Die hier vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung eines Tiermodells, an dem in-vivo die Abstoßung eines xenogenen, porcinen Inseltransplantates durch ein humanes
„Immunsystem“ untersucht werden kann. Die Arbeit wurde hierzu in zwei Versuchsphasen, die Vorversuchs- und die Hauptversuchsphase eingeteilt.
Die Vorversuchsphase diente der Klärung folgender Fragen als Basis für die Hauptversuchsphase:
1.) Ist ein durch Streptozotozin (STZ) induzierter Diabetes mellitus in der SCID-NOD-Maus konstant?
2.) Kann durch die Transplantation porciner Inseln eine Normalisierung des Blutzuckerspiegels in STZ-diabetischen SCID-NOD-Mäusen erreicht werden?
3.) Sind allein die transplantierten Inseln für die Normalisierung des Blutzuckerspiegels verantwortlich oder kommt es nach der Transplantation zu einer Regeneration der mauseigenen Inseln?
4.) Welches MNC-Rekonstitutionsprotokoll etabliert die höchsten Anteile funktionstüchtiger, humaner MNCs in der SCID-NOD-Maus und erreicht die höchste Rekonstitutionsrate?
5.) Ist die Zusammensetzung des humanen MNC-Transplantates in der hu-MNC-SCID-NOD-Maus mit der Zusammensetzung der MNCs im Menschen vergleichbar?
In der Hauptversuchsphase sollten drei Fragen geklärt werden, die über das Potential dieses Modells Auskunft geben.
1.) Werden porcine Langerhans’sche Inseln im hu-MNC-SCID-NOD-Mausmodell durch humane MNCs abgestoßen?
2.) Anhand welcher Parameter (Glukosetoleranz, Insulinmessung, Blutzuckermessung, Histologie) kann eine einsetzende Abstoßung im hu-MNC-SCID-NOD-Mausmodell identifiziert werden?
3.) Besitzt die inseltransplantierte hu-MNC-SCID-NOD-Maus das Potential für ein brauchbares in-vivo-Modell zur Untersuchung der humanen Abstoßungreaktion gegen porcine Langerhans’sche Inseln?
Folgende Erkenntnisse konnten erzielt werden:
In der Vorversuchsphase wurde deutlich, dass ein künstlicher Diabetes mittels Streptozotozin stabil in der SCID-NOD-Maus induziert werden kann (Kap. 5.1.1). Transplantierte, porcine Inseln können den erzeugten Diabetes in der SCID-NOD-Maus dauerhaft heilen und sind in der Lage den Zuckerstoffwechsel der Maus stabil zu regulieren (Kap. 5.1.2). Die transplantierten, porcinen Inseln stellen die einzige Insulinquelle dar (Kap. 5.1.3), sodass die im Hauptversuch zu untersuchenden Parameter direkte Rückschlüsse auf den Zustand der Inseln zulassen. Der mauseigene Pankreas erholt sich nicht. Des Weiteren können mit einem
modifizierten Rekonstitutionsprotokoll (RP-III) hohe Anteile funktionierender, humaner MNCs im Mausblut und in lymphatischen Organen (Milz) etabliert werden (Kap.5.1.4.1, 5.1.4.4 und 5.1.4.6). Die Zusammensetzung der humanen MNCs in der Milz der hu-MNC-SCID-NOD-Maus gleicht annähernd der des humanen Blutes (Kap. 5.1.4.7).
In der Hauptversuchsphase wurde deutlich, dass xenogen transplantierte, porcine Langerhans’sche Inseln in der hu-MNC-SCID-NOD-Maus von humanen MNCs abgestoßen werden. Als Parameter, die die Dokumentation der Abstoßung in diesem Modell zulassen, konnten identifiziert werden:
1.) Das Auftreten von pathologischer Glukosetoleranz (Kap. 5.2.1.1)
2.) Der Abfall der Insulinsekretion nach einem Glukosestimulus (Kap. 5.2.1.2) 3.) Der partielle Anstieg des Blutzuckerspiegels bei einigen Tieren (Kap. 5.2.1.3) 4.) Die Infiltration des porcinen Inseltransplantates mit humanen MNCs (Kap. 5.2.1.4)
Das hier vorgestellte inseltransplantierte und durch das RP-III rekonstituierte hu-MNC-SCID-NOD-Mausmodell besitzt das Potential für ein in-vivo-Modell zur Untersuchung der humanen, xenogenen Immunantwort gegen porcine Inseln (siehe Vorteile). Trotzdem weist dieses Modell noch einige Beschränkungen auf (siehe Nachteile). Weitere Verbesserungen sollten vorgenommen werden, um die Ergebnisse der Untersuchungen der Immunantwort gegen porcine Inseln möglichst umfassend auf den Menschen übertragbar zu machen. Der folgende Absatz gibt einen Überblick über die in dieser Studie aufgedeckten Vor- und Nachteile dieses Modells und schlägt Ansätze für ausstehende Verbesserungen vor.
Vorteile:
1.) Trotz Immundefekt erwiesen sich die Tiere bei geeigneter Haltung als robust gegen Infektionen und Erkrankungen und unkompliziert in der Handhabung (Erfahrungswerte, keine Daten präsentiert).
2.) Ein chemisch induzierter Diabetes kann mittels STZ stabil in der SCID-NOD-Maus induziert werden (Kap. 5.1.1).
3.) Die SCID-NOD-Maus akzeptiert aufgrund ihres Immundefektes bereitwillig xenogene Transplantate (porcine Inseln, humane MNCs) (Kap. 5.1.2, Kap. 5.1.4.1).
4.) Transplantierte, porcine Inseln sind in der Lage, den Zuckerstoffwechsel der Maus zu regulieren und dauerhaft eine stabile Normoglykämie zu erzeugen (Kap. 5.1.2).
5.) Untersuchungen von Glukosetoleranz, Insulinsekretion und Blutzucker lassen direkte Rückschlüsse auf den Zustand der transplantierten, porcinen Inseln zu (Kap. 5.2.1).
6.) Mit dem RP-III können hohe prozentuale Werte humaner MNCs im Mausblut und in lymphatischen Organen (Milz) etabliert werden. Antigen-präsentierende Vorgänge sind möglich (Kap. 5.1.4.2, Kap. 5.1.4.6).
7.) Mit dem RP-III werden frühzeitig hohe Rekonstitutionsraten erreicht (Kap. 5.1.4.3).
8.) In der mit dem RP-III rekonstituierten Maus werden humane IgG-Antikörper produziert.
Die Mechanismen zur Induktion der humanen Antikörperproduktion funktionieren in der hu–MNC-SCID-NOD-Maus (Kap. 5.1.4.5).
9.) Die Zusammensetzung der humanen MNC-Populationen in der murinen Milz entspricht nach Rekonstitution mit dem RP-III in etwa der des humanen Blutes (Kap. 5.1.4.7).
10.) Die mit dem RP-III transplantierten, humanen MNCs sind immunreaktiv. Sie sind in der Lage, porcine Inseltransplantate abzustoßen und eine GvHD hervorzurufen. Ag-Prozessierung, Ag-Präsentation, Ag-Erkennung, Co-Stimulation und die Effektormechanismen funktionieren demnach in der hu–MNC-SCID-NOD-Maus (Kap.
5.1.4.6 und Kap. 5.2.1.1 bis 5.2.1.4).
11.) Die akute Abstoßung der porcinen Inseln erfolgt aufgrund einer spezifischen Erkennung der Inseln (SHIROKI et al. 1994a). Sie findet vor dem eventuellen Einsetzen einer GvHD statt (Kap. 5.2.1.4, Kap. 5.2.2).
12.) Mittels GTT und Insulin-Elisa stehen sensitive Methoden zur Früherkennung der einsetzenden Abstoßung zur Verfügung (Kap. 5.2.1.1, Kap. 5.2.1.2).
Nachteile:
1.) Die Zusammensetzung der hu-MNC-Population im murinem Blut entspricht nicht der des humanen Blutes. Hier könnten Bedenken gegen die Übertragbarkeit der in hu-MNC-SCID-NOD-Modellen gewonnenen Erkenntnisse auf den Menschen geltend gemacht werden (Kap. 5.1.4.7).
2.) Es konnte nur bei einigen Tieren eine Blutzuckererhöhung festgestellt werden, von denen nur einige über 14 mmol/L anstiegen. Die 14 mmol/L Grenze konnten dabei nicht permanent überschritten werden (Kap. 5.2.1.3).
3.) Das Einsetzen einer gegen die Maus gerichteten GvHD limitiert bei diesem Modell die Zeit, in der unverfälschte Ergebnisse gewonnen werden können, auf ca. 40 bis 50 Tage.
Zur Zeit können nur akute Abstoßungsvorgänge untersucht werden (Kap. 5.2.2).
4.) Die Abwesenheit einiger humaner Zellen (Nk-Zellen, Makrophagen) in den Inseltransplantatinfiltrationen (Kap. 5.2.1.4) lässt vermuten, dass in der hu-MNC-SCID-NOD-Maus nicht alle Anteile des humanen Immunsystems an der Inselabstoßung beteiligt sind. Die Übertragbarkeit der Ergebnisse auf den Menschen ist somit kritisch abzuwägen.
Ausblick:
Nachfolgende Studien sollten darauf ausgelegt sein, obige Nachteile zu eliminieren. Zunächst sollte hierzu der Anteil humaner NK-Zellen und Makrophagen erhöht werden, um die in der Maus vorliegenden Gegebenheiten dem physiologischen humanen Vorbild anzupassen, aber auch um ihre Beteiligung an Antigenpräsentation und Effektorfunktionen zu erhöhen.
Dadurch könnte die Inselabstoßung, besonders hinsichtlich eines Blutzuckeranstiegs, wesentlich deutlicher zum Vorschein kommen. Durch wiederholte Gaben von NK-Zellen und Makrophagen nach Zellseparation und -anreicherung könnte dieses erreicht werden. Auch die Zugabe von NK-Zell- und Makrophagen- spezifischen Wachsstumstoffen zur zweitägigen MNC-Kultur, parallel zur T-Zell-Aktivierung mittels OKT3, könnte den Anteil dieser Zellen im peripheren Mausblut erhöhen. Eine mögliche Verbesserung bezüglich des unvollständigen Blutzuckeranstiegs wäre es, eine kleinere Inselzahl einhergehend mit einer größeren Zahl inselspezifisch aktivierter MNCs zu transplantieren. Es sollte daher versucht werden, die zur Wiederherstellung der Normoglykämie minimal nötige Inselzahl zu bestimmen. Dies kann durch Transplantation kleiner werdender Inselzahlen in STZ-diabetische SCID-NOD-Mäuse geschehen. Durch Transplantation einer minimalen Inselzahl wird verhindert, dass überschüssig transplantierte Inseln die ausgefallene Insulinsekretion der durch MNCs geschädigten Inseln kompensieren. Hiernach könnte durch Transplantation steigender MNC-Zahlen (inselspezifisch aktivierte MNCs) die MNC-Anzahl bestimmt werden, die bei allen
Tieren zu einem Blutzuckeranstieg führt. Die Transplantation größerer MNC-Zahlen kommt dabei auch der oben verlangten Erhöhung der NK-Zell-Anteile und Makrophagen-Anteile zugute. Des Weiteren sollte die Nutzungsdauer des Modells durch Hinauszögern der eventuell auftretenden GvHD verlängert werden. Indem der Anteil spezifisch gegen Inseln gerichteter MNCs bei der Rekonstitution erhöht wird, könnte eine potentiell auftretende GvHD hinausgezögert oder vollständig verhindert werden. Das OKT3 aktiviert in der MNC-Kultur alle vorhandenen T-Zellklone, also auch die, die gegen die Maus gerichtet sind. Von den so aktivierten T-Zellen ist nur ein sehr kleiner Anteil gegen die porcinen Inseln gerichtet. Der weitaus größere Anteil ist gegen die Maus gerichtet und verursacht die GvHD (TARY-LEHMANN et al. 1994). Würde in der MNC-Kultur nur inselspezifisches Antigen zur Aktivierung verwendet, könnten nur die hierfür spezifischen T-Zellklone proliferieren und die anderen gingen mit der Zeit zu Grunde. Würden diese spezifisch aktivierten T-Zellen in die Maus injiziert, wären alle MNCs gegen das Inseltransplantat gerichtet. Die GvHD würde ausbleiben und die Effektivität der MNCs, eine Inselabstoßung zu induzieren, wäre wesentlich gesteigert. Eine Kombination aller hier erwähnten Maßnahmen sollte zu einem manifesten Blutzuckeranstieg in der inseltransplantierten hu-MNC-SCID-NOD-Maus führen und damit schließlich ein wertvolles in-vivo-Modell für die humane, xenogene Inselabstoßung zur Verfügung stellen.
6 ZUSAMMENFASSUNG
Werner Stührenberg
Identifizierung der Abstoßungsparameter porciner Langerhans-Inseln im hu-MNC-SCID-NOD-Mausmodell
Die hier vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung eines Tiermodells, an dem in-vivo die Abstoßung eines xenogenen, porcinen Inseltransplantates durch ein humanes
„Immunsystem“ untersucht werden kann. Die Arbeit wurde hierzu in zwei Versuchsphasen, die Vorversuchsphase und die Hauptversuchsphase eingeteilt.
Die Vorversuchsphase diente der Klärung folgender Fragen als Basis für die Hauptversuchsphase:
1.) Ist ein durch Streptozotozin (STZ) induzierter Diabetes mellitus in der SCID-NOD-Maus konstant?
2.) Kann durch die Transplantation porciner Inseln eine Normalisierung des Blutzuckerspiegels in STZ-diabetischen SCID-NOD-Mäusen erreicht werden?
3.) Sind allein die transplantierten Inseln für die Normalisierung des Blutzuckerspiegels verantwortlich oder kommt es nach der Transplantation zu einer Regeneration der mauseigenen Inseln?
4.) Welches MNC-Rekonstitutionsprotokoll etabliert die höchsten Anteile funktionstüchtiger, humaner MNCs in der SCID-NOD-Maus und erreicht die höchste Rekonstitutionsrate?
5.) Ist die Zusammensetzung des humanen MNC-Transplantates in der hu-MNC-SCID-NOD-Maus mit der Zusammensetzung der MNCs im Menschen vergleichbar?
In der Hauptversuchsphase sollten drei Fragen geklärt werden, die über das Potential dieses Modells Auskunft geben.
1.) Werden porcine Langerhans’sche Inseln im hu-MNC-SCID-NOD-Mausmodell durch humane MNCs abgestoßen?
2.) Anhand welcher Parameter (Glukosetoleranz, Insulinmessung, Blutzuckermessung, Histologie) kann eine einsetzende Abstoßung im hu-MNC-SCID-NOD-Mausmodell identifiziert werden?
3.) Besitzt die inseltransplantierte hu-MNC-SCID-NOD-Maus das Potential für ein brauchbares in-vivo-Modell zur Untersuchung der humanen Abstoßungreaktion gegen porcine Langerhans’sche Inseln?
Folgende Erkenntnisse konnten erzielt werden:
In der Vorversuchsphase wurde deutlich, dass ein künstlicher Diabetes mittels Streptozotozin stabil in der SCID-NOD-Maus induziert werden kann (Kap. 5.1.1). Transplantierte, porcine Inseln können den erzeugten Diabetes in der SCID-NOD-Maus dauerhaft heilen und sind in der Lage den Zuckerstoffwechsel der Maus stabil zu regulieren (Kap. 5.1.2). Die transplantierten, porcinen Inseln stellen die einzige Insulinquelle dar (Kap. 5.1.3), sodass die im Hauptversuch zu untersuchenden Parameter direkte Rückschlüsse auf den Zustand der Inseln zulassen. Der mauseigene Pankreas erholt sich nicht. Des Weiteren können mit einem modifizierten Rekonstitutionsprotokoll (RP-III) hohe Anteile funktionierender, humaner MNCs im Mausblut und in lymphatischen Organen etabliert werden (Kap.5.1.4.1, 5.1.4.4 und 5.1.4.6). Die Zusammensetzung der humanen MNCs in der Milz der hu-MNC-SCID-NOD-Maus gleicht annähernd der des humanen Blutes (Kap. 5.1.4.7).
In der Hauptversuchsphase wurde deutlich, dass xenogen transplantierte, porcine Langerhans’sche Inseln in der hu-MNC-SCID-NOD-Maus von humanen MNCs abgestoßen werden. Als Parameter, die die Dokumentation der Abstoßung im hu-MNC-SCID-NOD-Mausmodell zulassen, konnten identifiziert werden:
1.) Das Auftreten von pathologischer Glukosetoleranz (Kap. 5.2.1.1)
2.) Der Abfall der Insulinsekretion nach einem Glukosestimulus (Kap. 5.2.1.2)
3.) Der partielle Anstieg des Blutzuckerspiegels bei einigen Tieren (Kap. 5.2.1.3) 4.) Die Infiltration des porcinen Inseltransplantates mit humanen MNCs (Kap. 5.2.1.4) Das hier vorgestellte inseltransplantierte und durch das RP-III rekonstituierte hu-MNC-SCID-NOD-Mausmodell besitzt damit das Potential für ein in-vivo-Modell zur Untersuchung der humanen, xenogenen Immunantwort gegen porcine Inseln (Kap. 5.3).
Innerhalb der Arbeit werden neben denVor–und Nachteilen dieses Modells Verbesserungen sowie ein Ausblick für zukünftige Anwendungen diskutiert.
7 SUMMARY
Werner Stührenberg
Identification of the rejection parameters of xenogenic transplanted islets of langerhans in the hu-MNC-SCID-NOD mouse model
This study is about the development of an animal model in which the rejection of xenogenic transplanted porcine islets by human immune cells can be examined in vivo. For this the study is divided into two experimental stages: the pre-experimental phase and the main experimental phase.
The pre-experimental phase is necessary to answer the following questions, which are the basis of the main experimental phase.
1.) Is the diabetes mellitus induced by Streptozotocin constant in the SCID-NOD-mouse?
2.) Are transplanted porcine islet able to heal the artificially induced diabetes?
3.) Are only the transplanted porcine islets responsible for the healing of the artificially induced diabetes.
4.) Which transplantation protocol is able to establish functioning human MNCs in the SCID-NOD-mouse best?
5.) Is the composition of humane MNCs in the hu-MNC-SCID-NOD-mouse comparable to the composition of MNCs in the human blood?
During the main experimental phase three questions which are essential for the development of the model are to be answered.
1.) Will porcine islets of langerhans be rejected by human MNCs in the hu-MNC-SCID-NOD mouse model?
2.) Which parameters enable us to identify the beginning of the rejection process?
3.) Is hu-MNC-SCID-NOD mouse model, in which the porcine islets are transplanted, a useful in vivo model for the examination of the rejection process of islets of langerhans?
The following insights could be gained:
In the pre-experimental phase it became clear that an artificial induced diabetes can be induced permanently in the SCID-NOD mouse with the help of STZ and that transplanted porcine islets can heal the induced diabetes permanently. They are also able to regulate the glucose metabolism of the mouse steadily. The transplanted porcine islets are the only insulin-producing source, so that the examined parameters can be used to draw conclusions about the islets status. The pancreas of the mouse does not recover its function. Furthermore high amounts of functioning human MNCs can be established in mouse blood and lymphoid organs by using a modified reconstitution protocol (RP-III). The composition of humane MNCs in the spleen of hu-MNC-SCID-NOD-mice is comparable to the composition of MNCs in the human blood.
In the main experimental phase it became clear that xenogen transplanted porcine islets of langerhans are rejected by human MNCs in the hu-MNC-SCID-NOD mouse. The following parameters, which document the beginning rejection process could be identified:
1.) The occurrence of pathologic glucose tolerance.
2.) The decrease of insulin secretion after provocative glucose stimulation 3.) The partial rise of blood glucose in some animals.
4.) The infiltration of the porcine islet transplant by human MNCs.
The hu-MNC-SCID-NOD mouse model, in which the porcine islets are transplanted and wich is reconstituted with the RP-III, may be considered as a useful in vivo model for the examination of the human xenogenic immune response against porcine islets.
Besides advantages and disadvantages of this animal model, suggestions for further improvements and also possible applications for the future are discussed within this study.
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