und aus der
Klinik für Allgemein-, Visceral- und Transplantationschirurgie der Medizinischen Hochschule Hannover
Identifizierung der Abstoßungsparameter porciner Langerhans-Inseln im
hu-MNC-SCID-NOD-Mausmodell
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Werner Stührenberg
aus Damme
Hannover 2005
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Michael Fehr 2. Gutachter: Univ.-Prof.Dr. Gerhard Breves
Tag der mündlichen Prüfung: 14.11.2005
Für meine Familie
„Der Griffon hatte das Vorderteil eines Adlers, aber Hinterbeine und Schwanz eines Löwen. Sein adlerähnlicher Kopf besaß spitze, aufwärtszeigende Ohren wie die eines Esels. Auf Kopf, Nacken und Brust wuchsen Federn, und der Rest seines Körpers war mit Löwenfell bedeckt.“
HOMER
1 EINLEITUNG ... 1
2 SCHRIFTTUM... 3
2.1 Diabetes Mellitus ... 3
2.2 Therapieansätze... 5
2.2.1 Intensivierte Insulintherapie ... 5
2.2.2 Kontinuierliche, subkutane Insulin-Infusion ... 5
2.2.3 Somatische Gentherapie ... 7
2.2.4 Pankreastransplantation... 9
2.2.5 Inseltransplantation ... 11
2.3 Allogene Inseltransplantation ... 11
2.3.1 Chronik der allogenen Inseltransplantation... 11
2.3.2 Technik der allogenen Inseltransplantation... 15
2.3.3 Stand der allogenen Inseltransplantation... 16
2.3.4 Vorteile der allogenen Inseltransplantation... 18
2.3.5 Zukunft der allogenen Inseltransplantation ... 19
2.3.5.1 Immunisolation Langerhans’scher Inseln... 19
2.3.5.2 Gewinnung Langerhans’scher Inseln durch Stammzelltechnologie ... 20
2.3.5.3 Verwendung xenogener Inseltransplantate... 21
2.4 Xenogene, porcine Inseltransplantation ... 21
2.4.1 Chronik der xenogenen, porcinen Inseltransplantation... 21
2.4.2 Vorteile der xenogenen Inseltransplantation ... 23
2.4.3 Problematik der xenogenen Inseltransplantation ... 24
2.5 Immunologische Grundlagen der Xenotransplantatabstoßung ... 24
2.5.1 Hyperakute Xenotransplantatabstoßung... 25
2.5.2 Akute Xenotransplantatabstoßung ... 28
2.5.2.1 Akute, vaskuläre Abstoßung... 28
2.5.2.2 Spezifische NK-Zell-Antwort ... 31
2.5.2.3 Spezifische T-Zell- und T-Zell-abhängige Immunantworten... 33
2.5.3 Chronische Xenotransplantatabstoßung. ... 42
2.6 Xenogene Inseltransplantatabstoßung ... 43
2.7 In-vivo-Modelle zur Abstoßung xenotransplantierter, porciner Inseln ... 46
2.8 Die inseltransplantierte hu-MNC-SCID-NOD-Maus... 48
2.8.1 Der SCID-Defekt ... 48
2.8.2 Der NOD-Defekt... 49
2.8.3 Die SCID-NOD-Defekt Kombination... 49
2.8.4 Der STZ-Diabetes ... 50
2.8.5 Die Inselisolation ... 51
2.8.6 Die Inseltransplantation... 54
2.8.7 Die MNC-Rekonstitution ... 54
2.9 Der Diabetes mellitus und die Inseltransplantation in der Veterinärmedizin ... 55
3 MATERIAL UND METHODEN ... 58
3.1 Idee und theoretische Grundlagen... 58
3.2 Fragestellung ... 59
3.3 Aufbau der Vorversuche ... 60
3.3.1 Induktion des STZ-Diabetes ... 60
3.3.2 Xenogene, porcine Inseltransplantation ... 61
3.3.3 Wiedererkrankung an STZ-Diabetes nach Transplantatentfernung ... 61
3.3.4 Etablierung eines optimierten MNC-Rekonstitutionsprotokolls für die SCID-NOD-Maus. ... 62
3.3.5 Vergleich der MNC-Zusammensetzung im Menschen und in der hu-MNC- SCID-NOD-Maus ... 63
3.4 Aufbau des Hauptversuchs ... 63
3.4.1 Abstoßung xenotransplantierter, porciner Langerhans’scher Inseln durch humane MNCs im hu-MNC-SCID-NOD-Mausmodell ... 63
3.5 Versuchstiere (Stamm, Haltung, Fütterung)... 64
3.6 Xenogene, porcine Inseltransplantation ... 65
3.6.1 Organentnahme ... 65
3.6.2 Inselisolation... 66
3.6.2.1 Aufbau ... 66
3.6.2.2 Pankreas Preparation ... 66
3.6.2.3 Liberase Instillation... 67
3.6.2.4 Inselliberation (Pankreasverdau)... 68
3.6.2.5 Waschen und Inkubation ... 69
3.6.2.6 Inselseparation im Optiprep Gradient ... 69
3.6.2.7 Waschen der Inselsuspension ... 70
3.6.2.8 Kultivierung der Inseln... 70
3.6.3 Induzieren des STZ-Diabetes... 70
3.6.4 Inseltransplantation ... 71
3.6.4.1 Vorbereitung und Untersuchung des Inseltransplantates ... 71
3.6.4.2 Vorbereitung und Untersuchung des Empfängers ... 71
3.6.4.3 Transplantation... 72
3.7 Rekonstitution mit humanen MNCs... 75
3.7.1 Isolation humaner MNCs ... 75
3.7.2 Rekonstitution (erste MNC-Injektion) ... 77
3.7.3 Kultivierung und Aktivierung humaner MNCs ... 77
3.7.4 Entnahme der MNCs aus der humanen MNC-Kultur... 77
3.7.5 Boosterrekonstitution (zweite MNC-Injektion)... 78
3.8 Auswertung... 78
3.8.1 Überprüfen der Inseltransplantatfunktion... 78
3.8.1.1 Blutzuckermessung ... 78
3.8.1.2 Glukosetoleranztest ... 79
3.8.1.3 ELISA für porcines Insulin... 79
3.8.1.4 Inseltransplantatentfernung durch Nephrektomie ... 80
3.8.2 Überprüfen des Rekonstitutionserfolges ... 81
3.8.2.1 Blutprobengewinnung ... 81
3.8.2.2 FACS-Analyse ... 83
3.8.2.3 Untersuchung der Milz ... 85
3.8.2.4 ELISA für humanes IgG... 85
3.8.2.5 Eintreten der GvHD-Reaktion ... 85
3.8.3 Immunhistologische Untersuchungen ... 86
3.8.3.1 Organentnahme ... 86
3.8.3.2 Histologische Schnitte ... 87
3.8.3.3 Insulinfärbung ... 87
3.8.3.4 Färbung humaner MNC-Infiltrationen im porcinen Inseltransplantat ... 88
3.8.4 Statistik ... 88
4 ERGEBNISSE ... 90
4.1 Vorversuche... 90
4.1.1 Induktion des STZ-Diabetes ... 90
4.1.1.1 Blutzucker... 90
4.1.1.2 Körpergewicht... 91
4.1.2 Xenogene, porcine Inseltransplantation ... 91
4.1.2.1 Blutzucker... 91
4.1.2.2 Körpergewicht... 93
4.1.3 Wiederauftreten des STZ-Diabetes nach Transplantatentfernung... 93
4.1.3.1 Blutzucker... 93
4.1.3.2 Körpergewicht... 94
4.1.4 Insulin ELISA nach Inseltransplantation und Transplantatentfernung... 95
4.1.5 Etablierung eines optimierten Rekonstitutionsprotokolls für humane MNCs ... 95
4.1.5.1 Etablierung humaner MNCs in der SCID-NOD-Maus. ... 95
4.1.5.2 Vergleich der Rekonstitutionsprotokolle bezüglich der Menge etablierter, humaner T-Zellen ... 99
4.1.5.3 Vergleich der Rekonstitutionsrate... 101
4.1.5.4 Hu-MNC-Populationen in der murinen Milz nach Rekonstitution mit RP-III ... 101
4.1.5.5 Hu-IgG im peripheren, murinen Blut nach Rekonstitution mit RP-III ... 102
4.1.5.6 GvHD nach Rekonstitution mit RP-III... 103
4.1.5.7 Vergleich der MNC-Zusammensetzung im Menschen und in der hu- MNC-SCID-NOD-Maus nach Rekonstitution mit RP-III... 104
4.2 Hauptversuch ... 106
4.2.1 Abstoßungsparameter xenotransplantierter, porciner Langerhans’scher Inseln im hu-MNC-SCID-NOD-Mausmodell ... 106
4.2.1.1 Glukosetoleranz... 106
4.2.1.2 Insulinsekretion ... 109
4.2.1.3 Blutzucker... 110
4.2.1.4 MNC-Infiltrationen im porcinen Inselzelltransplantat ... 112
4.2.2 Inselabstoßung und Graft versus Host Desease... 114
5 DISKUSSION ... 116
5.1 Vorversuche... 116
5.1.1 Induktion des STZ-Diabetes ... 116
5.1.2 Xenogene, porcine Inseltransplantation ... 117
5.1.3 Wiederauftreten des STZ-Diabetes nach Transplantatentfernung... 119
5.1.4 Etablierung eines optimierten Rekonstitutionsprotokolls ... 120
5.1.4.1 Etablierung humaner MNCs in der SCID-NOD-Maus ... 120
5.1.4.2 Das RP--III etabliert die höchsten Anteile humaner T-Zellen im murinen Blut. ... 122
5.1.4.3 Das RP-III weist schon früh die höchste Rekonstitutionsrate auf... 124
5.1.4.4 Das RP-III etabliert humane MNCs in der murinen Milz ... 125
5.1.4.5 Das RP-III erzeugt stabile Spiegel humanen IgGs... 126
5.1.4.6 Das RP-III etabliert funktionstüchtige, humane MNCs ... 128
5.1.4.7 Die Zusammensetzung der MNCs in der hu-MNC-SCID-NOD-Maus unterscheidet sich von der des Menschen... 130
5.2 Hauptversuch ... 132
5.2.1 Abstoßungsparameter xenotransplantierter, porciner Langerhans’scher Inseln im hu-MNC-SCID-NOD-Mausmodell ... 132
5.2.1.1 Pathologische Glukosetoleranz als Parameter der beginnenden Inselabstoßung ... 132
5.2.1.2 Verminderte Insulinsekretion als Parameter der beginnenden Inselabstoßung ... 134
5.2.1.3 Erhöhte Blutzuckerwerte als Parameter der beginnenden Inselabstoßung ... 136
5.2.1.4 Hochgradige humane MNC-Infiltrationen im porcinen Inseltransplantat als Parameter beginnender Inselabstoßung ... 138
5.2.2 Inselabstoßung und einsetzende Graft versus Host Desease liegen zeitlich deutlich getrennt... 141
5.3 Fazit und Ausblick... 142
6 ZUSAMMENFASSUNG ... 148
7 SUMMARY ... 151
8 LITERATURVERZEICHNIS... 153
9 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS... 191
10 MEDIENANHANG... 195
10.1 Pankreastransportmedium ... 195
10.2 Dithizon-Lösung (DTZ)... 195
10.3 Abstopplösung ... 195
10.4 Einfach konzentrierte University of Wisconson-Lösung (UW1x) ... 196
10.5 Working Solution (WS)... 196
10.6 Low Density Solution (LDS) ... 197
10.7 Inselkulturmedium... 197
10.8 Kulturmedium für humane MNCs ... 197
10.9 Dichtekontrolle und Dichtefeineinstellung ... 198
10.10 Sterilfiltration ... 198
11 VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN ... 199
12 VERZEICHNIS DER DIAGRAMME ... 202
13 VERZEICHNIS DER TABELLEN... 204
14 VERZEICHNIS DER FORMELN ... 206
DANKSAGUNG ... 207
1 EINLEITUNG
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit einer heute weit verbreiteten Stoffwechselerkrankung, dem Diabetes mellitus Typ-I (DM-Typ-I). Betroffene leiden an einem absoluten Insulinmangel, der akut zu lebensbedrohlichen Stoffwechselentgleisungen und chronisch zu nicht weniger bedrohlichen Folgeerkrankungen führt. Die Therapie des DM- Typ-I erfordert enorme Ausgaben. Aus diesen Gründen wurden in der letzten Zeit erhebliche Anstrengungen unternommen, die eigentliche Ursache dieser Erkrankung zu beseitigen, anstatt -wie bei der konservativen Therapie bisher üblich- symptomatisch mit wiederholten Insulininjektionen zu therapieren. Die Anstrengungen konzentrieren sich darauf, neue insulinproduzierende Quellen in den erkrankten Organismus einzubringen. Hierbei werden verschiedene Ansätze verfolgt. Zu ihnen gehört z.B. die Implantation von Insulinpumpen, die Umwandlung körpereigener Zellen in insulinproduzierendes Gewebe (Gentherapie), die Pankreastransplantation und die Transplantation von Langerhans’schen Inseln (allogen/xenogen). Besonders die allogene Transplantation Langerhans’scher Inseln wurde in den letzten Jahren im Rahmen groß angelegter klinischer Studien mit guten Erfolgen untersucht. Ungeachtet dieser Erfolge wird der permanente Mangel an Spenderorganen auf lange Sicht den Einsatz der allogenen Inseltransplantation einschränken, sodass neuerdings die xenogene Transplantation Langerhans’scher Inseln in den Mittelpunkt des Interesses gerückt ist. Aufgrund seiner Homologie zum Menschen stellt das Schwein den idealen Spender für Langerhans’sche Inseln dar. Es könnte helfen, den Mangel an Spenderorganen zu überwinden. Leider unterliegen xenogen transplantierte Organe dramatischen Abstoßungsprozessen, die heute noch nicht vollständig beherrschbar sind. Um diese detaillierter untersuchen zu können, konzentrieren sich die Bemühungen auf die Entwicklung brauchbarer in-vivo-Modelle dieser Prozesse. Ein neu entwickelter, immundefekter Mausstamm scheint für die Entwicklung dieses in-vivo-Modells die idealen Vorraussetzungen zu bieten. Es handelt sich dabei um den SCID-NOD-Mausstamm. In diese Tiere können gleichzeitig porcine Langerhans’sche Inseln und humane Immunzellen transplantiert werden.
Das defekte Immunsystem der Maus kann keines der beiden Transplantate abstoßen. Durch
die kombinierte Transplantation von porcinen Inseln und humanen Immunzellen kann die Abstoßung eines xenogenen Transplantates durch den Menschen annähernd simuliert werden.
Die hier vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung eines Tiermodells, in dem in- vivo die Abstoßung eines xenogenen, porcinen Inseltransplantates durch humane Immunzellen untersucht werden kann.
2 SCHRIFTTUM
2.1 Diabetes Mellitus
Der Diabetes mellitus ist heute eine der häufigsten chronischen Stoffwechselerkrankungen, die den ganzen Körper betreffen. Weltweit sind schätzungsweise 130 Millionen Menschen betroffen, davon alleine 5 Millionen in Deutschland (ULRICHS et al. 1999; STOCK u.
BLUESTONE 2004). Der Diabetes mellitus (DM) ist gekennzeichnet durch eine nicht ausreichende Insulinwirkung und wird in den DM-Typ-I und DM-Typ-II eingeteilt.
Achtzig Prozent aller DM-Erkrankten sind Typ-II-Diabetiker mittleren und höheren Alters (adulter Diabetes). Die Häufigkeit der Typ-II-Diabetiker ist abhängig vom Lebensstandard und von der Überernährung der Bevölkerung (DAVIDSON 1986; BRONNER 1996;
DAVIDSON 1997). Beim DM-Typ-II handelt es sich um einen relativen Insulinmangel. Zwar wird Insulin von den Langerhans’schen Inseln dieser Patienten gebildet, jedoch führt eine Insulinresistenz an den Zielzellen zu einem pathologischen Glukosestoffwechsel. Diese Arbeit konzentriert sich auf den DM-Typ-I, sodass nur dieser Typ im Weiteren beschrieben wird.
Zwanzig Prozent der DM-Erkrankten sind Typ-I-Diabetiker. In Deutschland sind hiervon alleine 200.000 Menschen mit einer jährlichen Zahl von 6000 Neuerkrankungen betroffen (ULRICHS et al. 1999). Der DM-Typ-I tritt bevorzugt bis zum 20. Lebensjahr auf (juveniler DM). Beim DM-Typ-I kommt es zu einer Zerstörung der insulinproduzierenden Langerhans’schen Insel, in dessen Folge es zu einem absoluten Insulinmangel kommt (BENNET 1985; DURINOVIC-BELLO 1998; IWAHASHI et al. 1998; YOON u. JUN 1999). Es handelt sich hierbei um ein multifaktorielles Geschehen, für das verschiedene Ursachen diskutiert werden.
1.) Genetische Prädisposition:
Der DM-Typ-I ist an mehrere MHC-Gene und an mindestens ein Nicht-MHC-Gen assoziiert (NERUP et al. 1984; DURINOVIC-BELLO 1998; IWAHASHI et al. 1998).
2.) Umweltfaktoren:
Gewisse infektiöse Agenzien verursachen eine Beschädigung der ß-Zellen (TONIOLO et al. 1980; EISENBARTH 1986; ATKINSON u. EISENBARTH 2001).
3.) Viruserkrankungen:
Es wurden Zusammenhänge mit Parotis epidemica- (PRINCE et al. 1978), Rubella- und Coxsackie-B-Virus-Infektionen (NOTKINS 1979; ONODERA et al. 1981 diskutiert, die eine Autoimmunreaktion hervorrufen können (TONIOLO et al. 1980).
4.) Autoimmunologische Prozesse:
Der DM-Typ-I kann durch T-Zell vermittelte, autoimmunologische Prozesse hervorgerufen werden (DURINOVIC-BELLO 1998; IWAHASHI et al. 1998).
Das klinische Bild des DM-Typ-I ist geprägt durch eine Fehlregulation des Glukosestoffwechsels, die zu hyper- oder hypoglykämischen Blutzuckerwerten führen kann.
Zwei Drittel aller unbehandelten Patienten verstarben in der Vergangenheit, bedingt durch diese veränderten Blutzuckerwerte, im diabetischen oder ketoazidotischen Koma. Nach der Entdeckung des Insulins 1922 durch Banting und Best und nach Einführung der Insulintherapie veränderte sich das klinische Bild des DM-Typ-I erheblich. Todesfälle konnten weitestgehend vermieden werden. Nun liegt, bedingt durch die höhere Lebenserwartung der Diabetiker, der Schwerpunkt der Symptomatik auf den Folgeerkrankungen. Nicht optimal angepasste Blutzuckerwerte führen zur Schädigung der großen und kleinen Blutgefäße. Die diabetische Gefäßschädigung (Gefäßsklerosen) kann in Makro- und Mikroangiopathien unterteilt werden. Folgen der Makroangiopathien können periphere, arterielle Durchblutungsstörungen, koronare Herzkrankheiten, der zerebrale Insult sowie eine Hypertonie sein (STOUT 1981). Die typische Mikroangiopathie tritt als Retinopathie, Glomerulosklerose, Neuropathie oder auch als diabetisches Gangrän in Erscheinung. Über 50 % aller Todesfälle im Zusammenhang mit Diabetes mellitus Typ-I sind heute auf diabetische Herz- und Gefäßschädigungen und weitere 10 % auf diabetisches Nierenversagen zurückzuführen (CHANTREL et al. 2000).
2.2 Therapieansätze
2.2.1 Intensivierte Insulintherapie
Im Diabetes Controll and Complication Trial (DCCT) wurde 1993 der Standard für das moderne, bis heute geltende Typ-I-Diabetes Management etabliert. In einer Studie mit 1441 Diabetikern wurden diese randomisiert der konservativen oder der intensivierten Insulintherapie zugeteilt (ROBERTSON 2004). Die wesentlichen Erneuerungen der intensivierten Insulintherapie bestanden dabei in mehrmals täglich vom Patienten selbst durchzuführenden Blutzuckerbestimmungen, gefolgt von selbständigen Insulininjektionen.
Hierbei wurden erstmalig Kombinationspräparate von lang-, mittel- und kurzfristig wirkendem Insulin verabreicht (THE DCCT-RESEARCH GROUP 1993). Zusätzlich hält der Patient eine auf ihn abgestimmte Diät ein (THE DCCT-RESEARCH GROUP 1993). Die Ergebnisse zeigten, im Vergleich zur konservativen Therapie, eine deutlich bessere Blutzuckereinstellung des Patienten. Mit der verbesserten Blutzuckerkontrolle ging auch eine Verbesserung der HbA1c-Werte (glykolisierte Peptidkette 1 des adulten Hämoglobins) und eine Abnahme der oben besprochenen gefürchteten, diabetischen Folgeerkrankungen einher (THE DCCT-RESEARCH GROUP 1993). Trotz dieser wesentlichen Verbesserungen kann die physiologische, zirkadiane Insulinrhythmik nur unzureichend simuliert werden. Dies ist besonders während der nächtlichen Schlafphase ein Problem, da sie eine Verabreichung von Langzeitinsulin erfordert. In der ersten Nachthälfte besteht jedoch nur verminderter Insulinbedarf. Die Folge ist eine Hypoglykämie am Anfang der Nacht, gefolgt von einer Hyperglykämie am Ende der Nacht (Dawn-Phänomen, SCHMIDT et al. 1981; PFUTZNER et al. 2000). Ein weiterers Problem ist die überdurchschnittliche Motivation, die für das Blutzuckermanagement und das Einhalten der Diät erforderlich ist (PFUTZNER et al. 2000).
Blutzuckermanagement und Diät werden oft als Verschlechterung der Lebensqualität empfunden.
2.2.2 Kontinuierliche, subkutane Insulin-Infusion
Die Verwendung von Insulinpumpen stellt eine Sonderform der intensivierten Insulintherapie dar (PFUTZNER et al. 2000). Auch hier soll eine möglichst physiologische Blutzuckereinstellung erreicht werden (THE DCCT-RESEARCH GROUP 1993; BURGI et
al. 1995). Neben externen Pumpen existieren bereits die ersten implantierbaren Pumpen.
Externe Insulinpumpen (Abbildung 1) kamen erstmalig 1976 zwecks wissenschaftlicher Studien zum Einsatz (PICKUP et al. 1977, 1978; TAMBORLANE et al. 1979) und wurden schließlich in den frühen 80ern als alternative Therapieform angewendet (MECKLENBURG et al. 1982). Heute tragen in Europa ca. 32.000 bis 35.000 Typ-I-Diabetiker externe Pumpen, davon alleine 22.000 in Deutschland (BOLAND et al. 1999; PFUTZNER et al. 2000; BODE et al. 2002a). Moderne externe Pumpen besitzen ein Insulinreservoir, von dem aus kurzwirkendes Insulin (Insulin-Lispro) über einen Dauerkatheter mit weicher Teflonnadel subkutan ins abdominale Fettgewebe infundiert wird (LENHARD u. REEVES 2001; SELAM 2001). Die Applikation erfolgt dabei computergestützt, entsprechend zuvor eingestellter Basalraten. Die Pumpe dient also nur der Nachahmung der zirkadianen, basalen Insulinsekretion (LENHARD u. REEVES 2001). Über verschiedene Bolusfunktionen oder Quick-Release-Tasten kann der Patient die für die Mahlzeiten nötige Insulinmenge selbst
Abbildung 1: Externe Insulinpumpen , A+B : frühere Modelle, C: heutiges Modell (modifiziert nach BODE et al. 2002a)
A
C B
infundieren (Open Loop System, BODE et al. 2002a). Externe Pumpen sind wasserdicht, können aber auch zum Duschen oder Schwimmen durch abkoppelbare Katheter abgelegt werden.
Implantierbare Insulinpumpen erfordern einen chirurgischen Eingriff unter Vollnarkose oder Lokalanästhesie (UDELSMAN et al. 1997). Die Pumpe wird im linken unteren Quadranten des Abdomens, maximal 4 cm unter der Haut nach Lipektomie, in einer Gewebetasche platziert und an der Bauchfascie mit Zügeln befestigt, um Migration oder Torsion zu verhindern (THOMPSON u. DUCKWORTH 2001). Das Insulin wird über einen beschichteten (Silastic) Polyethylen-Katheter direkt in die Abdominalhöhle geleitet und über die Pfortader zur Leber transportiert. Die Programmierung der Pumpe erfolgt transkutan über ein kleines Sendegerät. Das dreimonatige Auffüllen des Insulinreservoirs erfolgt durch transkutane Injektion (SELAM 2001; THOMPSON u. DUCKWORTH 2001).
Vorteile der Insulinpumpen gegenüber der intensivierten Insulintherapie sind: ein geringeres Risiko einer nächtlichen- oder einer aktivitätsinduzierten Hypoglykämie, eine bessere Kontrolle des Dawn-Phänomens, eine stabilere Blutzuckereinstellung, verbesserte HbA1C- Werte und eine verbesserte Lebensqualität (BODE et al. 2002a). Nachteile sind:
Katheterverstopfung (Insulinagglomeration, mechanische Verlegung), Hautreizungen oder Infektionen an der Infusionsstelle sowie ein geringfügig erhöhtes Ketoacidoserisiko (PFUTZNER et al. 2000; PICKUP u. KEEN 2002). Die momentan verfügbaren Insulinpumpen befreien nicht vom postprandialen Glukosemonitoring oder vom Einhalten einer Diät. Sie haben demnach eher den Stellenwert eines Managementwerkzeuges als den einer Therapie (LENHARD u. REEVES 2001; BODE et al. 2002b).
2.2.3 Somatische Gentherapie
Man unterteilt dieses Gebiet in die Ex-vivo- und die In–vivo-Gentherapie (CHAN et al.
2003). Vektoren (hauptsächlich Viren), in deren Genom humane Transgene (z.B. humanes, insulincodierendes Gen) integriert wurden, infizieren Gewebe des Patienten. Die Vektoren integrieren ihr Genom, und damit das Transgen, in das Genom des Patienten. Die so infizierten Zellen produzieren nun die durch das Transgen codierten Proteine (z.B. Insulin, GIANNOUKAKIS et al. 1999; YOON u. JUN 2002; BOTTINO et al. 2003).
Bei der Ex–vivo-Gentherapie erfolgt der Einbau des Transgens in-vitro. Gewebe des Patienten wird entfernt (zB. Lebergewebe), in-vitro durch Vektoren genetisch modifiziert, und dann dem Patienten reimplantiert (CHAN et al. 2003). Die Ex–vivo-Gentherapie wird ausführlich in der Literatur erläutert (NEWGARD 1994; LEVINE 1997; BAILEY et al. 1999;
LEVINE et al. 1999; NEWGARD 2002).
Bei der In–vivo-Gentherapie erfolgt der Einbau des Transgens im Patienten. Das Transgen wird dem Patienten direkt verabreicht. Das Hauptproblem dieses Gebietes ist die Entwicklung effizienter und ungefährlicher Vektoren (Tabelle 1). Auf dem in-vivo-Gebiet verfolgt man zur Zeit drei Strategien:
1.) Gentransfer von blutzuckersenkenden Nicht-Insulin-Genen 2.) Gentransfer von glukosesensitiven Insulin-Genen
3.) Gentransfer von ß-Zell-Neogenese verursachenden Genen (CHAN et al. 2003)
Zur ersten Strategiegruppe gehört das für GcK (Glukokinase) codierende und das für PTG (Protein Targeting to Glukagon) codierende Gen. Ihr durch Adenoviren vermittelter Transfer in Leber und Muskulatur senkt im Erfolgsfall die hepatische Glukoneogenese und fördert die hepatische und muskuläre Glygogensynthese (FERRE et al. 1996; O'DOHERTY et al. 1999;
Tabelle 1: Charakteristika einiger Gen-Vektoren (modifiziert nach GIANNOUKAKIS et al. 1999)
Vektor Pro Kontra
Plasmid DNA leicht herzustellen, aufzureinigen und zu vermehren
schlechte Persistenz, keine spezifischen Zielzellen Adenoviren leicht hohe Titer zu erreichen,
transduziert fast alle Zelltypen
keine stabile Transduktion, immunogen in-vivo Adeno-assoziierte
Viren
stabile Transduktion, transduziert viele Zelltypen, geringe Immunogenität
Expression der Transgene dauert Tage
MoLV- basierte Retroviren
stabile Transduktion, Zielzelländerung möglich, leicht hohe Titer zu erreichen, Vektor für schnell teilende Zellen, Vektor für nicht teilende Zellen
Methylierung und Cytokine beinflussen Transgen- expression, anfällig für
chromosomale Positionseffekte Lentiviren stabile Transduktion, keine
Immunogenität, leicht hohe Titer zu erreichen
Sicherheitsbedenken bei auf HIV-1 basierenden Vektoren Herpes simplex Typ-I-
Viren
gute Transduktion, transduziert viele Zelltypen, Zielzelländerung möglich
inherente Toxizität kationische Liposomen transduziert fast alle Zelltypen,
Zielzelländerung möglich, keine Immunogenität, leicht zu manipulieren
schlechte Kontrollierbarkeit der Diffusionskinetik
Peptid Fusions Domänen
transduziert viele Zelltypen, keine Immunogenität, nicht Gegenstand der Genregulation, High-Level-
Peptidproduktion möglich
kurze Halbwertzeit,
proteolytische Degeneration, Produktion in großer Zahl ist zeitaufwendig.
NEWGARD et al. 2000; O'DOHERTY et al. 2000; OTAEGUI et al. 2000). Auf diese Weise wird der Blutzuckerspiegel gesenkt. Der Gentransfer dieser beiden Gene könnte als Hilfs- Therapie (Adjuvant-Therapie) eingesetzt werden.
In der zweiten Strategiegruppe wird das für Insulin codierende Gen viral in Leberzellen eingeführt (DONG u. WOO 2001; YOON u. JUN 2002). So transfizierte Leberzellen produzieren Proinsulin, das durch Furin in Insulin umgewandelt wird (MUZZIN et al. 1997;
SHORT et al. 1998). Die Antwort auf einen Glukosestimulus ist jedoch mangelhaft. Erst ein bis zwei Stunden nach Stimulus erfolgt eine Antwort auf der Transkriptionsebene. Zwei bis vier Stunden später erfolgt die Insulinsekretion (CHAN et al. 2003).
In der dritten Strategiegruppe arbeitet man am Gentransfer von ß-Zell-Neogenese induzierenden Genen. Hierbei wird über Adenoviren (HDAd) das NeuroD/ß2-Gen in die Leberzellen eingebaut, das diese in glukosesensitive, insulinproduzierende ß-Zellen umwandelt (O'NEAL et al. 1998; LOZIER et al. 1999; FERBER et al. 2000; OKA et al. 2000;
O'NEAL et al. 2000). Mit dem NeuroD/ß2-Gentransfer und dem ß- Zell-Wachstumsfaktor Betazellulin konnten Normoglykämie, normale Plasmainsulinlevel und eine normale Glukosetoleranz erreicht werden. Des Weiteren konnten kapselnah Inselzellkluster in der Leber nachgewiesen werden, die die Eigenschaften von Hepatozyten verloren haben, und stattdessen glukoseresponsiv Insulin, Glukagon, Somatostatin und pankreatisches Polypeptid sezernieren (KOJIMA et al. 2003).
Bis zu ersten klinischen Versuchen muss jedoch die Stabilität des Gentransfers und die Sicherheit der Vektoren verbessert werden. Die somatische Gentherapie zur Behandlung des DM-Typ-I befindet sich noch in den Anfängen der experimentellen Phase (CHAN et al.
2003).
2.2.4 Pankreastransplantation
Die Heilung des DM-Typ-I erfordert die Übertragung funktionstüchtiger Langerhans’scher Inseln. Die Pankreastransplantation stellt dabei eine Möglichkeit zur Übertragung dar. Die erste erfolgreiche klinische Transplantation wurde 1966 an der University of Minessota von Kelly durchgeführt (KELLY et al. 1967; STRATTA et al. 1996). Hinsichtlich der Technik unterscheidet man zwischen der SPK- (Simultaneous Pankreas Kidney), PAK- (Pankreas After Kidney) und der PTA-Transplantation (Pankreas Transplantation Alone)
(SUTHERLAND et al. 2001). Bei der SPK werden gleichzeitig Niere und Pankreas transplantiert, bei der PAK zuerst eine Niere und erst später das Pankreas und bei der PTA wird nur ein Pankreas transplantiert.
SPK und PAK sind die häufigsten Pankreastransplantationen und werden bei urämischen Typ-I-Diabetikern durchgeführt, die aufgrund diabetischer Nephropathie auch eine Nierentransplantation benötigen. Es werden dabei Pankreas, ein Teil des Duodenums, Teile von A.- und V.- iliaca, Niere und Urether eines Verstorbenen transplantiert (Abbildung2, SUTHERLAND et al. 2001).
Die PTA wird nur bei nicht urämischen Diabetikern durchgeführt. Es wird entweder das Vollorgan eines Verstorbenen oder ein Pankreassegment eines Lebendspenders transplantiert (Abbildung 3, SUTHERLAND et al. 2001).
Die Pankreastransplantation führt heute standardisiert zu Euglykämie und physiologischen HbA1C-Werten. Die Verlustrate eines Jahres liegt, aufgrund der Immunsupression (Tacrolimus, FK506, Mofetil) und der Antikörperinduktionstherapie, bei 2 % für SPK und PAK und bei 8 % für die PTA (FREISE et al. 2002; KAUFMAN et al. 2002). Obwohl die Pankreastransplantation damit eine standartisierte Methode darstellt, weist sie gegenüber der
Abbildung 3: Bladder Drainage (exokrine Produkte) und systemisch-venöser Blutabfluß (Insulin) bei einer PTA-Transplantation (modifiziert nach SUTHERLAND et al. 2001) Abbildung 2: Enteric drainage (exokrine Produkte) und
systemisch-venöser Blutabfluß (Insulin) bei einer SPK- Transplantation (modifiziert nach SUTHERLAND et al.
2001)
Inseltransplantation einige Nachteile auf (SUTHERLAND 2003). Die PTA hat eine höhere Mortalität als die eines chronischen Diabetikers, der noch auf eine Transplantation wartet (VENSTROM et al. 1988), und hat darüber hinaus eine höhere Morbidität als die Inseltransplantation (SOLLINGER et al. 1998). Die Pankreastransplantation selbst ist ein aufwendiger chirurgischer Eingriff, der nur an kreislaufstabilen Diabetikern vorgenommen werden kann (ULRICHS et al. 1999). Des Weiteren treten in folge der geringen Durchblutung des Pankreas und infolge seiner exokrinen Funktion oft Thrombosen, Pankreatitis, Ileus und Infektionen auf (STOCK u. BLUESTONE 2004). Die systemisch-venöse Insulindrainage kann zu Hyperinsulinämie und Hypoglykämie führen (HIRSHBERG et al. 1998). Die Drainage der exokrinen Pankreasprodukte in die Blase bei der PTA (Abbildung 3) kann zu metabolischen Acidosen, Dehydratation, chronischer Urethritis und rezidivierenden urogenitalen Infektionen führen (HIRSHBERG et al. 2003).
2.2.5 Inseltransplantation
Bei der Inseltransplantation werden lediglich die Langerhans’schen Inseln des Pankreas transplantiert. Sie enthalten alle zur Regulierung des Blutzuckerhaushaltes erforderlichen endokrinen Zellen (9,ß,?,<).
2.3 Allogene Inseltransplantation
2.3.1 Chronik der allogenen Inseltransplantation
Erste Transplantationsversuche von pankreatischem Gewebe wurden 1894 von Minkowski an der Scientific Medical Society Strasbourg durchgeführt. Es handelte sich dabei um eine autologe Transplantation, bei der Minkowski Pankreasstücke eines pankreatektomierten Hundes subkutan erneut implantierte. Der Erfolg blieb aus (MINKOWSKI.O 1892;
HIRSHBERG et al. 2003). Bereits drei Jahre später transplantierte Williams 1894 zerteilte Stücke eines Schafpankreas einem 15-Jährigen ketoacidotischen Patienten subkutan und verabreichte oral Pankreasextrakte. Der Patient verstarb nach 3 Tagen (WILLIAMS 1894;
SALMELA 1997; ROBERTSON 2004). Dreißig Jahre später versuchte Pybus vergeblich einen ähnlichen Heilversuch mit humanen Pankreasstücken eines Verstorbenen (PYBUS 1924; HIRSHBERG et al. 2003). Die ersten erfolgreichen reinen Inseltransplantationen
wurden dann fast 50 Jahre später 1972 von Ballinger und Lacy (BALLINGER u. LACY 1972) und 1973 von Reckard und Barker (RECKARD u. BARKER 1973) an Ratten durchgeführt. In den frühen 70er Jahren gelang in Minessota dann die erste erfogreiche autologe Inseltransplantation am Menschen (WAHOFF et al. 1995). Kurz darauf folgte dann 1977 die erste allogene Inseltransplantation im Menschen. Sie war jedoch erfolglos, da keine Insulinunabhängigkeit erreicht wurde (NAJARIAN et al. 1977). Largiarder berichtete dann 1980 erstmalig über Insulinunabhängigkeit nach allogener Transplantation von Pankreasmikrofragmenten, die ca. 200.000 Inseln enthielten (LARGIADER et al. 1980).
Sharp berichtete 1990 über die erste erfolgreiche allogene Inseltransplantation mit aufgereinigten Inseln (SCHARP et al. 1990). Weitere erfolgreiche Allo-Transplantationen im Menschen sind in Tabelle 2 aufgelistet und wurden von 1980 bis 2000 durchgeführt. In diesen 20 Jahren wurden weltweit über 300 allogene Inseltransplantationen durchgeführt (Diagramm 1, S.14, HERING u. RICORDI 1999) Diese zeigten jedoch, wenn überhaupt, nur kurzzeitige Funktion in Form von messbarem C-Peptid (Vorstufe des Insulins, STOCK u. BLUESTONE 2004).
Der eigentliche Durchbruch erfolgte im Jahr 2000 durch das sogenannte Edmonton Protokoll.
Die Arbeitsgruppe um Shapiro an der Universität von Alberta konnte nachweisen, dass Insulinunabhängigkeit nach allogener Inseltransplantation mit Hilfe einiger Modifikationen konstant und reproduzierbar erreicht werden konnte. Die Ursache dieses Erfolges ließ sich im Wesentlichen auf 5 Modifikationen zurückführen.
1.) Einführen der Multidonor-Transplantation
Die transplantierten Inseln wurden von 2 oder 3 unterschiedlichen Spendern gepoolt. Auf diese Weise wurde festgestellt, dass zum Erreichen der Insulinunabhängigkeit mindestens 8000 bis 9000 IEQs (Iselt equivalents: errechnete Inselzahl, bei der alle Inseln einen Durchmesser von 150Em besitzen): pro kg Körpergewicht nötigt waren (SHAPIRO et al.
2000).
2.) Weitestgehender Verzicht auf ß-Zell-toxische Immunsuppressiva
Es wurde auf steroidale Immunsuppressiva verzichtet und der Anteil an Calcineurinhibitoren gesenkt. Zu Einsatz kamen Dacluzimab, Tacrolimus und Sirolimus (SHAPIRO et al. 2000; STOCK u. BLUESTONE 2004).
Tabelle 2: Übersicht über Berichte der erfolgreichen Inseltransplantationen
Autor / Datum Empfängerzahl/
Inselzahl Ergebnis
(LARGIADER et al. 1980)
1 Patient/200.000 Inseln, allogen
9,5 Monate insulinunabhängig mit normalen Blutzuckerwerten
(SCHARP et al.
1990)
1 Patient/800.000 Inseln, allogen
22 Tage insulinunabhängig (TZAKIS et al.
1990)
9 Patienten /205.000 bis 746.000 Inseln, autolog
Normale HbA1C-Level bei 5 Patienten (WARNOCK et
al. 1991)
1 Patient/611.000 Inseln, allogen
Bis 3 Monate insulinunabhängig mit normalen Blutzuckerwerten
(SCHARP et al.
1991)
9 Patienten /6.161bis 13.916 Inseln pro kg KGW, allogen
2 Patienten 1 bis 5 Monate insulinunabhängig mit normalen Blutzuckerwerten, 4 Patienten mit messbarem C-Peptid-Level
(WARNOCK et al. 1992)
4 Patienten /261.000 bis 896.000 Inseln, allogen
1 Patient 1 Jahr insulinunabhängig mit normalen Blutzuckerwerten, 3 Patienten mit messbarem C- Peptid-Level bis zu 10 Monaten
(GORES et al.
1993)
2 Patienten /502.000 bis 528.000 Inseln, allogen (frische und
kryokonservierte)
1 Patient 8 Monate insulinunabhängig mit normalen Blutzuckerwerten, 1 Patient mit messbarem C-Peptid-Level bis 9 Monate (SOON-SHIONG
et al. 1994)
1 Patient /678.000 verkapselte Inseln, allogen
9 Monate insulinunabhängig mit normalen Blutzuckerwerten
(CAROLL et al.
1995)
1 Patient, Inselzahl?, autolog
3 Jahre insulinunabhängig mit normalen HbA1C- Werten
(LUZI et al. 1996) 15 Patienten /98.587 bis 1.294.125 Inseln, allogen
4 Patienten 1 bis 8 Monate insulinunabhängig mit normalen HbA1C-Werten, 8 Patienten mit
messbarem C-Peptid-Level (ALEJANDRO et
al. 1997)
8 Patienten /478.000 bis 1.271.000 Inseln, allogen
2 Patienten 6 Jahre insulinunabhängig mit normalen HbA1C-Werten, 1 Patient 8 Monate insulinunabhängig
(SECCHI et al.
1997)
20 Patienten /3.461 bis 14.488 IEQs pro kg KGW, allogen
1 Patient 2 Jahre, 6 Patienten 8 Monate
insulinunabhängig mit normalen HbA1C-Werten, 9 Patienten mit messbarem C-Peptid-Level (KEYMEULEN
et al. 1998)
7 Patienten /2.100 bis 5.300 IEQs pro kg, allogen
2 Patienten 1 Jahr insulinunabhängig mit
normalen HbA1C-Werten, 3 Patienten über 1 Jahr mit messbarem C-Peptid-Level
(OBERHOLZER et al. 2000)
13 Patienten /199.000 bis 863.000 Inseln, allogen und autolog
2 Patienten 4 bis 36 Monate insulinunabhängig, restliche Patienten mit messbarem C-Peptid-Level über 3 Monate
(SHAPIRO et al.
2000)
7 Patienten /11.546
±1604 Inseln, allogen
Alle Patienten 4 bis 15 Monate insulinunabhängig
Abbildung 4: Inseltransplantationszentren mit der Anzahl der im Menschen durchgeführten allogenen Inseltransplantationen zwischen 2000 und 2002 (modifiziert nach STOCK u. BLUESTONE 2004) Diagramm 1: Anzahl allogener Inseltransplantationen im Menschen von 1980 bis 2000 (modifiziert nach STOCK u. BLUESTONE 2004)
3.) Transplantation frisch isolierter Inseln
Der Inselverlust während der Kulturphase wurde vermieden und eine maximale Anzahl von Inseln konnte somit transplantiert werden (SHAPIRO et al. 2000).
4.) Verzicht auf fetales Kälberserum während des Isolationsprozesses
Kälberserum steigert die Immunogenität der Inseln (SHAPIRO et al. 2000).
5.) Minimierung der kalten Ischämiezeit
Die kalte Ischämiezeit ist die Zeitspanne zwischen Organentnahme und Implantation in den Empfänger. Durch Minimierung dieser Zeitspanne wurde die Wahrscheinlichkeit einer hypoxischen Inselschädigung minimiert (HIRSHBERG et al. 2003).
Seit diesem Erfolg und der Übernahme des Protokolls gab es weltweit weitere Erfolgsmeldungen von verschiedenen Zentren, wie z.B. Miami (ALEJANDRO et al. 2003), Philadelphia (MARKMANN et al. 2003), Minnessota (HERING et al. 2001, 2003), Milan (LUZI et al. 2001) und der schweizerisch-französischen Gruppe (BENHAMOU et al. 2001).
Alleine zwischen 2000 und 2002 erhielten hiernach 282 Patienten weltweit eine allogene Inseltransplantation an den verschiedensten Zentren (FDA-Trail, Abbildung 4, STOCK u.
BLUESTONE 2004).
2.3.2 Technik der allogenen Inseltransplantation
Die Infusion Langerhans´scher Inseln in die Leber ist bisher die einzige Technik, die im Menschen dauerhaft erfolgreich zur Insulinunabhängigkeit geführt hat (STOCK u.
BLUESTONE 2004). Nach der Inselisolation aus dem Spenderpankreas (Kap. 2.8.5) werden die Inseln über die Pfortader in die Leber infundiert. Die Infusion erfolgt entweder direkt mittels perkutaner, transhepatischer Punktion der Pfortader (Abbildung 6, S.17) oder indirekt durch Punktion mesenterialer Venen (V. colica inferior) nach einer Laparatomie (SHAPIRO et al. 2000; HERING et al. 2001; RYAN et al. 2001, 2002; MARKMANN et al. 2003;). Die direkte Pfortaderpunktion wird aufgrund ihres minimalinvasiven Charakters bevorzugt bei der Islet after Kidney Transplantation (IAK) oder der Solitary Islet Transplantation (SIT) verwendet (BERNEY et al. 2001a). Die indirekte Methode wird bei der Simultaneous Islet Kidney (SIK) Transplantation bevorzugt. Bei der SIK ist die Bauchhöhle zur Nierentransplantation bereits eröffnet, sodass die Inseln in die V. colica inferior infundiert werden können (BERNEY u. RICORDI 2000). Bei beiden Methoden werden die infundierten
Inseln über den portalen Blutstrom in die Lebersinusoiden gespült (Abbildung 5). Dort setzen sie sich fest und nehmen ihre Funktion auf (ROBERTSON u. KENDALL 2003). Zur Verhinderung von Thrombosen wird Heparin während der Infusion appliziert (SHAPIRO et al. 2001). Bei IAK und SIT wird nach der Inselinfusion zur Verhinderung hepatischer Blutungen ein Hämostatikum während des Zurückziehens des Katheters durch das Lebergewebe appliziert (STOCK u. BLUESTONE 2004). Zwecks Immunsuppression erhält der Patient als Induktionstherapie (Edmonton Protokoll) nur während der Inselinfusion Dacluzimab (SHAPIRO et al. 2000; SHAPIRO et al. 2003). Als Erhaltungstherapie wird Sirolimus und Low dose Tacrolimus verabreicht (STOCK u. BLUESTONE 2004).
2.3.3 Stand der allogenen Inseltransplantation
Bis heute ist der längste Follow-up Report nach allogener Inseltransplantation der der Edmontongruppe (RYAN et al. 2002). Von den in Edmonton transplantierten 30 Patienten, die mit insgesamt 54 Transplantationen behandelt wurden, sind 17 nach Inseltransplantation insulinunabhängig und gingen in die Follow-up Untersuchung ein. Entsprechend einer Publikation von 2002 sind weiterhin 11 Patienten insulinunabhängig. Die durchschnittliche Zeit der Unabhängigkeit beträgt dabei 20,4 Monate. Keiner der elf insulinunabhängigen Empfänger hatte jedoch normale Werte im Glukosetoleranztest (GTT). Dieses lässt auf die Transplantation einer zu geringen Inselzahl schließen, welche zwar zum Erhalt normoglykämischer Werte reicht, jedoch bei einer Belastung durch einen Glukoseschub nicht mehr ausreicht.
Sechs Patienten benötigen wieder Insulin. Drei dieser sechs Patienten weisen jedoch noch immer deutliche Level an C-Peptid auf, die anderen drei zeigen erhöhte Antikörpertiter gegen Inselantigene (Antikörperspezifität siehe bei Ryan, RYAN et al. 2002). Bei den zuletzt genannten Patienten vermutet man ein Auftreten der Immunantwort gegen das Inseltransplantat, während bei den erstgenannten Patienten ein Insel–Burn-Out vermutet wird (Erschöpfung der Insulinsekretion aufgrund Überbelastung durch Transplantation einer zu geringen Inselzahl). Bis zu diesem Zeitpunkt sind des Weiteren keine schweren Komplikationen durch OP-Technik oder durch Übertragung von Erregern durch das Transplantat bekannt. Als nicht infektiöse Komplikation wird der vorübergehende Anstieg
Abbildung 5: Schematische Darstellung der Inselisolation, Inselseparation und Inseltransplantation (IAK oder SIT) (modifiziert nach BERNEY et al. 2001a)
Abbildung 6: Percutane, transhepatische Pfortaderpunktion bei der IAK oder SIT (modifiziert nach BERNEY et al. 2001a)
des Pfortaderdrucks nach intraportaler Inselinfusion erwähnt. Darüber hinaus auftretende Komplikationen konnten der Immunsuppression zugeschrieben werden. Zu den häufigsten gehören renale Insuffizienz, Proteinurie, Hypertonie, Hypercholesterolämie, Leukopenie und orale Ulcera.
2.3.4 Vorteile der allogenen Inseltransplantation
Die allogene Inseltransplantation besitzt eine Reihe von Vorteilen gegenüber den bisher vorgestellten Therapiemöglichkeiten (intensivierte Insulintherapie, Insulinpumpen, Ex-vivo–
und In-vivo-Gentherapie, Pankreastransplantation). Anders als bei der konservativen Insulintherapie und den Insulinpumpen kann durch die Inseltransplantation der Blutzucker physiologisch optimal reguliert werden (ZINMAN 2001; EMERICH 2002). Die durch schlechte Blutzuckereinstellung entstehenden typischen Gefäßerkrankungen und ihre Folgen wären somit vermeidbar. Ex-vivo- und In-vivo-Genterapie befinden sich noch immer im experimentellen Stadium, während die allogene Inseltransplantation bereits klinische Erfolge aufweisen kann (Kap. 2.3.3). Im Vergleich zur Pankreastransplantation stellt die Inseltransplantation chirurgisch ein einfaches Verfahren dar und kann auch an kreislauflabilen Patienten durchgeführt werden. Weiterhin bedarf es aufgrund des Fehlens des exokrinen Pankreasgewebes bei der Inseltransplantation keiner Drainage der exokrinen Enzyme. Auch eine Verringerung der Transplantatimmunogenität kann durch das Fehlen des immunogenen exokrinen Pankreasgewebes erreicht werden (SUTHERLAND et al. 2004). Die Inseltransplantation ist zusätzlich dadurch immunologisch begünstigt, dass Inseln keinen Gefäßanschluß benötigen und nicht vom Empfängerblut durchströmt werden. Zusätzlich sind Inseln Gal 91-3 negativ (Kap. 2.6). Inseln sind darüberhinaus immunmodulierbar. Durch mehrtägige Inselkultur, Kryokonservierung und Bestrahlung mit UV-Licht kann die Immunogenität der Inseln gesenkt werden, da sie durch diese Behandlung Passagierleukozyten und einen Teil ihrer Oberflächenstrukturen verlieren (FORSEN et al.
1984; BRETZEL et al. 1990; RICHERT et al. 1991). Auch eine Verkapselung, die vor dem Empfängerimmunsystem schützt (Kap. 2.3.5.1), kann an Inseln durchgeführt werden (SAMBANIS 2003). Inselbanking durch Kryokonservierung und Inselkultur ermöglicht lange Lagerzeiten und dadurch wiederum das Poolen von Inseln verschiedener Isolationen zu einem Inseltransplantat (STOCK u. BLUESTONE 2004). Durch die Inselisolation können auch aus
Pankreata, die nicht mehr zur Vollorgantransplantation geignet sind (Pankreatitis, Pankreasfibrose, Traumatisierung, neoplastische Veränderungen), zur Transplantation geeignete Inseln gewonnen werden (SUTHERLAND 2003). Darüber hinaus scheinen die Stammzelltechnologie (Kap. 2.3.5.2) und die Verwendung xenoger Inseln (Kap. 2.3.5.3) eine neue, nahezu unerschöpfliche Quelle für Inseltransplantate zu bieten.
2.3.5 Zukunft der allogenen Inseltransplantation
Die in naher Zukunft zu überwindenden Schwierigkeiten sind in erster Linie die allogene Abstoßungsreaktion und der Mangel an Spender-Inseln. Die allogene Abstoßungsreaktion könnte durch die Immunoisolation Langerhans’scher Inseln umgangen werden (Kap. 2.3.5.1) Der Mangel an Spenderorganen wird möglicherweise mit Hilfe der Stammzelltechnologie (Kap. 2.3.5.2) und der xenogenen Inseltransplantation (Kap. 2.3.5.3) überwunden.
2.3.5.1 Immunisolation Langerhans’scher Inseln
Die Immunisolation Langerhans’scher Inseln soll diese vor dem Immunsystem des Empfängers schützen. Die transplantierten Inseln werden dabei durch eine Schranke vom Immunsystem des Empfängers getrennt. Als Schranke fungiert eine Kapsel oder Membran, die die Diffusion von Nährstoffen, Glukose und Hormonen in beide Richtungen erlaubt, jedoch eine Beschädigung der Inseln durch humorale und zelluläre Immunmechanismen verhindert (LANZA u. CHICK 1997; ULRICHS et al. 1999). Zur Immunisolation werden verschiedene Materialien verwendet, in die die Inseln nach der Isolation eingebettet werden.
Sie müssen biologisch innert und gut verträglich sein. Zu den gebräuchlichsten Materialien gehören Acryl-Kopolymer-Hohlfasern (SCHARP et al. 1994), Silikon (HIROTANI et al.
1998), Polylysin Alginate (SIEBERS et al. 1997) und Biodritin (MARIA-ENGLER et al.
2001). Auch biologische Membranen wie autologe, FAS-Ligand transgene Myoblasten (LAU et al. 1996) oder autologe Chondrozyten werden verwendet (MARKUS 2004). Mittels Immunisolation konnten ohne Immunsuppression beeindruckende Resultate beim Transplantatüberleben erzielt werden (SAMBANIS 2003). Leider induzieren viele Materialen jedoch Fremdkörper- und Entzündungsreaktionen, die eine Bindegewebsproliferation hervorrufen. Das gebildete Bindegewebe behindert die Nährstoff- und Hormondiffusion und führt zu Funktionsverlust und Transplantatnekrosen. Die Entzündungsreaktion lockt
Stickoxid-sezernierende Makrophagen an. Das kleine Stickoxidmolekül (NO) kann die Membranen durchdringen und die eingekapselten Zellen zerstören (WIEGAND et al. 1993).
Auch das Wachstum der Inselzellen kann die Immunkapsel zerstören (ROKSTAD et al.
2003).
2.3.5.2 Gewinnung Langerhans’scher Inseln durch Stammzelltechnologie
Die Etablierung der allogenen Inseltransplantation wird in den nächsten Jahren zwangsläufig zu einem Mangel an humanem Inselzellgewebe führen. Daher wendet sich die Forschung nun bereits anderen Quellen zu, die die Langerhans’schen Inseln für eine Transplantation liefern könnten (BERNEY et al. 2001a). Eine dieser möglichen Quellen ist die Stammzellentechnologie, mit deren Hilfe aus humanen Stamm- oder Vorläuferzellen gezielt insulinproduzierende ß-Zellen differenziert werden, um diese danach zu transplantieren (BERNEY et al. 2001a). Bei der Stammzelltechnologie unterscheidet man zwischen adulten und embroynalen Stammzellen.
Die embryonalen Stammzellen werden einer humanen Blastocyste im 32-Zell-Stadium entnommen und kultiviert, um sie in ß-Zellen zu differenzieren. Die Blastocyste stammt dabei aus einer humanen, in-vitro fertilisierten Eizelle. Die wichtigsten Eigenschaften dieser Stammzellen sind: erneuerbares Wachstum, selektive Differenzierbarkeit und stabile genetische Modifikation (STOCK u. BLUESTONE 2004). Adulte Stammzellen sind im Knochenmark von erwachsenen Individuen anzutreffen. Bei Knochenmarktransplantationen übertragene Zellen wurden im Pankreas wiederentdeckt, wo sie zu ß-Zell-ähnlichen Zellen ausdifferenzierten (HESS et al. 2003; YOUNG et al. 2004). Dieses lässt vermuten, dass Reservestammzellen für den endokrinen Pankreas im Knochenmark vorhanden sind (HESS et al. 2003; VERFAILLIE et al. 2003; YOUNG et al. 2004). Darüber hinaus konnte nachgewiesen werden, dass eine bestimmte Population von Knochenmarkzellen in eine Vielzahl somatischer Zellen ausdifferenziert werden kann (VERFAILLIE et al. 2003). Diese Stammzellen konnten bereits in insulinproduzierendes, inselähnliches Gewebe transdifferenziert werden (LUMELSKY et al. 2001; HORI et al. 2002). Die Zellen expandierten nach Transplantation in diabetische Tiere und zeigten Langzeitfunktion (LUMELSKY et al. 2001).
Neben den Stammzellen gelten auch die Vorläuferzellen oder Progenitorzellen als eine mögliche Quelle für Inselgewebe. Man konnte nachwiesen, dass es nach ß-Zellschädigung auch im reifen Pankreas noch zur Regeneration von ß-Zellmasse kommen kann, (PELENGARIS et al. 2002; HAYASHI et al. 2003) und dass bereits differenzierte exokrine und ductale Zellen in ß-Zellen transdifferenzieren können (BONNER-WEIR 2000; TRIVEDI et al. 2001).
Sollte eine permanente Kultivierung und selektive Differenzierung obiger Zelllinien gelingen, würden diese einen unerschöpflichen Vorrat an Inselzellen liefern (STOCK u. BLUESTONE 2004). Unglücklicherweise konnten die bisher erschienenen Publikationen lediglich die Machbarkeit andeuten. Ein Durchbruch auf diesem Gebiet lässt bis heute auf sich warten.
2.3.5.3 Verwendung xenogener Inseltransplantate
Eine weitere Quelle für Inselzellgewebe werden in Zukunft Inselzellen anderer Species darstellen. Bei der xenogenen Inseltransplantation werden adulte, neonatale oder fetale Inseln nicht menschlicher Species in den Menschen transplantiert (THOMPSON u. MANDEL 1990;
WEIR et al. 1997).
2.4 Xenogene, porcine Inseltransplantation
2.4.1 Chronik der xenogenen, porcinen Inseltransplantation
Nach entscheidenden Verbesserungen der Isolationstechnik adulter, porciner Inseln 1986 (RICORDI et al. 1986) folgte die erste Veröffentlichung einer experimentellen porcinen Inseltransplantation in immunologisch begünstigte Nacktmäuse durch Ricordi 1987 (RICORDI u. LACY 1987). Weitere Veröffentlichungen schlossen sich an (Überblick:
TRIVEDI et al. 2001). Empfänger in diesen Publikationen waren jeweils verschiedene Nager, wie z.B. Ratten, Nacktmäuse, NOD-Mäuse oder SCID-Mäuse (RICORDI et al. 1988a;
SHIROKI et al. 1996). Auch erste Versuche mit immunisolierten, porcinen Inseln wurde durchgeführt (LANZA u. CHICK 1997). Bis heute gibt es nur wenige Veröffentlichungen über porcine Inseltransplantationen in Primaten oder Menschen. Tabelle 3 (S.22) gibt hierüber einen Überblick und präsentiert deren Ergebnisse. Es wird deutlich, dass es bis heute noch nicht zu langerfristiger Insulinunabhängigkeit nach einer xenogenen Inseltransplantation kam
(HERING u. RICORDI 1999). Ein entscheidender Durchbruch wie bei der Allotransplantation lässt bis heute auf sich warten. Trotzdem liegt die xenogene Inseltransplantation heute bereits wesentlich näher an der Realisierbarkeit als etwa die Gen- oder Stammzelltherapie (DAVALLI et al. 1995; VIZZARDELLI et.al. 2002).
Als vielversprechenste Ansätze gelten die Untersuchungen der Gruppe um Sun und Korsgren (Tabelle 3). Die Gruppe um Korsgren erreichte nach Transplantation neonataler Inselzellkluster in 5 Diabetiker geringe C-Peptid-Sekretion für 200 bis 400 Tage. Die Patienten erhielten eine Immunsupression (KORSGREN et al. 1992). Der Gruppe von Sun gelang es, durch Transplantation von 3-7 x 104 verkapselten porcinen Inseln in neun Affen bei
Autor / Datum Institut/ Ort Inseltyp Empfänger Ergebnis
(GROTH et al 1980) Stockholm fetal, porcin Mensch keine längerfristige Insulinunabhängigkeit (SHUMAKOV et al
1989)
Moskau fetal, porcin Mensch keine längerfristige Insulinunabhängigkeit (KORSGREN et al
1992)
Stockholm fetal, porcin Mensch 4 Patienten mit C-Peptid-Level für 200 bis 400 Tage
(TURCHIN et al 1995)
Kiev neonatal, porcin Mensch keine längerfristige Insulinunabhängigkeit (SUN et al 1996) Toronto adult, porcin,
verkapselt
Cynomolgus Affen
800 Tage insulinunabhängig (KOVALSK et al
1997)
Ukraine neonatal, porcin Mensch keine längerfristige Insulinunabhängigkeit (REINHOLT et al
1998)
Stockholm fetal, porcin Mensch insulinpositive Zellen nach Biopsie
(BLOCH et al 1998) Tel-Aviv neonatal/adult, porcin
Mensch neonatale Inseln induzieren geringe T-Zell-Antwort (ELLIOT et al 2000) Auckland neonatal, porcin Mensch Plasma C-Peptid in 2 Patienten
für 5 Monate nachweisbar (SODERLUND et al
1999)
Stockholm fetal, porcin Cynomolgus Affen
Insel nach 12 Tagen komplett zerstört
(RIJKELIJKHUIZEN et al 2000)
Leiden adult, porcin Makaken keine längerfristige Insulinunabhängigkeit (RIJKELIJKHUIZEN
et al 2000)
Leiden adult, porcin Makaken keine längerfristige Insulinunabhängigkeit (BENNET et al 2000) Schweden adult, porcin Cynomolgus
Affen
keine längerfristige Insulinunabhängigkeit (WIJKSTROM et al
2001)
Ort? adult, porcin Rhesus Affen C-Peptid bis Tag 22, in Biobsie vitale Inseln bis Tag 22 (BÜHLER et al.
2002)
Boston adult, porcin Baboon C-Peptid bis Tag 5, in Biobsie vitale Inseln bis Tag 14 (KIRCHHOF et al
2004)
Minessota adult, porcin Rhesus Affen insulinunabhängig für 3 Tage Tabelle 3: Übersicht über Berichte porciner, xenogener Inseltransplantationen in Primaten und in Menschen
sieben Tieren Insulinunabhängigkeit für 120 bis 800 Tage zu erreichen. Die Tiere waren nicht immunsupprimiert (SUN et al. 1996). Auf dem Gebiet der klinischen Xenotransplantation stellt sich somit die Transplantation verkapselter, adulter, porciner Inseln als vielversprechend dar (ULRICHS et al. 1999).
2.4.2 Vorteile der xenogenen Inseltransplantation
Neben den Vorteilen der allogenen Inseltransplantation (Kap. 2.3.4), die auch für die xenogene Inseltransplantation gelten, kann zusätzlich eine Reihe weiterer Vorteile für die Xenotransplantation geltend gemacht werden. Die xenogene Inseltransplantation weist bereits bedeutende experimentelle Erfolge auf (Kap. 2.4.1, KORSGREN et al. 1992; SUN et al.
1996). Die Pankreastransplantation und die allogene Inseltransplantation sind von den äußerst begrenzt vorkommenden humanen Spenderpankreata abhängig. Beide Methoden konkurieren um die Spenderpankreata, sodass sich der Mangel an Spenderorganen besonders für die allogene Inseltransplantation verschärft. Im Gegensatz dazu sind porcine Pankreata für die xenogene Inseltransplantation, aufgrund der hohen Verfügbarkeit des Schweins und seiner kostengünstigen Haltung, nahezu unerschöpflich vorhanden. Die xenogene Inseltransplantation ist außerdem besser planbar als die allogene Inseltransplantation (ULRICHS et al. 1999). Da bei der Allo-Transplantation Organe nur zufällig anfallen, muss sich der Empfänger innerhalb kürzester Zeit an der Klinik einfinden. Der Empfänger eines Xenotransplantates muss dies nicht. Passende Spendertiere könnten im Vorfeld durch einen Vergleich ihres MHC-Typs (Major Histocompatibility Complex) mit dem des Empfängers gefunden werden. Auch könnten xenoreaktive Antikörper oder Immunzellen, wie z.B.
xenoreaktive T-Zellen, durch Immunabsorbtion vor der Xenotransplantation aus dem Empfänger entfernt werden (LIN et al. 1997). Dadurch würden hyperakute und zelluläre Abstoßungsvorgänge abgeschwächt (ULRICHS et al. 1999). Ein weiterer Vorteil ist, dass porcine Inseln aufgrund ihrer SLA-Expression (MHC-Typ der Schweine) durch die Autoimmunkomponenten des Empfängers nicht mehr erkannt werden. Xenotransplantierte, porcine Inseln wären somit immun gegen ein erneutes Auftreten der Insel-Autoreaktivität (THOMAS et al. 1999; GYSEMAN et al. 2002; MAKHLOUF et al. 2002). Darüberhinaus könnten aufgrund der Fortschritte im Bereich des somatischen Klonens beim Schwein (HÖLKER 2003), im Bereich des Gen-Knock-Outs (PHELPS et al. 2003a) und im Bereich
der Integration von Fremdgenen schon bald gentechnisch veränderte Schweine erzeugt werden, die immunologisch besonders begünstigt sind. Die so veränderten Schweine könnten sogar den MHC-Typ des Empfängers exprimieren. Bereits heute existieren Schweine die humanes CD59 und humanes DAF auf ihren Zelloberflächen exprimieren (COWAN et al.
2000; MURAKAMI et al. 2002; PHELPS et al. 2003b; SCHMIDT et al. 2003a).
[Anmerkung: CD59 und DAF blockieren die Komplementkaskade.] Aufgrund der kurzen Trächtigkeitsdauer des Schweins (3 Monate) und des schnellen Erreichens des Erwachsenenalters (6 Monate) könnte ein Empfänger theoretisch auf speziell für ihn konzipierte gentechnisch veränderte Inseln warten, die ein geringeres Abstoßungsrisiko hätten als humane Inseln.
2.4.3 Problematik der xenogenen Inseltransplantation
Trotz der Vorteile der xenogenen Inseltransplantation (Kap. 2.4.2) steht dem klinischen Einsatz dennoch eine Reihe von Hindernissen gegenüber (Tabelle 4). Das größte Problem ist aber zweifelsohne die Überwindung der xenogenen Transplantatabstoßung. Das Verstehen der xenogenen Immunantwort auf porcine Inseln ist unbedingt notwendig, um eine gezielt eingreifende Strategie zu entwickeln, die eine Abstoßung porciner Inseltransplantate verhindert (MACKENZIE et al. 2003). Immunologische Modelle, die es erlauben, ein funktionierendes, humanes Immunsystem und porcine Inseln in einer in-vivo-Umgebung zusammenzubringen, wäre für eine detaillierte Untersuchung dieser Abstoßungsmechanismen sehr hilfreich (Kap. 2.7, PYZDROWSKI et al. 1992; KENDALL et al. 1997; HIRSHBERG et al. 2002; RITZ-LASER et al. 2002)
2.5 Immunologische Grundlagen der Xenotransplantatabstoßung
Im folgenden Kapitel werden die Grundlagen der Abstoßungsmechanismen vaskularisierter Xenotransplantate (Vollorgane) dargestellt und dann in Kap. 2.6 den Mechanismen der Abstoßung nicht vaskularisierter Xenotransplantate (Inseln) gegenübergestellt.
2.5.1 Hyperakute Xenotransplantatabstoßung
Zu jeder Zeit der Abstoßung vaskularisierter Organe (hyperakut, akut oder chronisch) stellt das Gefäßendothel des transplantierten Organs die vorderste Angriffsfront dar (GRIMM 2003). Unglücklicherweise fällt dem Endothel eine zentrale Rolle in der Regulation der plasmatischen Kaskadensysteme, wie z.B. der Komplementkaskade und der Gerinnungs- kaskade zu. Es verhindert eine ungewollte Aktivierung dieser Systeme (GRIMM 2003).
Autoren / Datum Problem Bereich Problem
mangelhafte Inselausbeute mangelhafte Inselreinheit mangelhafte morphologische Inselstabilität
(HERING et al. 1996; BASIR et al. 1997; MEYER et al.
1997; BRENDEL et al. 2001)
Inselisolationsprozess
schlecht entwickeltes, extrazelluläres Matrixprotein (E.M.P.) der Inseln portaler Bluthochdruck
Anstieg der Leberenzyme
versehentliche Gallenblasenpunktion Portalvenenthrombosen
Leberblutungen (CARLSSON et al. 2002;
CASEY et al. 2002;
HIRSHBERG et al. 2002;
INVERARDI et al. 2003)
Inseltransplantation (ITX)
schlechte
Transplantatrevaskularisation pathologische Glukosetoleranz nach der Inseltransplantation (ITX) Insel-Burn-Out
mangelhafte Glukagonantwort intrahepatische, peri-insuläre Glykogenablagerungen (ROBERTSON et al. 1996;
GUPTA et al. 1997;
HIRSHBERG et al. 2002)
metabolische Inkompatibilität
erhöhte, nicht diabetische Blutzuckerwerte
porcines, lymphotrophisches Herpesvirus (PLHV-1)
porcines Cytomegalovirus (PCMV) porcines, endogenes Retrovirus (PERV)
(CLEMENCEAU et al. 1999;
ELLIOTT et al. 2000;
GROTH et al. 2000;
CLEMENCEAU et al. 2001;
LANGFORD et al. 2001;
TACKE et al. 2001;
BLUSCH et al. 2002;;
GOLTZ et al. 2002; HAN et al. 2002; MUELLER et al.
2002; HIRSHBERG et al.
2003; MACKENZIE et al.
2003)
potentielle
Übertragung porciner Viren auf den
Menschen
Post-Transplant-Lymphoproliferativ- Desease-Virus (PTLD- Virus) Tabelle 4: Problematik xenogener Inseltransplantationen
Hierzu exprimiert das Endothel besondere Oberflächenmoleküle, die im Laufe der hyperakuten Abstoßung in Mitleidenschaft gezogen werden. Das Proteoglykan Heparansulfat z.B. bindet Antithrombin III und startet somit eine Enzymkaskade, an deren Ende aktiviertes Protein C und Protein S die aktivierten Gerinnungsfaktoren V und VII spalten. Proteoglykan blockiert somit die Gerinnungskaskade (FURIE u. FURIE 1992; ESMON 1993; IHRCKE et al. 1993). Der DAF (Decay Accelerating Factor) inhibiert die Bildung der C3- und C5- Konvertase und blockiert dadurch das Komplementsystem. Das Protektin und der Homologe Restrinktionsfaktor verhindern die Bindung von C8 und C9 und damit die Fertigstellung des membranattackierenden Komplexes. Die entsprechenden Oberflächenmoleküle auf xenogenen Transplantaten können die Aktivierung der humanen Kaskaden aber nicht verhindern (GRIMM 2003). Die Folgen sind Gerinnung, Thrombenbildung, Gefäßverschluss, Ischämie, Hypoxie und letztendlich Nekrose des Transplantatgewebes. All dies geschieht innerhalb von Minuten. Folgende Mechanismen liegen dabei der Schädigung des Endothels und seiner Oberflächenmoleküle zu Grunde (Abbildung 7).
Präformierte, humane Antikörper, die gegen das Gal 91-3 Disaccharid auf der porcinen Endotheloberfläche gerichtet sind, stellen die Hauptursache für das Auftreten der hyperakuten Xenoabstoßung dar. Die Anti-Gal-Antikörper binden an diese Zuckerstrukturen und führen über die Bindung von humanen C1q zur Aktivierung der humanen Komplementkaskade über den klassischen Weg (Abbildung 7, DALMASSO et al. 1992; LU et al. 1994) . Darüber hinaus vermutet man noch das Vorhandensein weiterer präformierter Antikörper, die gegen andere Epitope gerichtet sein könnten (GALILI 1993). Am Ende der Komplementkaskade steht der membranattackierende Komplex (MAC), der eingebaut in die Endothelzellmembran zur osmotischen Lyse dieser Zelle führt (PODACK 1986). Hierdurch wird die subendotheliale Matrix freigelegt, und über die dadurch freigelegten Kollagenfasern und über den van WiIlebrand Faktor wird das Gerinnungssystem aktiviert (Abbildung 7, HUNT u.
ROSENBERG 1993; BACH et al. 1994). Des Weiteren führt die Bildung des MAC zur Freisetzung eines Prothrombinasekomplexes (HAMILTON et al. 1990), welcher Thrombozyten zur Aggregation und Sekretion von Gerinnungsfaktoren und Fibrinogen veranlasst (Abbildung 7, HUNT u. ROSENBERG 1993; BACH et al. 1994). Das während des Ablaufs der Komplementkaskade freiwerdende C5a spaltet das endotheliale Heparansulfat, wodurch es zum Verlust der oben beschriebenen Gerinnungshemmung kommt (PLATT et al.
1990). Darüber hinaus wird Heparansulfat benötigt, um zusammen mit der Superoxiddismutase anfallende Sauerstoffradikale zu entfernen, die nun ungehindert die Endothelzellen angreifen können (DALMASSO et al. 1992). C5a aktiviert nun zusätzlich die Xanthinoxidase, Sauerstoffradikale herzustellen und veranlasst neutrophile Granulozyten, sich ans Endothel zu binden und ebenfalls Sauerstoffradikale zu erzeugen (Abbildung 7, MURPHY et al. 1992; GRIMM 2003). Das während der Komplementkaskade freiwerdende iC3b fördert die Adhäsion der polymorphkernigen Granulozyten (VERCELLOTTI et al.
1991). Am Ende steht also auch hier eine Endothelzellschädigung mit Exposition der subendothelialen Matrix und Aktivierung der Gerinnung (Abbildung 7).
Eine weitere bedeutende Rolle während der hyperakuten Abstoßung spielt die sogenannte Endothelzellaktivierung Typ-I (Abbildung 7). Durch Bindung von C1q an die gebundenen Anti-Gal-Antikörper wird die Endothelzelle stimuliert, ihren Phänotyp zu verändern. Hierbei verliert sie Oberfächenstrukturen, exprimiert neue und retrahiert sich (Abbildung 7, GRIMM
Abbildung 7: Hyperakute Abstoßung und Endothelzellaktivierung Typ-I, Gal 91-3: Zuckerstrucktur, C1q/iC3b/C5a: Komplementfaktoren, DAF: decay accelerating factor, MAC: membran attacing complex, PAF:
platlet activation factor
2003). Da es sich hierbei um eine proteinsyntheseunabhängige Aktivierung handelt, geschieht dies nicht durch Transkription und Translation (BACH et al. 1994, 1998). Vielmehr werden Oberflächenstrukturen einfach abgespalten, sodass man auch von einer ablativen Aktivierung spricht. Abgespalten werden die oben beschriebenen gerinnungsprotektiven Oberflächenstrukturen (Heparansulfat, DAF, Protektin, homologer Restrinktionsfaktor). Die Exprimierung neuer Oberflächenstrukturen geschieht über die Verschmelzung von präformierten Vesikel mit der Zellmembran (GRIMM 2003). Zu den neu exprimierten Strukturen gehören P- und E–Selektin, über die polymorphkernige Granulozyten, Monozyten, Lymphozyten sowie PAF (Platlet Activation Factor) und der gerinnungsfördernde van Willebrand Faktor binden können (Abbildung 7, S.27, COUGHLAN et al. 1993). Durch die Retraktion der Endothelzellen (Gab formation) wird die Passage von Immunzellen ins xenogene Gewebe erleichtert (MALYGUINE et al. 1996) und erneut subendotheliale Matrix mit Kollagen und van Willebrand Faktor freigelegt (Abbildung 7, S.27). Die Endothelzellaktivierung Typ-I fördert somit die Gerinnung (GRIMM 2003).
2.5.2 Akute Xenotransplantatabstoßung
Die akute Abstoßung stellt die nächste immunologische Barriere nach Überwindung der hyperakuten Abstoßung dar und führt innerhalb einiger Tage nach der Transplantation zur Abstoßung xenogener Organe (BACH et al. 1994; BLAKELY et al. 1994; HANCOCK u.
BLAKELY 1994; HANCOCK 1997). Unter die akute Abstoßung fällt die Phase der akuten, vaskulären Abstoßung (AVA) sowie die Phase der spezifischen, zellulären Abstoßung, die wiederum in eine Phase der spezifischen NK-Zell-Antwort und in eine Phase der spezifischen T-Zell-Antwort einteilbar ist.
2.5.2.1 Akute, vaskuläre Abstoßung
Die akute, vaskuläre Abstoßung (AVA) tritt noch vor dem Einsetzen der spezifischen zellulären Mechanismen auf. Das zentrale Ereignis der AVA ist die Endothelzellaktivierung Typ-II. Sie ist charakterisiert durch eine transplantatweite Aktivierung des Gerinnungssystems, durch ausgeprägte Zytokinsekretion (TNF-9 , INF-?) und durch eine progrediente Infiltration mit mononukleären Zellen (Makrophagen, GRIMM u. HEIß 2003).
Im Gegensatz zur Endothelzellaktivierung Typ-I ist die Endothelzellaktivierung Typ-II eine
proteinsyntheseabhängige Aktivierung, in deren Verlauf es zur Neusynthese entscheidender Oberflächenstrukturen auf dem Endothel kommt und deshalb auch additive Aktivierung genannt wird (BACH 1998). Bedingt durch einen noch unbekannten extrazellulären Stimulus wird der zytoplasmatische Transkriptionsfaktor NFCB von seinen Inhibitor ICB durch Phosphorylierung befreit und wandert in den Zellkern der Endothelzelle. Während ICB abgebaut wird, lagert sich NFCB an die DNA an und induziert damit die endothelzellaktivierenden Gene (HENKEL et al. 1993; DIAZ-MECO et al. 1994; BROWN u.
Abbildung 8: Endothelzellaktivierung Typ-II, IL-: Interleukin, TNF: tumor nekrose factor, INF:
Interferon, MCP: monozytäres chemotaktisches Protein, V/I-Cam: Adhäsionsmoleküle, PAI: Plasminogen activation inhibitor, MHC: Major histocompatibility complex, B7.1: Costimulatormolekül ATP:
Adenosintriphosphat