Inselabstoßung und Graft versus Host Desease

Bei vier von acht Tieren der Hauptversuchsgruppe zeigten sich Symptome einer GvHD. Die GvHD trat durchschnittlich am Tag 34 (s = 1d) auf. Der Zeitpunkt des erstmaligen Auftretens der pathologischen Glukosetoleranz lag durchschnittlich am Tag 24 (s = 5d). Der Glukosetoleranztest wurde somit durchschnittlich 10 Tage vor dem Auftreten der GvHD pathologisch. Die Datierungen unterscheiden sich mit pU0,05 signifikant. Der Insulinabfall trat durchschnittlich am Tag 28 (s = 0,5d) auf. Der Insulinabfall lag damit durchschnittlich 5 Tage vor dem Eintritt der GvHD. Die Datierungen unterscheiden sich mit pU0,05 signifikant.

Die Erhöhung des Blutzuckerspiegels der drei Tiere fand durchschnittlich am Tag 26 (s = 14d) statt. Der zeitliche Abstand zwischen der Erhöhung des Blutzuckerspiegels und der GvHD betrug somit durchschnittlich 8 Tage (Diagramm 22).

Vergleicht man das zeitliche Auftreten des pathologischen GTTs, des Abfalls der Insulinsekretion und des Blutzuckeranstiegs, so zeigt sich, dass der GTT im Durchschnitt 4 Tage vor dem Abfall der Insulinkonzentration und durchschnittlich 2 Tage vor dem Anstieg

Inseltransplantatinfiltration mit humanem

Nachweis von humanem

Nachweis von

CD4+ CD8+ CD56+ CD68+ IgG porcinem

Insulin

Tag der Histologie

Tier 24 II +++ +++ - - + + 24

Tier 24 I + + - - +bis++ ++bis+++ 41

Tier 25 IV + ++ +bis++ - ++ + 51

Tabelle 16: Übersicht über die Ergebnisse der immunhistologischen Inseltransplantatuntersuchung der Tiere 24 II, 24 I und 25 IV

Dargestellt sind die Einzelwerte von drei ausgewählten Tiere der Hauptversuchsgruppe die einen Blutzuckeranstieg nach der Rekonstitution zeigten. CD3+: T-Zellen, CD4+: Th-Zellen, CD8+: Tc-Zellen, CD68+: Makrophagen, IgG: Immunglobulin G, +++: starker Befund; ++: mittelgradiger Befund, +: schwacher Befund, - kein Befund

des Blutzuckers lag. Zwischen dem Abfall der Insulinkonzentration und dem Anstieg des Blutzuckers lag eine Differenz von 2 Tagen.

Diagramm 22: Auftreten von: pathologischer Glukosetoleranz, Insulinabfall, Blutzuckersanstieg und GvHD in der Hauptversuchsgruppe, Dargestellt sind die Einzeltierwerte der Hauptversuchsgruppe und ihr Mittelwert, GTT: pathologisher Glukosetoleranztest, Insulin: Abfall der Insulinsekretion, BZ: Blutzuckeranstieg, GvHD: Auftreten der Graft versus host desease, a: gegenüber b signifikante Werte, Bei den GvHD-positiven Tieren liegen jeweils mehrere Tage zwischen dem GvHD-Eintritt und den veränderten GTT-, Insulin- und BZ-Werten.

5 10 15 20 25 30 35 40 45

Tier

Versuchstag [Tage]

GTT

Insulin

BZ

GvHD

Mittelwert Tier 24 IITier 24 I Tier 25 IVTier 22 IX Tier 22 VIII Tier 21 III Tier 27 IV Tier 23 IV

M itte l 2 2 IX 2 2 V III 2 1 III 2 4 I 2 4 II 2 5 IV 2 7 IV 2 3 IV G T T 2 4 ,0 3 2 ,0 2 4 ,0 2 8 ,0 2 0 ,0 1 2 ,0 3 2 ,0 2 0 ,0 2 4 ,0 In s u lin 2 8 ,3 3 0 ,0 3 0 ,0 3 0 ,0 2 0 ,0 2 0 ,0 4 0 ,0 -

-B Z 2 6 ,0 - - - 3 2 ,0 1 0 ,0 3 6 ,0 -

-G vH D 3 4 ,0 3 4 ,0 3 6 ,0 3 2 ,0 3 4 ,0 - - -

-T ie r

a b c

a:b U 0,05 a:c U 0,05

5 DISKUSSION

5.1 Vorversuche

5.1.1 Induktion des STZ-Diabetes

Ziel dieses Vorversuches war es, zu beweisen, dass durch eine Streptozotozin-Injektion ein stabiler, künstlicher Diabetes in der SCID-NOD-Maus erzeugt werden kann (Kap. 3.3.1). Die Induktion eines stabilen, künstlichen Diabetes ist für alle weiteren Versuche von essentieller Bedeutung, da nur in einem stabil diabetischen Tier der therapeutische Effekt einer Inseltransplantation glaubhaft demonstriert werden kann. Würde man Inseln in ein nicht stabil diabetisches Tier transplantieren, könnte im Nachhinein nicht ausgeschlossen werden, dass eine Normalisierung der Blutzuckerwerte nach der Transplantation von einer eventuellen Erholung des mauseigenen Pankreas stammt. Um zu beweisen, dass dies nicht der Fall ist, wurde SCID-NOD-Böcken STZ intraperitoneal injiziert. Dann wurden Blutzucker und Körpergewicht täglich gemessen. Die unter Kap. 4.1.1.1 und Kap. 4.1.1.2 dargestellten Ergebnisse demonstrieren, dass durch eine STZ-Injektion eine schwere diabetische Erkrankung induziert werden kann. Die Schwere der Erkrankung wird durch die hohen Blutzuckerwerte und massiven Gewichtsverluste widergespiegelt. Weiterhin wird deutlich, dass der induzierte STZ-Diabetes stabil bis zum Lebensende der Tiere etabliert werden kann.

Dieses wird daraus ersichtlich, dass keines der Tiere bis zu seinem Lebensende eine Normalisierung der Blutzuckerwerte oder des Körpergewichtes zeigte und alle Tiere im diabetischen Status verstarben. Eine spontane Erholung der mauseigenen Inselzellen kann somit ausgeschlossen werden. Auch andere Arbeitsgruppen konnten eine stabile Diabetesinduktion durch Streptozotozin in anderen Tiermodellen nachweisen (BELL u. HYE 1983; PESCHKE et al. 2000).

Bei Betrachtung des Blutzuckerverlaufes (Diagramm 2, S.90) fällt auf, dass der Blutzucker nicht sofort nach der STZ-Injektion ansteigt, sondern dieses erst nach einem Tag der Fall ist.

Danach erreicht er stabile, hohe Werte. Diese ca. eintägige Latenzzeit kann dadurch erklärt werden, dass die inseltoxischen Mechanismen des STZ (Kap. 2.8.4) eine gewisse Zeit

benötigen, um alle Inseln im Tier irreversibel zu zerstören. Weiterhin fällt auf, dass ein generelles Ansteigen der Blutzuckerwerte von der ersten bis zur zweiten Hälfte der diabetischen Phase beobachtet werden kann. Dieses könnte damit zusammenhängen, dass durch das STZ zwar der Großteil der mauseigenen Inseln sofort zerstört wird, einige murine Inseln jedoch nur soweit geschädigt werden, dass sie erst nach einiger Zeit ihre Funktion vollständig verlieren. Der Grund für das Erreichen konstanter hoher Blutzuckerwerte könnte in der Glukoseausscheidung über die Niere liegen. Würde die Niere nicht ab einem gewissen Grenzwert beginnen, Glukose auszuscheiden, würde der Blutzucker stets steigen.

Zuckeranflutung im Organismus und die Ausscheidung über die Niere halten sich vermutlich in der Zeit, in der sich der Zuckerspiegel stabil auf hohe Werte einstellt, die Waage. Dies erklärt auch, warum sich das Körpergewicht nach anfänglichen Verlusten auf konstant tiefe Werte einstellt. Die steigenden Blutzuckerwerte verhindern eine Nahrungsaufnahme der Maus, da ihrem Organismus zu viel Glukose zur Verfügung steht. Nach Erreichen der konstanten Phase spielt sich vermutlich ein Gleichgewicht zwischen Glukoseausscheidung und notwendiger, geringfügiger Nahrungsaufnahme ein. Das Tier hält nun ein konstantes, niedriges Gewicht.

5.1.2 Xenogene, porcine Inseltransplantation

Um zu demonstrieren, dass xenogene, porcine Inseln in der Lage sind, diabetische Erkrankungen in einer anderen Spezies zu therapieren, wurden porcine Inseln unter die Nierenkapseln von STZ-diabetischen Mäusen transplantiert und täglich Blutzucker und Körpergewicht gemessen. Weiterhin wurde die Präsens von porcinem Insulin in murinem Serum untersucht. Die unter Kap. 4.1.2.1, Kap. 4.1.2.2 und Kap. 4.1.4 dargestellten Ergebnisse demonstrieren, dass die diabetische Erkrankung einer anderen Spezies durch porcine, xenogene Inseltransplantation therapierbar ist. Die vollständige Genesung der ehemals schwer erkrankten Tiere wird anhand der Normalisierung des Blutzuckerspiegels, des Körpergewichtes und anhand des Nachweises porcinen Insulins im murinen Serum belegt.

Weiterhin kann geschlussfolgert werden, dass das porcine Inseltransplantat in der immundefizienten SCID-NOD-Maus im Sinne der Glukosestoffwechselregulation voll funktionstüchtig ist. Die volle Funktionstüchtigkeit beinhaltet dabei zwangsläufig die folgenden Mechanismen:

1.) Der Insulinrezeptor der porcinen Inseln erkennt Glukose. (Keine Beschädigung durch Verdauungsenzyme während der Inselisolation)

2.) Die Signalübermittlung innerhalb der porcinen Inseln ist intakt.

3.) Die Insulinproduktion und –sekretion sind intakt.

4.) Die murinen Effektororgane sprechen auf porcines Insulin an.

5.) Analoge Aussagen können auch für den Insulinantagonisten Glukagon gemacht werden.

Die Daten sind konform zu den Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen, die zeigen konnten, dass ein Überleben und Funktionieren xenogener Inseln in verschiedenen anderen Mausstämmen und Spezies möglich ist (RICORDI et al. 1988a; LANZA et al. 1991; AO et al. 1993;

GYSEMANS et al. 2000; WENNBERG et al. 2001; MACKENZIE et al. 2003). Zusätzlich hierzu stellt der Nachweis der Insulinsekretion nach Glukosestimulus (Tabelle 13, S.95, Kap.

4.1.4) einen direkten Nachweis der Glukoseresponsivität der porcinen Inseln dar. Da die basale Insulinsekretion der Inseln so niedrig ist, dass sie auch mittels ultrasensitiven ELISAs nicht nachgewiesen werden kann, muss vor der Messung eine Glukoseinjektion zwecks Sekretionsstimulation erfolgen. Damit die Vergleichbarkeit der Ergebnisse gewährleistet war, mussten die Tiere hierfür über Nacht fasten und erhielten dann eine identische Glukoseinjektion. Die Tatsache, dass porcines Insulin nach der Injektion als Antwort auf den Glukosestimulus nachweisbar ist, ist ein direkter Nachweis der Glukoseresponsitvität der porcinen Inseln.

Betrachtet man den Zuckerverlauf (Diagramm 3, S.92), so wird deutlich, dass der Blutzuckerspiegel nicht unmittelbar nach der Transplantation abfällt. Stattdessen kommt es innerhalb von drei bis vier Tagen zu einer allmählichen Blutzuckersenkung. Diese Latenzzeit kann dadurch erklärt werden, dass die frisch transplantierten Inseln noch nicht über einen Gefäßanschluss verfügen, über den Glukose zu den Inseln gelangen kann und über den Insulin in den Blutkreislauf abgegeben werden kann. Bis zur beginnenden Rekapillarisierung geschieht dies per Diffusion. Somit kommt es eben nicht zu einer schlagartigen Senkung des Blutzuckerspiegels nach der Transplantation, sondern zunächst zu einer allmählichen Senkung. Mit den konstanten, normoglykämischen Blutzuckerwerten gewinnen die Tiere wieder an Körpergewicht. Bedingt durch die nun funktionierende Blutzuckerregulation stellt sich das Körpergewicht wieder auf den Normwert ein.

5.1.3 Wiederauftreten des STZ-Diabetes nach Transplantatentfernung

Die Entfernung des Inseltransplantates soll demonstrieren, dass die porcinen Inseln nach der Transplantation die einzige insulinproduzierende Quelle in den Tieren darstellen. Obwohl schon unter Kap. 4.1.1 die Stabilität des STZ-Diabetes und damit die Zerstörung der murinen Inseln bewiesen wurde, kann durch eine Entfernung des Transplantates zusätzlich demonstriert werden, dass es auch dann nicht zu einer Erholung der murinen Inseln kommt, wenn eine andere insulinproduzierende Quelle im Tier existiert. Das xenogene Insulin könnte die mauseigenen Inseln entlastet und dadurch eine eventuelle Erholung begünstigt haben. Die Explantation von Inseltransplantaten wurde bereits von anderen Arbeitsgruppen als Beweis für die Einzigartigkeit einer Insulinquelle in Tiermodellen angewendet (RICORDI u. LACY 1987). Nach der Transplantatentfernung fällt das explantierte Tier wieder in einen stark diabetischen Zustand zurück. Das erneute Auftreten der schweren Hyperglykämie und der starken Gewichtsverluste geht mit völligem Fehlen porcinen Insulins einher. Die unter Kap.

4.1.1 bis Kap. 4.1.3 dargestellten Ergebnisse untermauern zum einen die Stabilität des STZ-Diabetes und zeigen zum anderen, dass für die Gesundung vom STZ-STZ-Diabetes allein die transplantierten, porcinen Inseln verantwortlich waren. Es wird deutlich, dass sich die mauseigenen Langerhans’schen Inseln auch innerhalb der “Ersatzsphase“ durch porcine Inseln nicht regenerieren. Blutzuckerregulierende Vorgänge innerhalb dieser Phase sind allein den porcinen Inseln zuzuschreiben. Diese Erkenntnis ist von Bedeutung für die Interpretation der Ergebnisse des Hauptversuches, da wir durch sie die Legitimation erhalten, sämtliche Veränderungen der im Hauptversuch untersuchten Parameter (Blutzuckerwert, GTT) direkt mit dem Zustand der transplantierten Inseln in Verbindung bringen zu können. Ein im Hauptversuch festgestellter Anstieg des Blutzuckers oder ein pathologischer Glukosetoleranztest lässt somit direkt auf eine Verschlechterung der Inselvitalität schließen.

Nach der Explantation (Diagramm 4, S.94) fällt auf, dass hier, bedingt durch den sofortigen Wegfall der Insulinquelle, der Blutzucker sofort ansteigt. Interessanterweise erreicht er hierbei jedoch deutlich höhere diabetische Werte als vor der Transplantation. Die Erklärung hierfür gibt Diagramm 2 (S.90). Auch dort werden höhere diabetische Werte in der zweiten Versuchshälfte beobachtet. Der erneute Körpergewichtsverlust nach Explantation erklärt sich so, wie unter Kap. 5.1.1 beschrieben.

5.1.4 Etablierung eines optimierten Rekonstitutionsprotokolls