur langsam. Aus Tabelle 4 ist ersichtlich, dass beim alten Klon die Neubildung des Chlorophylls in gedüngten Pflanzen signifi- kant schneller abläuft als in ungedüngten.
Die unterschiedliche Reaktion von Chlorophyll a und b ist in Abbildung 4 und Tabelle 5 dargestellt. Beide Pigmente reagierten empfindlich auf die erhöhte Fluorimmission im Juli.
Chlorophyll b wird aber im Vergleich zu Chlorophyll a sehr viel langsamer regeneriert, was eine Verschiebung des Verhält- nisses Chlorophyll a/b zur Folge hat (Tabelle 5).
mg 6
5 4
3
2
1
0 5 4
3
2
1
0 5 4
3
2
1
0
28
Chl./g TS
ungedüngt
_o __ _
,,,., ---
.,,,, ----
K-gedüngt
---
N-gedüngt
--
Juni Juli August September Oktober 1973
Abbildung 3: Gesamtchlorophyllgehalt in den Nadeln gedüngter Fichten (al- ter und junger Klon) im Verlaufe einer Vegetationsperiode unter F-Immissionseinfluss (F-Gehalt im Juli etwa doppelt so hoch wie mittlere F-Gehalte im Juni und August).
alter Klon - - - - - junger Klon
Tabelle 4 Gesarotchlorophyllgehalt in den Nadeln gedüngter Fichten (alter und junger Klon) im Verlauf einer Vegetationsperiode unter F-Immissionseinfluss (Gehalt in mg/g Trockensubstanz) n: Anzahl Proben
x:
Mittelwerte±s: Standardabweichung
t: mit dem t-Test wurde geprüft, ob sich der Chlorophyll- gehalt gedüngter Pflanzen signifikant von jenem unge- düngter Kontrollpflanzen (0) unterscheidet
Ernte- Behandlung Gesamtchlorophyll
datum und Alter n
x
±s t28. 6.73 0 alt 4 3.436 1.146
-
0 jung 5 3.663 1.293
-
+K a 5 4.104 0.818 1.024
+K j 6 3.694 0.661
-
+Na 5 4.338 1.211 1.136
+N j 4 4.575 0.799
-
27. 7.73 0 a 4 1.451 0.203
-
0 j 4 1. 727 0.226
-
+K a 6 1. 555 0.077 1.164
+K j 5 1.081 0.203
-
+Na 6 1.653 0.118 2.013
+N j 6 1.067 0.171
-
29. 8.73 0 a 4 2.004 0.469
-
0 j 6 3.343 ,0.804
-
+K a 6 3.588 0.548 4. 721
+K j 5 3.200 0.328 -
+Na 6 3.435 0.764 3.315
+N j 4 2.355 0.516
-
30.10.73 0 a 5 2.589 0.500
-
0 j 6 2.565 0.353 -
+K a 6 2.917 0.338 1.296
+K j 6 2.926 0.195
-
+Na 6 2.648 0.324 0.237
+N j 6 3.056 0.425
-
30
mg/g TS 6
5 4
3 2
1 0
5
4 3
2
1 0
4
3 2
1 0
ungedüngt
,J'o _ _
, --
/
---
K-gedüngt
...
___ ---- --
N-gedüngt
Juni Juli August September Oktober 1973
Abbildung 4: Gehalt an Chlorophyll a und bin den Nadeln gedüngter Fichten (alter und junger Klon) im Verlaufe einer Vegetationsperiode unter F-Immissionseinfluss (F-Gehalt im Juli etwa doppelt so hoch wie mittlere F-Gehalte im Juni und August).
alter Klon - - - - junger Klon
0 Chlorophyll a 6 Chlorophyll b
Tabelle 5 Gehalt an Chlorophyll a und b (mg/g Trockensubstanz) in den Na- deln gedüngter Fichten (alter und junger Klon) im Verlauf einer Vegetationsperiode unter F-Immissionseinfluss (F-Gehalt im Juli etwa doppelt so hoch wie mittlere F-Gehalte im Juni und August)
Ernte- Behandlung datum und Alter n 28. 6.73 0 alt 4 0 jung 5 +K a 4 +K j 6
+Na 5
+N j 4 27. 7.73 0 a 4
0 j 4
+K a 6 +K j 5
+Na 6
+N j 6 29. 8.73 0 a 4
0 j 6
+K a 6 +K j 5
+Na 6
+N j 4
30.10. 73 0 a 5
0 j 6
+K a 6
+K j 6
+Na 6
+N j 6
n: Anzahl Proben pro Bedingung
x:
Mittelwerte±s: Standardabweichung
Chlorophyll a Chlorophyll b
l1 ±s n l1 ±s
2.736 0.890 4 0.699 0.255 2.884 0.956 5 o. 778 0.337 3.215 0.708 5 0.868 0.208 2.872 0.522 6 0.821 0.157 3.393 0.889 5 0.943 0. 33.6 3.568 0.589 4 1.007 0.242 1.140 0.148 4 0.310 0.056 1.372 0.165 4 0.355 0.061 1.226 0.056 6 0.328 0.026 0.863 0.151 5 0.210 0.061 1.312 0.088 6 0.341 0.028 0.855 0.123 6 0.211 0.049 1.620 0.406 4 0.383 0.082 2.965 0.701 6 0.378 0.103 3.182 0.482 6 0.406 0.073 2.851 0.290 5 0.349 0.042 3.031 0.643 6 0.404 0.123 1;948 0.584 4 0.369 0.152 2.006 0.349 5 0.583 0.158 1.969 0.269 6 0.597 0.091 2.241 0.241 6 0.676 0.107 2.198 0.144 6 o. 727 0.066 2.116 0.213 6 0.615 0.069 2.316 0.315 6 0.740 0.120
~ Chl. b 3.914 3.707 3.704 3.498 3.598 3.543 3.677 3.865 3.738 4.109 3.847 4.052 4.230 7.844 7.837 8.169 7.502 5.279 3.441 3.298 3.315 3.023 3.441 3.130
32 4.2.3 Diskussion
Die Versuche von WEINSTEIN (1961) zeigten eine Abnahme des Chlorophyllgehaltes nach HF-Begasung. McNULTY und NEWMAN
(1961) verabreichten etiolierten Bohnenpflanzen Fluor im Sub- strat und analysierten die Gehalte an Protochlorophyll, Chlo- rophyll a und b sowie Carotinoiden. Sie stellten durchwegs eine erhebliche Gehaltsverminderung bei ansteigenden Fluorkon- zentrationen fest. Auch Freilandversuche zeigten eine Abnahme des Chlorophylls bei stärkeren Fluorimmissionen (KELLER, 1973a).
Andere Immissionen wie so2, Stickoxide oder Metallstäube sol- len den Chlorophyllgehalt nach WARTERESIEWICZ (1968) ebenfalls senken, ohne das Verhältnis Chlorophyll a/b wesentlich zu be- einflussen. ARNDT (1971) untersuchte die kurzfristige Einwir- kung kleiner HF-Konzentrationen. Das Chlorophyll verhielt sich unter diesen Umständen indifferent, der Carotingehalt wurde hingegen signifikant herabgesetzt.
Sowohl die Abnahme an Chlorophyll a und b, wie auch das unveränderte Verhältnis Chlorophyll a/b bei steigendem Fluor- gehalt in der Luft konnte in der vorliegenden Untersuchung be- stätigt werden. Weder N- noch K-Düngung vermochte die schädi- gende Wirkung des Fluors aufzuhalten, doch kam eine Düngewir- kung bei der Regeneration des Chlorophylls zum Ausdruck. Aller- dings wirkte sie sich nur beim alten Klon, in bezug auf die Chlorophyll a-Synthese, positiv aus; der junge N-gedüngte Klon zeigte sogar eine Hemmung, was aber angesichts der übri- gen Resultate nicht erstaunlich ist. Chlorophyll b hingegen reagierte eigenartigerweise überhaupt nicht auf die Düngung, obwohl sich die beiden Pigmente chemisch nur geringfügig unter- scheiden.
Interessant ist die Feststellung, dass Fluor bereits die Vorstufe des Chlorophylls beeinflusst. Es darf nach RECKEN- DORFER (1961) angenommen werden, dass es sich dabei nicht um eine Zerstörung, sondern um eine Blockierung der Synthese des Protochlorophylls handelt. An dieser Synthese soll die Katala-
se mit ihrer prosthetischen Gruppe, einem Fe-haltigen Proto- porphyrinkomplex, beteiligt sein. Fluor kann mit 3wertigem Ei- sen schwerlösliche Eisenfluorkomplexe bilden (Me3[FeF6]l, und zwar noch bevor eine Reaktion mit dem Mg-Chelat des Chloro- phylls stattfindet. Dadurch könnte ein physiologischer Eisen- mangel induziert werden, der imstande wäre, die Katalasetätig- keit und damit die Bildung des Protochlorophylls zu hemmen, was natürlich zu einem Rückgang der Chlorophyllsynthese führen müsste. In der Tat ist in der Literatur mehrfach auf eire F- induzierte Hemmung der Katalaseaktivität hingewiesen worden
(HEWITT und NICHOLAS, 1963; McCUNE et al., 1965).
4.3 Zucker, Aminosäuren, Phenole (Gerbsäuren)
4.3.1 Material und Methodik
Inhaltsstoffanalysen wurden in sämtlichen im Abschnitt 3.2.1 beschriebenen Baumarten durchgeführt; doch wurden zu den Hauptversuchen nur die gedüngten Fichten herangezogen.
Von den Nadelproben wurden gemäss Abschnitt 4.2.1 Aceton- Extrakte hergestellt. 10 ml davon wurden im Rotavapor R (Bü- chi) bis zur Trockne eingedampft und der Rückstand mit 10 ml destilliertem Wasser aufgenommen. Von dieser wässerigen Lösung wurde 1 ml für die Aminosäurenanalyse verwendet. Für die Zuk- kerbestimmung musste der Extrakt achtmal verdünnt werden; da- von wurden dann 2 ml verwendet.
20 ml des Homogenates wurden für die Gerbstoffbestimmung mit 10 ml Chloroform ausgeschüttelt. Zur vollständigen Extrak- tion und Entmischung der beiden Phasen wurden die Proben über Nacht in den Kühlschrank gestellt. Am nächsten Tag wurde von der oberen, klaren wässerigen Phase 1 ml sorgfältig abpipet- tiert und viermal verdünnt. Davon wurde 1 ml zur Analyse benö- tigt.
34
4.3.1.1 Zuckerbestimmung nach der Anthronmethode
In Anlehnung an STEUBING (1965) wurden zu 2 ml wässerige Pflanzenextrakt 5 ml Anthronreagenz pipettiert. Die Proben Wc den 10 Minuten im Wasserbad von etwa 10° C gekühlt und an- schliessend genau 15 Minuten im Wasserbad von 100° C gekocht.
Nach dem Abkühlen wurde die Extinktion bei der Wellenlänge 540 nm im UV-Spectrophotometer Unicam SP 1700 gemessen. Als Eichsubstanz wurde Glukose verwendet.
Herstellung des Anthron-Reagenz
0.2 g Anthron wurden in 100 ml H2S04 (95 - 97% p.a. Mer, 731) gelöst. Das Reagenz wurde täglich frisch hergestellt.
4.3.1.2 Bestimmung der freien Aminosäuren
In Anlehnung an BLACKBURN (1968; S.77) wurden zu 1 ml w serigem Pflanzenextrakt 1 ml Ninhydrinreagenz pipettiert. Na kurzem Schütteln wurden die Proben genau 15 Minuten lang ins kochende Wasserbad gestellt und danach 5 ml 50% Aethylalkohc (für die Spektroskopie, Merck 969) dazupipettiert. Nach dem kühlen wurde die Extinktion bei der Wellenlänge 570 nm mit
c
UV-Spectrophotometer Unicam SP 1700 gemessen. Als Vergleich~
stanz wurde L-Leucin (für biochemische Zwecke, Merck 5360) , wendet.
Herstellung des Ninhydrinreagenz verwendete Reagenzien:
a) Methylcellosolve (Aethylenglycolmonomethyläther p.a. Mer 859)
Die Methylcellosolve muss frei sein von Peroxyden oder n tigenfalls von solchen gereinigt werden.
b) 50prozentiger Aethylalkohol
Etwa 95% Aethanol (für Spektroskopie, Merck 969) wurde m dem gleichen Volumen aq. dest. gemischt.
c) 4 N Natriumacetat-Puffer, pH 5.51
272 g CH3COONa · 3 H2O wurden in 200 ml aq. dest. im heissen Wasserbad gerührt, bis das Salz vollständig gelöst war.
Nach dem Abkühlen wurden 50 ml Eisessig zugefügt und mit aq. dest. auf 500 ml aufgefüllt. Der Puffer wurde bei 4° C aufbewahrt.
d) Ninhydrin (p.a. Merck 6762)
e) Hydrindantin (zur Aminosäurenbestimmung, Merck 4510) 2 g Ninhydrin und 0.3 g Hydrindantin wurden in einem hohen, schmalen Gefäss in 75 ml Methylcellosolve gelöst. Dabei wurde darauf geachtet, dass keine Luft eingerührt wurde.
Dann wurden 25 ml Acetatpuffer zugegeben. Das Reagenz muss unter Stickstoff aufbewahrt und alle 2 bis 3 Tage frisch hergestellt werden.
4.3.1.3 Bestimmung des Totalphenolgehaltes
Zu 1 ml des wässerigen Pflanzenextraktes wurden 5 ml 2%
Na2CO3 in 0.1 N NaOH pipettiert. Die Proben wurden 15 Minu- ten stehengelassen, sodann mit 1 ml Folin-Ciocalteus-Reagenz versetzt und sofort geschüttelt. Nach mindestens 30 Minuten wurde die Extinktion bei der Wellenlänge 500 nm abgelesen. Als Standard diente Chlorogensäure (zur Synthese, Merck-Schuchardt, 820319).
Verwendete Reagenzien:
a) 2prozentiger Sodapuff~r
2 g Na2CO3 wurden in 100 g 0.1 N NaOH gelöst.
b) Folin-Ciocalteus-Reagenz
25 ml Folin (Folin-Ciocalteus Phenolreagenz, Merck 9001) wurden mit aq. dest, auf 100 ml aufgefüllt.
36 4.3.1.4 Chromatograrnme
Zur Erfassung qualitativer oder erheblicher quantitativer Unterschiede in den einzelnen Komponenten der untersuchten In- haltsstoffe, unter dem Einfluss der Düngung, wurden Dünn- schichtchromatogramme der konzentrierten Extrakte hergestellt.
Es zeigten sich bei Zucker und Gerbsäuren keine eindeutigen Verschiebungen. Hingegen traten Konzentrationsänderungen bei einzelnen Aminosäuren auf, weshalb die angewandte Methode zur chromatographischen Bestimmung freier Aminosäuren hier ange- führt sei.
Am besten eignete sich das Laufmittel 96% Aethanol (etwa 95% für die Spektroskopie, Merck 969)/dest. Wasser (7: 3) für die Dünnschichtchromatographie auf Kieselgelschichten (DC-Alu- folie, Kieselgel 60F 254, Schichtdicke 0.25 nm, Merck 5554).
Ausserdem wurde jeweils parallel dazu ein Papierchromatogramm hergestellt, um Flecken, die sich mit Alkohol/Wasser nicht trennen, mit Phenol (p.a. Merck 206)/dest.Wasser (75 g: 25 g) und einer Spur NaCN (etwa 20 mg/100 g) auseinanderzuziehen.
Auf der luftgetrockneten Kieselgelschicht bzw. auf dem Chroma- tographiepapier (Sorte 2043a, Nr. 14.2143.58) wurden im Ab- stand von 2 cm je 2 µl der Substanz aufgetragen, nach einer Laufstrecke von etwa 20 cm bei 110° C getrocknet und die Re- sultate ausgewertet.
4.3.2 Resultate
An verschiedenen Standorten wurden Ende September Birken, Platanen und Lärchen auf Inhaltsstoffe untersucht (Abbildung 5;
Die absoluten Gehalte schwankten sehr stark und gaben kein ein deutiges Bild vom Einfluss des Fluors auf den Gehalt an Zuckex Gerbsäuren und Aminosäuren. Die Resultate wurden deshalb über- sichtlicher als relative Gehalte dargestellt.
Zwischen 2'000 und 1'250 m Entfernung vom Werk stiegen die Inhaltsstoff-Gehalte mehr oder weniger stark an, fallen
relativer Gehalt in Prozent der Kontrollen
4 0 0 ~ - - - -
300 rel. Gerbstoffgehalt
200
100
---o ...
... .,,,,,,,.,,,,.
'·o..,..
0--+---~~---~---~---~---+-
300
200
100
300
200
100
0
rel. Zuckergehalt
.... •···
... ·· ···•
o---- ... ··· .. ~---o
•... ·· ..
.. ·· ~---- ... ··.
·•.
rel. Aminosäurengehalt
.,o,
.... ••;,'r: .. • . ' ,
. ... ,... ,,,, ··. ··. .. .... .... ....
·· .. 'o
··.. ',
·•
... :--
0 400 500 1°000 1°250 1°600 2'000 m vom Emittenten Abbildung 5: Gehalt an Inhaltsstoffen bei Lärche, Platane und Birke in
verschiedener Entfernung vom Emittenten (geerntet Ende September 1973).
~ - - - Birke 0 - - - - - Platane
• •·· •· • • • •· • • Lärche
