GESELLSCHAFT FÜR TOXIKOLOGISCHE UND FORENSISCHE CHEM IE
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T+K (1991) 5 8 (4-6) 7 7 — 140 Bd. 58 Nr. 4-6 Dezember 1991
MITTEILUNGSBLATT DER
GESELLSCHAFT FÜR TOXIKOLOGISCHE UND FORENSISCHE CHEM IE
Das Mitteilungsblatt erscheint in zwangloser Folge, im Schnitt sechs mal jährlich. Alle Mitglieder der GTFCh erhalten die Zeitschrift im Rahmen ihres Mitgliedsbeitrages.
® Schri f t leitung: Prof. Dr. Thomas Daldrup Vertr i e b: Geschäftsstelle der GTFCh I nstitut für Rechtsmedizin Karl Schm i d t
Heinrich-Heine-Universität Landgrab e n straße 74
Moorenstraße 5 D-6368 Bad V i l bel
D-4000 Düsseldorf 1
Inhaltsverzeichnis
U D e m m e : K o m m e n t a r z u r
V or w o r t 78 S tanda r d m e t h o d e 1 : E x t r a k t i o n 1 15
R D en k , I R a f f , H . Sa c h s : W A r n o l d :
Unt e r s u c h u n g v o n Ko p f h a a r en 79 N ach l e s e : A N A K O N 1 9 9 1 122 M E r d w e g , M H o f f m a n n : W. A r n o l d :
Nachw e i s v o n Co c a i n 84 Nach l e s e : T I A FT 1 9 9 1 126
I l l I L I L I I I I J I I L L I l I J J I I I J I I J L I I I L t L L
h h h h h n n h h n h h h h h h h h h h n h n n n h h h h h h h h h h h
H .H . M a u r e r , M Ru pp , A We b e r : - LFortbildu n g s v e r a n s t a l t u n g d e r
W orkshop 91: Extraktio n 9 1 -LGTFCh 1 9 9 2 : Pr o g r a m m 1 3 1 -'
t I • I • t • • t • • I • t L t J J • J J J • J J J L • t L • L • t n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n
P . MuQhoff, Th. Daldrup : H.J. B a t t i s t a : 5 . S e m i n a r f ü r
W orksho p 9 1 : Be n z o d i a z e p i n e Toxikologie: Luftschadstoffe 132
G . S c h m i t t , R . A d e r j a n : Personalia: Stellengesuche, Foren-
Worksho p 9 1 : Co c a i n 98 s ischer Toxikologe, Berufungen 1 3 4
G. Möschwitzer, U. Demme, H. Personalia: Neue Mitglieder,
König: Standardmethoden 106 Aus t r i t t e , No t i z e n 1 3 4 , 1 3 6 U D e m m e , G . M ö schwitzer, H.J. M. Brinkhoff: Buchbesprechung 1 3 7 Bir k h a hn , R . Sc h o l z : S t an d a r d -
methode 1 : Extraktion 108 C . H e l l e r : B uc h b e s p r e c h u n g 139
> z e r g i ~ g u n g ei e r G T F C h = P r o f N R N 5 1 1 e r , G T F C h — P o s t g i r o a m t
5 ga cL r ( gZ Z 5 9 O 1 O O 6 6 ) = K o n t o n u m m e r = 2 5 7 5 4 — 6 6 9
78 T +K ( 1 9 9 1 ) 5 8 ( 4 - 6 ) : 7 8
V or w o r t
D as l a n g e r w a r t e t e n e u e T + K - H e f t l i e g t n n u n e n d l i c h v o r . E s is t d a s l e t z t e H e f t f ü r d a s J a h r i 9 9 1 - i s t e in b e s o n d e r s s eite n s t a r k e s H e f t g e w o r d e n , w e l c h e s ,
e in e g a n z e
R eih e i n t e r e s s a n t e r B e i t r ä g e e n t h ä l t -
I m ne ue n J a h r i s t b e a b s i c h t i g t , d a s E r s c h e i n u n g s »i l d v o n T + K o ptisc h z u v e r b e s s e r n . H e r r S a c h s a u s U l m h a t s i c h a n gh a n e b o t e n d as L a y o u t a l l e r A r t i k e l m i t H i l f e m o d e r n e r T e x t g e s g p
g ramme n u n d - g e r ä t e n z u ü b e r a r b e i t e n . H i e r f ü r b e n ö t i g t v ers t ä n d l i c h d e n a u f D i s k e t t e g e s p e i c h e r t e n B e i t r a g .
d esh a] b s c h o n j e t z t b i t t e n , i n Z u k u n f t, den d r u c k f e r t i g e n
u nd — f a l l s v o r h a n d e n — d i e z u g e h ö r i g e D i s k e t t e m i t A n g a b e n ü b e r d ie b e n u t z t e S o f t w a r e a n d i e S c h r i f t l e i t u n g z u s c h i c k e n -
S achs h a t h i e r z u " H i n w e i s e a n d i e A u t o r e n " , d i e a u f d e r Seite d i e s e s H e f t e s a b g e d r u c k t s i n d , f o r m u l i e r t - N i e
k el i n T + K d a n n i n Z u k u n f t a u s s e h e n s o l l e n , z e i g t d e r i n d i e s e m H eft a b g e d r u c k t e B e i t r a g v o n H e r r n S a c h s u n d s e i n e n
M ita r b e i t e r n .
I ch m ö c h t e e s n i c h t v e r s ä u m e n , a l l e n L e s e r n d e s M i t t e i l u n g s b l a t - t es u n s e r e r G e s e l l s c h a f t e i n e r f o l g r e i c h e s J a h r 1 9 9 2 z u
w üns c h e n . I h r
T homas D a l d r u p
N EUERSCHE I N U N G S ympo s i u m s b a n d
Beiträge zur
Toxikologiscl>er> C1>eriiie
l. Ges'>m<deutsches Symposium 3. -5. Juli 1990
Leilizig
Erhä l t l i c h z u m P r e i s v o n D M 2 0 , — be i d e r G e s c h ä f t s s t. 11
s s e l l e
79 T +K ( 1 9 9 1 ) 5 8 ( 4 - 6 ) : 7 9
Qualitätssicherung bei der Untersuchung von Kopfhaaren zum Nachweis von Hetäubungsmitteln
R. Denk, I. Raff und H. Sachs, Ulm
Institut für Rechtsmedizin der Universität Ulm, Prittwitzstr.6, W-7900 Ulm/Donau, Bundesrepublik Deutschland
Eingegangen 3. November 1991
Einleitung
Der Ausschuß der GTFCh zur Erarbeitung von Richtlinien für die Qualitätskontrolle hat allgemeine Richtlinien, betreffend Personal, technischer Ausrüstung, Verfahrensweisen und Protokollierung, für die Qualitätskontrolle erstellt, die am 20.04.91 beschlossen wurden [1].
Bei der Haaranalytik, zum Nachweis von Betäubungsmitteln, ergeben sich Besonderheiten, die über diese Richtlinien hinausgehen.
Um grundsätzlich die Aussagekraft der Haaranalyse sicherzustellen sind e inige Maßnahmen notwendig, deren Beachtung es erst erlaubt di e Möglichkeiten dieser Technik auszuschöpfen. So ist eine Kontrolle der c hemisch-toxikologischen U ntersuchung durch d e n G e b r auch v o n gespikten Proben, ähnlich dem Kontrollserum oder dem Kontrollurin, d en die G T F C h a n bietet, nicht ausreichend. Daher is t f ü r d i e s e Probenart ein anderes Konzept der K ontrolle zu w ählen, das hier beschrieben werden soll. Zunächst soll jedoch auf die Probennahme und Fehler, die bei ihr gemacht werden, eingegangen werden. Ein noch so ausgeklügeltes Kontrollsystem des Analysenweges ist sinnlos, wenn s chon bei d e r P r o b ennahme Fehler gemacht w erden. Selbst d a s g enaueste A n a lysenverfahren k a n n s o l ch e F e h l er , n i c h t m e h r ausgleichen.
I. Probennahme:
Die häufigsten Mängel, die nach unserer Erfahrung auftreten, und deren Auswirkungen seien im folgenden kurz angesprochen.
1. Zu geringe Probenmengen:
Es werden Proben eingesandt, die insgesamt nur aus 5 - 10 einzelnen Haaren bestehen.
Diese Probenmenge ist fur die Beantwortung forensisch-toxikologischer pragestellungen nicht ausreichend.
80
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2. In sich verschobene oder schräg abgeschnittene Haarstränge '
die Beurteilung des Aufnahmezeitpunktes ist es em Unters"nterschied, ob die Probe bgeschnitten wurde oder ob sie sich nachträglich verschoberschoben hat. Dieser sehr äWig beobachtete Fehler schränkt die Beurteilungsmöglichkeit' » ei t d e r Z e i t r äume, in denen Betaubungsmittel aufgenommen wurden, ein.
3. Unvollständige Dokumentation:
P roben, bei denen eine eindeutige Zuordnung zu Personen nie™ g" c h i s t "
s elbstverständlich keine Aussagekraft. Dieser Fehler kommt seltener vor Hä u ig« ' s t das Fehlen der Bezeichnung von kopfnaher Schnittstelle und Haarspitze. Ebenso fehlt oft die Dokumentation der I.änge der an der Kopfhaut verbliebenen Haarstoppe>
Die angeführten Fehler wirken sich auf die Sicherheit der Beurteilung aus bzw. sie schränken die Möglichkeiten der Beurteilung ein und führen dadurch zu einem Informationsverlust.
D ie r i c h t ig e P r o b ennahme i s t in folg e n de n R e g e l n zusammengefasst:
1. Die Probennahme, das Verpacken und Versenden dürfen nicht in der Nähe von Rauschmittelasservaten stattfinden und der Probenentnehmende sollte sichergehen, daß er vor der Probennahme nicht in Kontakt mit diesen war.
2. Die Entnahme erfolgt, um vergleichbare Ergebnisse zu erhalten, primär über dem Hinterhauptshöcker des Probanden. Ist dies nicht möglich, muß die Entnahmestelle entsprechend dokumentiert werden.
3. Die zu asservierende Probe sollte ein mindestens bleistift- bis kleinfingerdicker Strang sein.
4 . Die Haare werden vor dem A b schneiden mit einem festen Bindfaden 2 3 cm v o n der Kopfhaut entfernt, fest zusammengebunden. Sollten die Haare zu kurz seinl
auf diese Manahme verzichtet werden.
5. Die zusammengebundenen Haare sind direkt an der Kopfhaut abzuschneiden Sollte dies nicht möglich sein, muß die Länge der zurückgebliebenen Haarreste dok a arres e o u m e n t i e r tt t werden.
6. Bei der Entnahme ist besonders darauf zu achten, da sich die entno'e entnommenen Haare nicht ineinander verschieben.
7. Die entnommene Haarprobe ist fest in Alumlnlumfolie e~zgzollenmzuro en und mit Tesafilm B .elbogen zu f i er e n . D i e P r o b enbeschriftung mi t P b nk
g mi t rob e n k ennung, B ' h ung von kopfnahem Ende und Haarspitze, sowie Angaben b d' L-
ga en e r di e L änge der bh b nen Haarstoppeln ist auf dem Briefbogen zu verme ken.
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Wie eine solche Probe aussehen sollte, ist i n A b b i ldung 1 dargestellt.
Abb. 1: Schematische Darstellung einer korrekt asservierten Haarprobe
Kopfhaarprobe
Haarwurzel oder kopfnahes Ende Name '.
Geburtsdatum '.
Entnahmedatum . Entnahmestelle . Kenn-nummer '.
Bindfaden oder Tesafilm
Schnur
Haarspltze Verbliebene Haarstoppeln. . . . [mm]
In den meisten Fällen entzieht sich die Asservierung der Haare d er K o n t r oll e d e s A na l y t ikers. S i e wi r d ha u p t sächlich v o n Polizeibeamten oder Ä r z te n d u rchgeführt. D eshalb m üssen d i ese Personen e n t s prechend in f o r mier t we r d en , um die oben angesprochenen Fehler zu vermeiden.
II. Chemisch-toxikologische Untersuchung
Die Z uverlässigkeit und P räzision der U n t ersuchung einer korrekt asservierten Haarprobe muß ebenfalls abgesichert werden.
II.I. Probenannahme und Lagerung
Der erste Schritt, nachdem die Probe das Labor erreicht hat, ist
das Auspacken, Erfassen und L agern der P r obe. Di es muß s t r i k t
getrennt von anderen Asservaten erfolgen. Die Lagerung der Proben
sollte in verschließbaren Kunststoffbeuteln erfolgen. Ein Tiefgefrieren
der Proben ist wegen der Stabilität der zu suchenden Wirkstoffe nicht
unbedingt erforderlich.
82 T +K ( 1 9 9 1 ) 5 8 ( 4 - 6 ) : 8 2
II.II. Kontrolle des Analysenganges
öglichkeiten der K o n trolle des A nalysenganges s' e s sind d i e V erwendung eines Standardreferenzmaterials oder die ~ e p ~
V erfahren mittels der Tracertechnik. Der einfachere und billigere eg ist der Einsatz eines Standardreferenzmaterials. Unter einem solchen Material versteht man eine wirkstoffhaltige Matrix, in der die Wirkstof«
in ihr e r natü r l i chen Fo r m und in ihren natür l i c h en B indungsverhältnissen vorliegen. Der W i rkstoffgehalt dieser M a t r i
uß dann sehr sorgfältig durch verschiedene Verfahren bestimmt werden. Schließlich müssen diese Werte noch durch eine Institution anerkannt werd e n [2,3 ] . D ie Vorst u f e zu ei nem S tandardreferenzmaterial is t n o r malerweise die H e r stellung e i n es sogenannten Pools aus der wirkstoffhaltigen Matrix. Hierfür lassen sich die K o p f haare e i nes a n e i n e r Ü b e r dosis H e r oi n v e r storbenen Abhängigen verwenden.
N ormalerweise ist die H ers t e l lun g von sol ch e n Standardreferenzmaterialien sehr aufwendig. Wir haben, weil uns nur w enig Haare zur V e rfügung standen, eine sehr einfache Form d e r Aufbereitung gewählt.
Die Herstellung des Haarpools wurde wie folgt durchgeführt:
D ie H aa r e wur d e n mit Acet o n , M et h a n o l und demineralisiertem W a sser g e waschen un d b e i Ra u m t e mperatur getrocknet. U m den Wirk s t off , s o wi e e v e n tuell vo r h a ndene Bindungsverhältnisse zu schonen, wurden Portionen von etwa 5QQ mg in mehrfach mit einer Stahlkugelmühle gemahlen. Das Haarmehl wurde d ann i n e i n e m B e cherglas gesammelt, zwei T age d u rc h R ü h r e n h omogenisiert un d i n e i n e m v erschließbaren Gefäß gelagert. D i e Gehalte an M o rphin, Codein und Dihydrocodein wurden nach dem A uflsen i n N a t r onlauge mit a nschließender saurer H y d r olyse u n d zweimaliger Extraktion, gaschromatographisch — massenspektrometrisch gegen Ethylmorphin als internem Standard gemessen [4,5].
In dem von uns hergestellten Pool wurden folgende Gehalte und Standardabweichungen aus 7 Auibereitungen ermittelt (t abelle y]
Tab. 1:
Morphin: 687 +- 67 ng/g
Codein: 29/ +-20 ng/g
Dihydroco dein 638 +- 80 ng/g
83 T +K ( 1 9 9 1 ) 5 8 ( 4 - 6 ) : 8 3
Eine in der beschriebenen Weise hergestellte Menge von ca. 30 g Haarmehl ist zu r A b s icherung von H aaranalysen bei etwa 6 00
Untersuchungs tagen ausreichend.
Ausblick:
Forensische Fragen, die durch die Anwendung der Haaranalyse beantwortet w e rden k ö n nen, h aben i n j ü n g ster Z e i t e r h e blich zugenommen. Es sollte deshalb möglichst frühzeitig damit begonnen werden, die verwendeten Analyseverfahren auf ihre Genauigkeit und Z uverlässigkeit h i n zu übe r p r üfen. D a die H er s t ellung v o n Referenzmaterialien, bedingt durch die hohen Anforderungen an ein solches Material nu r m i t e i n e r e n tsprechend großen H aarmenge l ohnend ist, müssen weiter w i rkstoffhaltige Haare gesammelt un d entsprechend aufbereitet werden.
Literatur:
1. Aderjan R, Daldrup T, Harzer K, Heller C, Kauert G, Maurer H, Müller M, Müller E, Raudonat H, Rösener H, Rübsamen K, Schmidt K, Schmitt G, Schmoldt A, Wennig R (1991) Laborrichtlinien für chemisch-toxikologische Untersuchungen. Toxichem + Krimtech 58 (3): 43 — 47
2. Beegly HF, Mears TW, Michaelis RE, Wilson JN (1975) Treatise on Analytical Chemistry, Editoren Kolthoff I.M., Elving P J., Stross F.H., John Wiley A. Sons New York Volume 3: 2-43
3. United States Department of Commerce (1976) Catalog and Price list of
Standardmaterials issued by the National Bureau of Standards. Mise. Publ. 260 and its semiannual supplements Washington D.C. Government Printing Office
4. Sachs H, Arnold W (1989) Results of Comperative Determination of Morphine in Human Hair Using RIA and GC/MS. Clin Chem Clin Biochem 27: 873-877
5. Sachs H, Brunner U (1986) Gaschromat.ographisch-massenspektrometrische
Befunde von Morphin und Codein in Glaskörperflüssigkeit und Haaren. Beitr Gerichtl Med 44: 281-288 (1986)
p+g ( 1991 ) 5 8 ( 4-6 ): 84
Z um Nachweis v o n C o c a i n
Martin Er d w e g u n d M . H o f f m a n n
Institut für Hygiene und Laboratoriumsmedizin S tädtische K r a n k e n a n s t a l te n W -4 1 5 0 K r e f e l d
C ocain ( A b b .].),ein A ] k a].oid da s a u s d e n B l ä t t e r n d e s C o c a s t r a u c h e s
" Ery t h r o x v ].um c o c a " d u r c h V e r e s t e r u n g m i t M e t h a n o l u n d B e n z o v l i e - r un g z u g e w i n n e n i s t , w u r d e v o r d e r E n t w i c k l u n g s y n t h e t i s c h e r A n ä s - t he t i k a a l s w i r k s a m e s L o k a l a n ä s t h e t i k u m v e r w e n d e t
A b b . l S t r u k t u r f o r m e l v o n C o c a i n
CHg A u f Gr un d d e r p o t e n t i e l l e n s u c h t e r z e u g e n d e n
N COOCHg E i g e n s c h a f t e n z ä h l t C o c a i n h e u t e z u d e n a m
-H h ä u f i g s t e n v e r w e n d e t e n D r o g e n . D i e s w i r d d u r c h d i e s t e i g e n d e Z a h l p o s i t i v e r E r g e b n i s s e b e i d er U n t e r s u c h u n g a u f C o c a i n b e l e g t . Über d i e V e r f a h r e n z u r r o u t i n e m ä ß i g e n U n t e r s u c h u n g v o n
0 U r i n p r o b e n a u f C o c a i n u n d s e i n e r M e t a b o l i t e n (~ . ~ - )-c o c ain
s ol l i m f o l g e n d e n b e r i c h t e t w e r d e n .
M a t e r i a l u n d M e t h o d e n
Z ur D u r c h f ü h r u n g d e r q u a l i t a t i v e n u n d q u a n t i t a t i v e n A n a l v s e n s t e h e n e in e R e i h e v o n U n t e r s u c h u n g s v e r f a h r e n z u r V e r f ü g u n g , d a z u z ä h l e n d i e F luore s z e n z p o l a r i s a t i o n ( F P I A ) u n d d i e H o c h l e i s t u n g s f l ü s s i g k e i t s - c h r o m a t o g r a p h i e ( HP L C ) .
F PI A
P o l a r i s i e r t e s L i c h t , d a s a l t e r n i e r e n d h o r i z o n t a l u n d v e r t j k a ] i n z we i E b e n e n s c h w i n g t , wir d v o n e i n e m F l u o r o p h o r , z . B . F l u o r e s z e i n , a b -
s o r b i e r t . D a s a b s o r b i e r t e L i c h t w i r d b e i e i n e r a n d e r e n
em i t t i e r t, und n a c h D u r c h t r i t t . d u r c h e i n P o l a r i s a t i o n f ' l ta n e r e n e e n ä n g e i sa i o n s i t e r g e m e s - s en , D i e E i g e n r o t a t i o n d e s F l u o r o p h o r s f ü h r t z u e i n e D l
z u e i n e r D e p o l a r i s i e - r un g d e s a b s o r b i e r t e n L i c h t s . Du r c h d i e B i n d u n g a n ' M l 1 1
a n e i n M a k r o m o l e k ü l ( z.B , A n t i k ö r p e r ) w i r d d i e R o t a t i o n d e s F l u o r o p h o r s g h d P 1 r i s at,ions g r a d n i m m t z u . D a h e r i s t , di e K o n z e n t r a t i o o ro p o r s g e h e m m t ,d e r P o l a -f
e n r a i o n a n f r e i em F l u o - r op h o r u m g e k e h r t p r o p o r t i o n a l z u m g e m e s s e n e n p o l a
T e s t a n s a t z w e r d e n e i n f l u o r e s z e n z m a r k i e r t e r A n a le n o a r i s a t i o n s g r a d . I m k ü l ) , u n m a r k i e r t e r A n a l y t d e r P r o b e u n d A n t i k ö r pe r n a y t ( T r a c e r - Mo l e -
i ör p e r , d e r i m U n t . e r s c h u ß v o r l i e g t , gem i s c h t . Tra c e r u n d A n a l v t , de r P r o b e
B indu n g s p o s i t i o n e n a m A n t i k ö r p e r . N a c h e i n e r v o r g ge k o n k u r r i e r e n u m d i e t i o n s z e i t w i r d d e r P o l a r i s a t i o n s g r a d g e m e s s e n . M i t t e ] s T e s t l ö s u n -e r v o r g e g e b e n e n i n k u b a - g en ,die e i n e n d e f i n i e r t e n G e h a l t a n A n a l y t e n a u f l
K alib r a t z o n s k u r v e n e r s t e l l e n , d i e d i e D r o g e n u n t ee n a u we i s e n , l a s s e n s i c h d ächt i ge n P r o b e e r m ö g l i c h e n . Coca i n , B e n z o y l e c g o n ie nun e r s u c h u n g d e r v e r - l ester w e r d e n m i t d e r b e s c h r i e b e n e n M e t h d e o e q u a n t s t a t i vt '
p a r a m e t e r e r f a ß t . e ' t iv a l s S u m m e n -
85
T +K ( 1 9 9 1 ) 5 8 ( 4 - 6 ) : 8 5
HPLC
E xtr a k t i o n s v e r f a h r e n
Z ur B e s t ä t i g u n g d e r m i t t e l s F P I A e r s t e l l t e n R e s u l t a t e w i r d e i n A l i - a uot d e r z u u n t e r s u c h e n d e n P r o b e , i n d e r R e g e l U r i n , f ü r d i e C o c a i n - b e s t i m m u n g m i t D i c h l o r m e t h a n e x t r a h i e r t u n d a n s c h l i e ß e n d m i t t e l s H PL C a n a l y s i e r t . B e i d e r E x t r a k t i o n k a n n d i e M e t h o d e d e r f l ü s s i g -
f lüssi g E x t r a k t i o n a n g e w a n d t w e r d e n, altern a t i v i s t a u c h e i n V o r g e - h en n a c h d e r M e t h o d e d e r F e s t p h a s e n e x t r a k t i o n ,s i e h e u n t e n , m ö g l i c h .
F lüs s i g - f l ü s s i g E x t r a k t i o n
5 m l d e r U r i n p r o b e w e r d e n m i t 1 0 m l D i c h l o r m e t h a n v e r s e t z t .
N ac h i n t e n s i v e m R ü h r e n f ü r 1 0 M i n u t e n w i r d d i e o r g a n i s c h e P h a s e a b - g et r e n n t u n d a m R o t a t i o n s v e r d a m p f e r u n t e r A n l e g e n v o n V a k u u m b i s z ur T r o c k n e e i n g e e n g t . D i e P r o b e w i r d f ü r d i e H P L C i n e i n e m d e f i - n i e r t e n V o l u m e n S t a r t p u f f e r a u f g e n o m m e n u n d d a n n ü b e r e i n e P r o b e n - s chle i f e i n j i z i e r t .
F es t p h a s e n e x t r a k t i o n
E in e m i t , O c t a d e c y l - C 1 8 g e f ü l l t e E x t r a k t i o n s s ä u l e w i r d v o r d e r P r o - b en a u f g a b e z u e r s t m i t M e t h a n o l u n d a n s c h l i e ß e n d m i t W a s s e r g e -
s pült . D i e U r i n p r o b e w i r d a u f d i e S ä u l e g e g e b e n u n d d u r c h A n l e g e n e ines l e i c h t g r a d i g e n V a k u u m s d u r c h d i e S ä u l e g e s a u g t . D e r n a c h f o l - g ende W a s c h s c h r i t t e n t f e r n t z u m g r ö ß t e n T e i l d i e s t ö r e n d e n B e g l e i t - s ubst a n z e n . D i e L u f t t r o c k n u n g d e s S ä u l e n i n h a l t s e r f o l g t d u r c h e r n e u - t es A n l e g e n v o n V a k u u m f ü r e t w a 1 0 - 1 5 M i n u t e n . D an n w e r d e n d i e a u f d er E x t r a k t i o n s s ä u l e b e f i n d l i c h e n S u b s t a n z e n m i t M e t h a n o l e l u - i er t . D i e g e w o n n e n e o r g a n i s c h e P h a s e w i r d b i s z u r T r o c k n e e i n g e - e n g t , d e r R ü c k s t a n d k u r z v o r d e r I nj e k t i o n i n S t a r t p u f f e r a u f g e n o m - m en u n d d a n n m i t H P L C a n a l y s i e r t .
HPLC - A n a l y s e
D ie H P L C - A n a l y s e n l a s s e n s i c h i n e i n e m i s o k r a t i s c h e n A r b e i t s g a n g d u r c h f ü h r e n . A l s E l u t i o n s p u f f e r d i e n t e i n G e m i s c h a u s 1 5 X A c e t o n i - t r' l u n d 8 5 X P h o s p h a t p u f f e r m i t e i n e m p H - W e r t v o n 2 ,3 ,d a s m i t e i ne r k o n s t a n t e n F l u ß r a t e v o n 1 m l / m i n ü b e r d i e A n a l y s e n s ä u l e g e - p ump t w i r d . D i e T r e n n s ä u l e m i t e i n e r L ä n g e v o n 2 5 0 m m u n d e i n e m I n - n en d u r c h m e s s e r v o n 4 ,6 m m i s t g e f ü l l t m i t R P - 1 8 — Mat e r i a l d e r P a r t i -
k el g r ö ß e 1 0 p m .E i n e v o r g e s c h a l t e t e K a r t u s c h e e b e n f a l l s m i t R P - 1 8 - M a t e r i a l g e f ü l l t , r e d u z i e r t d i e B e l a s t u n g d e r H a u p t s ä u l e d u r c h s t ö -
r end e V e r u n r e i n i g u n g e n . E i n S ä u l e n o f e n m i t U m l u f t t h e r m o s t a t , i n d e m a uc h d a s P r o b e n a u f g a b e v e n t i l i n t e g r i e r t i s t , s o r g t f ü r e i n e k o n s t a n - t e S ä u l e n t e m p e r a t u r v o n 4 0 C u n d b e w i r k t g l e i c h z e i t i g d i e V o r t e m - p er i e r u n g d e s E l u e n t e n s t r o m e s . D i e A b b . 2 , s i e h e u n t e n , zeigt d a s t y - p isch e C h r o m a t o g r a m m e i n e r C o c a i n a n a l y s e .
E r g e b n i s s e
Q ua l i t ä t s k o n t r o l l e
D ie Ü b e r p r ü f u n g d e r A n a l y s e n r e s u l t a t e , d i e m i t H i l f e d e r F P I A - M e t h o - d e e r s t e l l t w u r d e n , erfol gt e m i t t e l s z w e i K o n t r o l l l ö s u n g e n . B e i d e
K ont r o l l p r o b e n w i e s e n e i n e g l e i c h a r t i g e M a t r i x w i e d a s z u a n a l y s i e - r ende P r o b e n m a t e r i a l a u f .
( 1991 ) 5 8 ( 4 6 ) : 8 6
86
b m it n i e d r i g e m C o c a i n g e h a l t Z ur K o n t r o l l e d e r M e ß w e r « » n r o ] m l H u m a n - d ze n t e e r .ne L o s u n g v o n 0 ) 5 P g • • l e c g o n i n k o n z e n t r a t i o n u r in E in e z w e i t e K o n t r o l le „ d . P b e n m j t h ö h e r e m D r o v on 3, 0 pg pr o 1 m l H u m a n ur in wur e ' w u rd e a n H a n d d i e - g en g e h a l t e i n g e s e t z t . D i e P r ä z i s i o n d e r S e r z e wu r
s er b e i d e n T e s t l ö s u n g e n ü b e r p r ü f t
e s t e l l t • D ie g e m e s s e n e n W e r t e s i n d i n
T a b . l F P I A - M e s s u n g e n i n d e r S e r i e K on z e n t r a t i o n s a n g a b e n i n p g /
P r ä z i s i o n i n d e r S e r i e
K on t r o l l e L K on t r o l l e H
0 , 4 3 3 , 1 6
0 , 4 7 3 2 2
0 , 4 3 3 , 1 9
0 , 4 8 3 ) 0 1
0 , 4 3 2 ) 9 7
0 , 4 8 3 ) 0 5
0 , 4 4 3 ) 1 1
0 ) 4 7 2 , 9 9
0 , 4 3 2 , 9 7
0 , 4 5 3 ) 2 7
z = 0 , 4 5 1 x = 3 , 0 9 4
s = 0 , 0 2 0 7 s = 0 , 1 0 5 4 V K = 4 ) 5 9 2 X V K = 3 , 4 0 8
F ür d i e L ö s u n g m i t d e m n i e d r i g e n D r o g e n j n h
n in a t v o n Q , 5 p g B e n z o y l e c - g oni n p r o 1 m l H u m a n u r i n w u r d e a u s
t io n s k o e f f izien t v o n 4 , 13 y e r r e c h n et s e n e i n V a r i a - D ie A u s w e r t u n g d e r A n a l y s e n r e i h e f ü r
e re n K o n z e n t r a t i o n v o n 3 0 o n t r o l l p r o b e m i t d e r h ö - r ia t i o n s k o e f f i z i e n t e n v o n 3 , 13 a n u r i n e r g a b e i n e n V a -
p g pro 1 m l H u m a n u r i n
D ie t ä g l i c h e K o n t r o l l e f ü r d i e F P I A e r f o l g t
v ers c h i e d e n e n L ö s u n g e n v o n B e n z o y l e cg o n i n u n d e n f a l l s m i t zw e i D ie L o w - K o n t r o l l e w a r a u f 0 5 P g / l u m a n u r i n .
d ie H i g h - K o n t r o l l e e n t h i e l t 3 0 y l e c g o n i n e i n g e st e l l t , -
) B enz o l e
P g / m l B e n z o l e
I n T a b . 2 s i n d d i e M e ß w e r t e , d i e a n 2 p e c g o n i n .
a uf ei n a
e rst e l l t w u r d e n , aufge f ü h r t . n an d e r f o l g e n d e n T a g e n
87 T +K ( 1 9 9 1 ) 5 8 ( 4 - 6 ) : 8 7
T a b . 2 T ä g l i c h e n M e s s u n g e n , M i t t e l w e r t e , S t a n d a r d a b w e i c h u n g e n u n d V a - r i a t i o n s k o e f f i z i e n t e n d e r F P I A — K o n z e n t r a t i o n s a n g a b e n i n p g / m l
K on t r o l l e n v o n T a g z u T a g K on t r o l l e L K on t r o l l e H
0 ) 4 6 2 , 9 4
0 , 4 4 2 , 8 0
0 , 4 8 2 , 8 4
0 ) 4 8 3 , 2 1
0 , 4 6 3 ) 0 5
0 ) 4 9 3 , 2 4
0 , 5 1 3 ) 3 2
0 ) 4 7 3 ) 0 1
0 , 5 0 3 ) 3 4
0 , 4 9 2 ) 8 7
0 ) 4 8 3 , 2 5
0 , 5 3 2 , 9 9
0 ) 4 3 3 , 0 8
0 ) 4 8 3 ) 0 1
0 ) 4 7 3 , 0 1
0 ) 4 6 3 ) 1 6
0 , 4 9 3 ) 1 9
0 , 4 7 2 , 9 6
0 , 4 5 2 , 9 6
0 ) 4 5 2 , 9 7
x . = 0 , 4 7 3 , 0 6
s = 0 , 0 2 3 s = 0 , 1 5 4
4 ) 9 2 l o V K = 5 ) 0 2 X
H and d i e s e r D a t e n l i e ß s i c h f ü r d i e L o w - K o n t r o l l e e i n e S t a n d a r d - a bwe i c h u n g v o n s = 0 , 0 2 3 e r r e c h n e n . D i e H i g h - K o n t r o l l e l i e f e r t e f ü r d ie S t a n d a r d a b w e i c h u n g e i n e n W e r t v o n s = 0 , 0 9 7 .
d en g e w o n n e n e n D a t e n r e s u l t i e r t e f ü r d i e K o n t r o l l l ö s u n g m i t n je d r i g e r e m B e n z o y l e c g o n i n g e h a l t e i n V a r i a t i o n s k o e f f i z i e n t v o n V K 4 ,13 Q . F ü r d i e K o n t r o l l e m i t d e r h ö h e r e n K o n z e n t r a t i o n a n B e n z o y l - e cgo n i n w u r d e e i n V a r i a t i o n s k o e f f i z i e n t v o n V K = 3 1 3 A g e b i l d e t .
88 T +K ( 1 9 9 1 ) 5 8 ( 4 - 6 ) - 8 8
HPLC-A n a l y s e
Die P r o b e n , d i e b e i d e r F P I A p o s i t i v e E r g e b n i s s e l i e f e r t e n , wurden a nsch l i e ß e n d m i t t e l s H P L C e i n e r B e s t ä t i g u n g s a n a l y s e u n t e r z o g e n A bb.2 z e i g t d a s C h r o m a t o g r a m m e i n e r H P L C - A n a l y s e a u f C o c a i n .
A bb. 2 C h r o m a t o g r a m m e i n e r C o c a i n a n a l y s e
O O O C S 0
0 0 0 4 0
0 0 0 3 0
0 . 0 0 2 0
0 0 0 1 0
0 . 0 0 0 0
0 . 0 0 o . 2 0 1 ' . 4 0 1 8 . 5 0 2 4 . 8 0 3 1 . 0 0
C h r o m a t o g r a m D r a p l a y a t F O C U S % 8 Z N X C O C A I H 1 1 . B F F
A nal y s e n b e d i n g u n g e n : R P - 1 8 - S ä u l e ( 4 x 2 5 0 m m ) m i t V o r s ä u l e ; P h o s - p hat p u f f e r ( p H 2 , 4 ) , A c e t o n i t r i l ( 8 5 : 1 5 ) ; F l u ß r a t e 1 m l / m i n ;
A n H a n d d e r R e t e n t i o n s z e i t v o n 1 9 . 8 6 M i n u t e n w u r d e d e r S u b s t a n z p e a k a l s C o c a i n i d e n t i f i z i e r t . Wä h r e n d d i e s e s A n a l y s e n l a u f e s w u r d e n v o m g leic he n S u b s t a n z p e a k d i e D a t e n f ü r e i n U V - S p e k t r u m a u f g e n o m m e n . D e r A bs o r p t i o n s v e r l a u f i s t i n A b b . 3 d a r g e s t e l l t .
89 T +K ( 1 9 9 1 ) 5 8 ( 4 - 6 ) : 8 9
Abb • 3 UV-Spe k t r u m d e s S u b s t a n z p e a k s z u r R e t e n t i o n s z e i t 1 S y 86 t e n
/ e
II
/
I/
2 2 0 2 4 0 2 Ci 0 O O O 0 2 0
S p a e t r a A n a l y s i a r X F O C V S X B I N X C O C A Z N l 2 . S t F
D ar g e s t e l l t e r W e l l e n l ä n g e n b e r e i c h : 2 0 5 — 3 2 0 n m . G em e s s e n e s A b s o r p t i o n s m a x i m u m 2 3 2 n m .
Für d ie E r s t e l l u n g d er UV — Spektren w u r d e e i n W e l l e n l ä n g e n b e r e i c h v o n 2 0 5 n m b i s 3 2 0 n m fe s t g e l e g t. Dieser B e r e i c h g i b t d e n f ü r C o c a i n c har a k t e r i s t i s c h e n A bso r p t i o n s v e r l a u f m i t e i n e m M a x i m u m b e i 2 3 3 n m u nd e i n e m d e u t l i c h s chwäc he r a u s g e p r ä g t e n M a x i m u m b e i - 2 7 5 n m w i e - d er .
I n A b b . 4 i s t d a s U V - S p e k t r u m d e r R e i n s u b s t a n z C o c a i n u n d d a s j e n i g e d es S u b s t a n z p e a k s a u s d e r A n a l y s e ü b e r e i n a n d e r p r o j i z i e r t . E s z e i g t s ich , d a ß b e i d e S p e k t r e n , u n d d a m i t a u c h d i e S u b s t a n z p e a k s , i d e n t i s c h
s l n d o
90 p +K ( 1 9 9 1 ) 5 8 ( 4 - 6 ) : 9 0
A bb. 4 Überla g e r u n g d e r g y - S p e k t r e n z w e i e r S u b s t a n z p e a k s v e r s c h i e d e - n er C h r o m a t o g r a m m e .
2 3
2 2 0 2 4 0 2 5 0
2 8 0 3 0 0 3 2 0
S p e c t r a A n a l y a i e : X F O C U S ~ B I N ~ C O C A I N l 0 . B F F
R et e n t i o n s z e i t d e r S u b s t a n z p e a k s 1 9 , 6 8 b z w .1 9 , 7 0 M i n u t e n W ellen l ä n g e n b e r e i c h : 2 0 5 - 3 2 0 n m
Z us a mme n f a s s u n g
D r o g e n u n t e r s u c h u n g e n , d i e m i t d e r F P I A - M e t h o d e d u r c h g e f ü h r t w e r - d e n , l i e f e r n i n k u r z e r Z e i t u n d b e i m i n i m a l e m p e r s o n e l l e n A u f w a n d e xa k t e R e s u l t a t e . F ü r d i e n o t w e n d i g e A b s i c h e r u n g d e r e r s t e l l t e n E r - g e b n i s s e k a n n d i e H P L C - A n a l y s e a l s z w e i t e u n a b h ä n g i g e M e t h o d e e i n - g e s e t z t w e r d e n . D i e A u s s t a t t u n g d e s H P L C - S y s t e m s m i t e i n e r g e e i g n e - t en E D V - A n l a g e , d i e d i e A n a l y s e n d a t e n a l s R o h d a t e n s p e i c h e r n u n d
a u f b e r e i t e n k a n n u n d d a m i t d i e E r s t e l l u n g v o n U V - S p e k t r e n s o w i e d i e e rn e u t e D a r s t e l l u n g u n d M o d i f i z i e r u n g d e r C h r o m a t o g r a m m e e r -
l au b t , s t e l l t e i n e w e r t v o l l e B e r e i c h e r u n g d e r M ö g l i c h k e i t e n i n d e r D r o g e n a n a l v t i k d a r .
91 T +K ( 1 9 9 1 ) 5 8 ( 4- 6 ) : 9 1
W orks ho p 1 9 9 1 : F e s t p h a s e n e x t r a k t i o n a u s P l a s m a f ü r G C u n d G C - N S H ans H . M a u r e r , M a r t i n a R u p p u n d A r m i n W e b e r
Abteilung K l i n i s ch e T o x i k o l o g i e d e r U n i v e r s i t ä t d e s S a a r l a n d e s W -6650 Hombur g ( S a a r )
Für die gaschromatographisch-massenspektrometrische Identifizierung und Quantifizierung von Arznei- und Giftstoffen im Plasma wurde ein Festphasenextraktionverfahren mittels Octadecylsäulen (C-18) entwickelt. Das Ziel war, möglichst viele Stoffe unterschiedlicher Struktur zu erfassen. Die Effizienz sollte anhand des GTFCh-Kontrollserums (für die GC) exemplarisch getestet werden.
Material und Methode
Das GTFCh-Kontrollserum für GC (Fa. Laboserv GmbH, Gießen) enthält die in Tab. 1 angegebenen therapeutischen Konzentrationen ausgewählter Arzneistoffe.
Die einzelnen Schritte der Festphasenextraktion sind in Abb. 1 zusammengefaßt.
Die Quantifizierung wurde mittels GC-MSD durchgeführt (neue (!) Methylsilicon-Kapillare HP-l, Temperaturprogramm 100-310 C in 10 /min; Full Scan Mode, Auswertung mittels Ionenchromatographie und Integrationssoftware von HP). D a d i e K o nzentrationen im GTFCh-Kontrollserum zwar realistisch aber für die Quantifizierung in einem Schritt zu unterschiedlich sind, wurden alle Proben zweimal analysiert, wobei beim zweiten Run die Multiplier-Spannung deutlich erhöht wurde.
Ergebnisse und Diskussion
In Tab. 1 sind die Wiederfindungsraten der im GTFCh-Plasma enthaltenen Substanzen aufgelistet (n=5). Da am Ende der Elution ein kleiner Rest Wasser in der Probe verbleibt, dauert der Abdampfschritt relativ lange, sodaß flüchtige Verbindungen (z.B. Clomethiazol) verloren gehen können.
In Abb. 2 i s t e i n t y p isches Totalionenchromatogramm eines Festphasenextraktes des GTFCh-Kontrollserums abgebildet (TP 30 C/min). Die Nummerierung der Peaks entspricht der Nummerierung der Substanzen in Tab. 1. Im Vergleich zur Flüssig-Flüssig-Extraktion sind die Matrixbestandteile - insbesondere das Cholesterol — etwas geringer.
Nach unserer Erfahrung bietet die Festphasenextraktion - zumindest derzeit — noch keinen wesentlichen Fortschritt für die toxikologische Routineanalytik.
yorgestellt anläßlich des Workshops der GTFCh "Suchtstoffnachweis im Blut", Köln 3.-4.]Q. l99l
92
T +K ( 1 9 9 1 ) 5 8 ( 4 - 6 ) - 9 2
Abb. 1: Festphasenextraktionsverfahren für Plasma
Vorbereiten
1.) Säulenaktivierung: 2x3 mL Methanol, 2x3 mL Wasser 2.) Probenaufgabe: 1mL Plasma mit 3 mL Wasser verdQnnen 3.) Waschen mit 2x3 mL Wasser
C18-Säule
4.) Ansäuern mit 1 mL 1 M Essigsäure (pH4) (Baker 3 mL)
5.) Wasserentfernung mit 1mL Hexan, dann 0,1 mL Aceton 6.) Trockensaugen (10min), 5min zentrifugieren
Vakuum
Eluieren
Druckluft
7.) Elution in zwei Schritten
saure/neutrale Arzneistoffe mit 1x1 mL, dann
1x2 mL Dichlormethan basische Arzneistoffe mit 1x1 mL
~4 — C18-Säule
dann 1x2 mL alk. Eluent(Ethylacetat, Methanol,
conc. Ammoniak; 88:10:2 pH 8-9)
(pH-Kontrolle, ggfs. neu ansetzen)
~gf — 20 mL Spitz- kolben
Eindampfen
! ~ V a k u um
8.) Vereingte Eluate werden abgedampft (10-15min) RQckstand mit 100 pL Methanol aufnehmen.
~ — Heizblock 60%
93 T +K ( 1 9 9 1 ) 5 8 ( 4 - 6 ) - 9 3
Abb. 2: Totalionenchromatogramm des GTFCh-Kontrollserums nach Festphasenextralction
u n a n c e T IC : R U S 3 . D
1 . 7 e + 8 7
2.) Barbital
3.) Pentobarbital
1 . 6 e + 8 7
4.) Diphenhydramin
5.) Phenobarbital
10
1 . 5e+8 7
6.) Methaqualon
7.) Codein
1 . 4 e + 8 7
8.) Morphin
9.) Nalorphin
1.3e+87 10.) Chinin
11.) Hatoperidol 12.) Strychnin
1 . 2 e + 8 7 1 . 1 e + 8 7 l e + 8 7 9 888 8 8 8
8888888 7888888 6888888 5888888 4888888 3888888 2888888 i888888
6.88 S.HH 18. 88 12.88 14. 88
94 p +K ( 1 9 9 1 ) 5 8 ( 4 - 6 ) : g4
Tab. 1: Wiederßndungsraten aus dem GTFCH-Kontro~r u m n ~ ~ Festphasenextraktion (n = 5)
N r . S ubs t a n z C WPR i n S e s am
[mg/L]
C lome t h i a z o l 1 , 0
2. )
B ar b i t a l 1 0 , 0 4 2 % g 1 0 , 23.)
Pento b a r b i tal 5 , 0 1 0 3 % g 1 7 , 1Diphenhydr amin
0 , 5 9 6 % g 6 , 05.)
Pheno b a r b i t a l 1 0 , 0 8 5 %' g 2 2 , 26.) M ethaqu a l o n
5 , 0 1 1 6 % ' ~ 1 7 , 37.) Codein
0 , 5 78 ' t ~ 7 , 88.) M orphi n
0 , 1 8 7 % g 2 2 , 29.) N alor p h i n
0 , 1 6 4 % + 9 , 1C hini n
5 , 0 9 1 % + 1 0 , 211. ) Hal o p e r i d o l 0 , 1 9 1 % g 9 , 8
12. )
S tr y c h n i n
0 , 5 8 1 % + 1 5 , 995 T +K ( 1 9 9 1 ) 5 8 ( 4 - 6 ) : 9 5
W ork s ho p 1 9 9 1 : Q u a n t i f i z i e r u n g v o n B e n z o d i a z e p i n e n n a c h p e s p hase n — E x t r a k t i o n m i t t e l s H P L C / D A D
F rank M u ß h o f f u n d T h o m a s D a l d r u p
I nstitut fü r R e c h t s m e d i z i n d e r H e i n r i c h - H e i n e - U n i v e r s i tä t D ü s s e l d o r f W-4000 Düsseldorf l
E inlei t u n g :
S creening u n d N a c h w eis v o n B e n z odiazepinen erfolgen sowohl z u t herapeu t i s c he n Z w e c k e n , a l s auch i m Zusa m m e n h an g m i t t ox i k o l o - gischen und verkehrsmedizinischen Fragestellungen. Im folgenden wird eine in u n serem L a bor bereits etablierte, schnelle und einfach zu handhabende HPLC-Methodik mit vorausgehender Festphasen-Extraktion zur Q u a ntifizierung vo n B e n z odiazepinen au s S e ru m m i t i nternem Standard beschrieben. Erarbeitet wurde diese Prozedur anhand von 8 sehr g ä n g i g e n W i r k s t o f f e n , n äm l i c h Br o m a z e pam , D e s m e t h y l d i a z e pam, D iazepam, F l u nitrazepam, M i d a zolam, O x a z epam , T e t razepam u n d Triazolam, mit dem i n d e r P r axis selten anzutreffenden Brotizolam als internem Standard. Damit wurden Substanzen mit groPen Unter- schieden in den therapeutischen Konzentrationsbereichen einbezogen.
M ateria l u n d M e t h o d i k :
Aussta t t u n g: P e r k i n Ei m e r S e r i e s 1 LC Pu m p ; S ä u l e K o n t r o s o rb 1 0 RP 1 8 (2 5 x 4.6 mm i .d. ) ; P e r k i n Ei m e r LC - 4 8 0 A u t o S c a n D i o d e A r r a y D etector ; P C mi t P e r k i n E i m e r — Software ( L C - D E S p l u s )
Chroma tographi e — Parameter: I s o k r a t i s c h e B e d i n g u n g en m i t f l o w v o n 1.3 ml/min ; E l u t i o n s m i t t e l : 1 5 6 g A cet o n i t r i l ( Li c h r o s ol v M e r c k ) + 344 g Phosphat-Puffer (4.8 g 85'folge Ol thophosphor säure und 6. 66 g KH2PO<
a d 1 L W a s se r ( B a k er — HPLC-Reagent) , p H 2 . 3 0 )
Extr aA ti o n s sä u l en: W o r l d w i d e M o n i t o r i n g C l e a n U p C i e E n d C a p p ed ( 1 0 0 mg) bezogen v o n d e r F i r m a A M C H RO
Borat - P u f f e r ( p H 9 ) : 8 3 5 m L L s g . A ( 1 2 . 3 r g Ha B Os + 1 0 0 m L 1 M Na O H m it 0 . 0 5 M B o r a x - L s g . ( N a zB<Ov) ad 1 L ) + 165 m L 0 . 1 M H C l
A ll e R e a g e n t i e n w a r e n v o n p .a . Qu a l i t ä t . D i e B e n z o d i a z e p in e w u r d e n
p+K ( 1991 ) 5 8 ( 4- 6 ) : 96
96
in Form von Reinsubstanzen von den Firmen bezogenen un d l a g e n a l s 0 . 1
% ige Stammlösungen i n M e t h a n o l v o r .
Extrak t i o n : 2 m L S e r u m ( B l i n d - bz w . a u f g e s t o c k t e s S e r um )u m) w e r de n n a c h v on 5 0 0 ng Br ot i z o l a m ( 1 p p L ei ner I s g. m it m it 0 . 0 5 m g / m L0 . g Methanol ) m i t 2 mL Bo r a t - P u f f e r ( p H g ) v e r s e t z t . E i n e C l e a n U p C fg - Extraktionssäule w ird wie folgt konditioniert: Nach Auftragen von 2 Methanol e r f o l g t e in Sp ü l e n m i t 2 mI. A .d e s t . u nd 1 mI Bor at - ( pH 9) . A u f di e s e k on d i t i o n i e r t e S ä u l e w i r d d ie pr o b e au f g e -
« n ca . 1 mL/ mi n ) . Es f ol gt ei n Wasc h s c h r i t t m i t zunächst 1 mL A .d e s t . , d a n n m it 1 mL 15g i g e m w ä p r . M e t h a n o l . Di e Säule w i r d gu t get r o c k n e t (Z e n t r i f u g a t i o n 5 mi n , 2pp p r pm ) . A n - s chliepen d e r f o l g t d i e E l u t i o n m it 1 mL r ei n e m M e t h a n o l . D a s El u a t
w ird u n t e r N , b e i 5 0 C i m H e i z b l o c k e i n g e e ng t u n d i n 2p p L M e t h a n o aufgenommen, v o n d e n e n 1 0 p L ( A l i q u o t e n t s p r e c h en d 1 m L S e r u m ) i n d as HPLC-Sy stem i n j i z i e r t w e r d e n .
E rgebnisse u n d D i s k u s s i o n :
Für unsere Untersuchungen haben wir Blindserum mit 2 unterschied- lichen Testmischungen aufgestockt: Testlösung A enthielt Bromazepam , O xazepam , D e s m e thyldiazepam u nd Fl u n itrazepam, T e s tlösung B Midazolam, T e t r a z e p am, T r i a z o l a m u n d D i a z e p a m.
Gerade die 1,4-Benzodiazepine zeigen eine intensive U V - A b s o rption mit spezifischen UV — Maxima. Für die Screening-Untersuchung w ä h lten w ir d i e u n i v e r s e l l e D e t e k t o r w e l l e n l äg e v o n 2 2 0 n m .
Z ur Q u a ntifizierung w e rde n d i e P e a kflächenverhältnisse (probe z u S tandard ) he r a n g e z ogen . D ie Kal i b r a t i o n s k u r v e n s i nd f ü r säm t ] . l c h e untersuchten Benzodiazepine über den K o nzentrationsbereich von
1 500 n g / m L S e r u m l i n e a r , m it Kor r e l a t i o n s k o e f f i z i e n t e n v on Q.9 9 3 - 0 .997. D i e N a c h w e i s g r e n ze n l i e g e n s ä m t l i c h b e i 1 — 2 n g / m I „ Mi t d er D ioden — Array- D e t e k t i o n er h ä l t man bi s hi nu n t e r z u Kon z e n t r a t i o n e n von 1 0 n g /m L UV — Spektren der Substanzen als zusätzliche Identifi- kationsmerkmale.
D ie Niederfindungsraten und P räzisionsdaten wurden von u n b 10 n g/mL u n d 5 0 0 n g / m L b e s t i m m t . D i e W i e d e r f i n d u n g s r a t e n l i e f " d ' niedrig konzentrierten Ansätze zwischen 74 g und 9Q pg
h öher k on z e n t r i e r t e n zw i s c h e n 79 . Q u nd g4 1g
97 T +K ( 1 9 9 1 ) 5 8 ( 4- 6 ) : 9 7
D esmet h y l -
B romazepa m O xaze p s m d i a z e p a m F lunitr a z e p a m
Aufge s t o c k t 1 0 5 0 0 10 500 10 500 10 500
( ng/ ml )
T abelle 1 :
P räzisionsd a t e n B rmitt e l t ' 9 . 7 4 8 8 1 0 . 7 4 8 3 1 0. 5 4 8 0 9 . 7 4 7 7 ( »((/ x l )
( n = 6 ) x i0.7 8 i 3 5 . 4 i1 .34 i 28 .8 i 0 .7 4 i 31 .7 i 1 .15 i 40 .2
7 . 8 7 . 1 1 3 . 4 5 . 8 7 . 4 6 . 3 1 1 . 5 8 . 0
M ieder f i n d un g 80 .1 83 .1 7 9 .8 81 .9 8 6 .1 9 0 .6 80 .8 84 .1
('lg
i x i2 .4 i2 .3 i 3 .5 i 3 .2 i 3 .3 t 2 .7 i3 .1 i 2 .9
r 0 . 9 9 6 0 . 9 9 4 0 . 9 9 3 0 . 9 9 6
Korr e l a t i on s - k oeffi z i c n t ( 8i c h g e r a d e )
H id a z o l a m T etr a z e p a m T ri azo lam D ia z e p a m
huf g e s t o c k t 1 0 5no 10 500 10 500 10 500
(nq/ml )
Hrmi t tal t' 1 0. 6 4 8 9 1 0. 8 5 1 6 9 . 0 4 7 1 1 1 . 1 5 2 3 (ng/ml )
i x i 0.9 8 i 4 7 . 8 i 1 .0 4 i 50 .2 i 1 .15 i 48 .1 i 1 .13 i2 4 .4
Vk 9 . 8 9 . 6 1 0. 4 1 0 . 0 1 1 . 5 9 . 6 1 1 . 3 4 . 9
R ie d e r f i n d u n g 8 0. 4 8 4 . 4 7 6. 7 8 1. 4 7 4 . 9 7 9 . 8 9 0 . 0 9 4 . 1 )
x i 3 . 1 i 2 . 7 i 3 . 1 i 2 . 8 i 1 . 9 i 2 . 4 i 3 . 0 R2 . 2
r 0 9 9 6 0 . 9 9 7 0 . 9 9 6 0 . 9 9 4
Korr e l a t i on " - ko=f f i z i e n t
( 8) <-hgera d )
' Frmi t telt ubcr i n t e r n e n S t a n d a r d B r o t i z o l a m
sind d i e V / e r t e f ü r d i e Pr äz i s i o n v on T ag z u T ag au f ge f ü h r t , mi t V aria t i o n s k o e f f i z i e n t e n v o n 7 . 8 — 13.4',o fü r d i e ni ed r i g k on z e n t r i e r t e n Proben und von 4.9-10.096 für die höher konzentrierten.
Diese Methodik der Pestphasen-Extraktion mit angeschlossener Hoch- druckfliissigkeitschromatographie und Dioden — Array — Detektion zeichnet sich für das Benzodiazepin — Screening aus durch gute Wiederfindungs-
raten, hohe Reproduzierbarkeit und in jeder Beziehung ausreichende S ensit i v i t ä t u nd Sel ek t i v i t ä t . A uch f ür d i e ni edr i g dosi e r t e n Benzodiazepine ist die Erfassung der therapeutischen Konzentrations- bereiche gewährleistet. Nicht zuletzt durch die leichte Handhabung u nd d e n v e r g l e i c h s w e is e g e r i n g e n Z e i t a u f w a n d k o n n t e s i c h d i e s e s V e r - fahren in unserem Labor als Routine — Methode etablieren.
98 ( 19 9 1 ) 5 8 ( 4 - 6 ) : 9 8
W orksho p 1 9 9 1 : N a c h w e i s v o n C o c a i n u n d B e n z o y l e c g o n x n f luoro i s o p r o p y l e s t e r a u s B l u t u n d « i >
G eorg S c h m i t t u n d R o l f A d e r j a n
I nstitu t f ü r R e c h t s m e d i z i n , W - 6 9 0 0 H e i d e l b e r g
1. Einleitung
I m Geg e n s a t z z u C o c a i n i s t d a s H a u p t s t o f f w e c h s e l p r o d u k t B e n z o y l e cgoni n n u r n a c h D e r i v a t i s i e r u n g c h r o m a t o g r a p h i s c h e i n f a c h
s tellb ar . Z u r V e r b e s s e r u n g d e r c h r o m a t o g r a p h i s c h e n E i g e n s c h a f t e n h at s ic h d i e D e r i v a t i s i e r u n g m i t H e x a f l u o r o i s o p r o p a n o l ( H F I P ) p enta f l u o r o p r o p i o n s ä u r e a n h y d r i d ( P F P A ) b e w ä h r t ( A b b - 1 ) - B e n z o y l e cgonin w i r d d a b e i i n e i n e n m i t s c h a r f e m P e a k c h r o m a t o g r a p h i « - b aren E s t e r ü b e r f ü h r t . D i e I o n e n - C h r o m a t o g r a m m e ( E I , P C I ) v o n C ocain u n d B e n z o y l e c g o n i n - H F I P s i n d i n A b b . 2 - 3 z u s e h e n . P F P A , v orwi e g e n d f ü r d i e D e r i v a t i s i e r u n g v o n p h e n o l i s c h e n O H - G r u p p e n e inges e t z t , d i e n t i m v o r l i e g e n d e n F a l l d e r V e r s c h i e b u n g d e s R e a k -
tionsgleichgewichtes in Richtung des Esters (Abfangen des Reak-
t ionsw a s s e r s ) . E s w i r d b e k a n n t l i c h a u c h z u r D e r i v a t i s i e r u n g a n d e - r er B e t ä u b u n g s m i t t e l ( z . B . T H C , M o r p h i n , C o d e i n ) v e r w e n d e t . D a s B enzo y l e c g o n i n - H F I P - D e r i v a t k a n n s o w o h l ü b e r s e i n e n R e t e n t i o n s - i ndex a l s a u c h ü b e r s e i n e I o n e n m a s s e p r o b l e m l o s v o m C o c a i n u n t e r -
s chi e de n w e r d e n ( A b b . 4 ) .
2 . Ch e m i k a l i e n u n d M a t e r i a l i e n
1 ,1,1 , 3 , 3 , 3 - H e x a f l u o r - 2 - p r o p a n o l ( H e x a f l u o r o i s o p r o p a n o l , H F I P ) , F l u k a * * * , > 9 9 % ( GC)
P enta f l u o r o p r o p i o n y l a n h y d r i d e ( P F P A ) , F l u k a * * * , 9 5 % ( G C ) Coca i n , Si gma * * +
B enzo y l e c g o n i n , S i g m a * * * M etha n o l , R o t h * * *
D ichlo r m e t h a n , R o t h * * * i s o - P r o p a n o l , Ro t h * * *
N atri u m c a r b o n a t , F l u k a * * *
konz . Ammon ia k ( 2 5% ) Mer ck***
d est i l l i e r t e s W a s s e r
" Fremd s t of freies " B l u t z . B. 10 m L
" Fremd s t o f f r e i e r " U r i n z . B . 1 0 m L
C 18-S ä u l e : B o n d E l u t ( 2 0 0 m g / 3 , 0 m L ) , A n a l y t i c h e m I n t e r n a t i o n a Reage n z r ö h r c h e n 4 mL
G C-G l ä s c h e n 2 m l m i t B ö r d e l k a p p e n
* ** R ot h G m b H + C o . , D - 7 5 0 0 K a r l s r u h e .
* ** S i gm a G m b H , D - 8 0 2 4 D e i s e n h o f e n
* ** M e r c k , D - 6 1 0 0 D a r m s t a d t
* ** F l u k a C h e m i e A G , C H - 9 4 7 0 B u c h s
99 T +K ( 1 9 9 1 ) 5 8 ( 4- 6 ) : 99
3 . L ö s u n g e n :
0 2 m N a t r i u m c a r h o n a t l ö s u n g : 2 1 , 1 g N a 2 C O 3 / L H 2 0 0 2 m N a t i u m h i c a r h o n a t l ö s u n g : 1 6 , 7 g N a H C 0 3 / L H 2 0
Natr i u m c a r b o n a t u f f e r : 4 m L 0 , 2 m N a 2 C O 3 + 4 6 m L 0 ,2 m N a H C O 3 m it W a s s e r a u f 2 0 0 m L a u f f ü l l e n .
Elut i o n s l ö s u n : 8 0 m l C H 2 C 1 2 + 2 0 m L i s o - P r o p a n o l + 2 m L N H 3 k o n z .
L ösu n z ur A u f n a h m e d e s er iv a t e s f ü r d i e G C : 9 0 ml D i c h l o r m e t h a n + 1 0 m L I s o p r o p a n o l
E xtern e S t a n d a r d s : Z u s a t z v o n j e 0 ,3 M ik r o g r a m m C o c a i n o d e r B enz o y l e c g o n i n z u 1 m L L e e r b l u t o d e r L e e r u r i n
4 . E xt r a k t i o n
Z unäc hs t w i r d m i t 1 x 3 m L M e t h a n o l u n d 1 x 3 m L N a t r i u m c a r b o n a t - p uffe r d i e C - 1 8 F e s t p h a s e k o n d i t i o n i e r t ( j e w e i l s d u r c h s a u g e n u n d S äule n i c h t t r o c k e n l a u f e n l a s s e n ) . Z e 1 m L B l u t / U r i n w e r d e n m i t 2 mL N a t i u m c a r b o n a t p u f f e r v e r s e t z t . A n s c h l i e ß e n d w i r d 3 m i n b e i c a. 5 0 0 0 - 1 0 0 0 0 u p m z e n t r i f u g i e r t . D e r Ü b e r s t a n d w i r d a u f d i e v o r - k ond i t i o n i e r t e C - 1 8 - S ä u l e g e g e b e n . D a n n w i r d 1 m i n l a n g V a k u u m a nge l e g t , m i t 3 m L W a s s e r g e w a s c h e n 1 0 m i n l a n g V a k u u m a n g e l e g t . M it 2 x 1 m L E l u t i o n s l ö s u n g w e r d e n C o c a i n u n d B e n z o y l e c g o n i n i n G C - G läs c he n a u f g e f a n g e n . D i e E l u t i o n s l ö s u n g w i r d b e i 5 0 C m i t S t i c k -
stoff bis zur Trockne eingeengt.
5. Derivatisierung
Z um E x t r a k t r ü c k s t a n d w e r d e n 5 0 p L P F P A s o w i e 5 0 p ,l H FI P g e g e b e n . D er R e a k t i o n a n s a t z w i r d 3 0 m i n b e i 7 0 ' C g e h a l t e n . A n s c h l i e ß e n d w ird m i t S t i c k s t o f f b e i 5 0 ' C e i n g e e n g t . D e r T r o c k e n r ü c k s t a n d w i r d
in 30 pL Dichlormethan / iso-Propanol (9:1) aufgenommen
GC/NS ( H P 5 9 8 8 ) B e d i n g u n g e n :
T ren n k a P i l l a r e : C P - S I L 5 , 1 2 m , 0 , 25 mm I D , 0 , 32 pm S c h i c h t d i c k e
R I ( K o v a t s )
2 19 0 f ü r Co c a i n1 980 fü r B e n z o y l e c g o n i n - H F I P
Temperaturprogramm
170' C 1 mi n , 2 0 C/ mi n , 2 9 0 C 1 mi nI n j e c t o r
2 5 0 ~ CI n t e r f a c e
2 5 0 ~ CMultiplier
1 30 0 VSIM (Beobachtungscyclus (dweil) je 50 ms) I . ) E I ( 7 0 eV )
m /z= 1 8 2 , 3 0 3 f ü r C o c a i n
m /z= 2 7 2 , 3 1 8 f ü r B e n z o y l e c g o n i n - H F I P
100
( 1991 ) 5 8 ( 4 - 6 ) : 1 0 0
1X- ) P C X ( 2 3 0 e V , Me t h an )
Quel l e n d r u c k 1 T or r
m /z= 1 8 2 , 3 0 4 f ü r C o c a i n
m /z= 3 1 8 , 4 4 Q f ü r B e n z o y l e c g o n i n - H F I P
~>neariät, Bestimmungsgrenzen, Richtigkeit, prazzszon,
W ie d e r f i n d u n g u n d S t a b i l i t ä t : L ine a r i t ä t d e r K a l i b r a t i o n :
Im Bereich von 25 bis 1000 pg/L in Blut und in Urin wurde die er- wartete lineare Beziehung zwischen Signalintensität (Peakfläche) und Konzentration für Cocain und für Benzoylecgonin geprüft und
g ef u n d e n .
Bestimmungsgrenzen:
30 pg/l Blut (EI), 20 pg/l Blut (PCI) bei Multiplier-Einstellung
v on 1 3 0 0 V . S i e s i n d b e i e n t s p r e c h e n d e r S i g n a l v e r s t ä r k u n g
abzusenke n a u f c a . 1 pg / L . Richtigkeit und Präzision:
S ie w u r d e n g e p r ü f t ü b e r Z u s ä t z e v o n 1 0 0 p g C o c a i n u n d 2 5 0 p g B e n - z oyle c g o n i n p r o L i t e r z u e i n e r B l u t p r o b e , d i e i n n e r h a l b v o n 2
Wochen 6 mal bestimmt wurden. Für Cocain ergab sich eine mittlere
K onz e n t r a t i o n + S t a n d a r d a b w e i c h u n g v o n 1 0 1 + 1 2 , 9 p g / L ( C V = 1 2 , 8
% ) un d f ü r B e n z o y l e c g o n i n v o n 2 4 9 + 1 9 , 3 p g / L ( C V = 7 , 7 % ) . D i e
Intraassay-Varianz (5 malige Extraktion und Bestimmung innerhalb eines Tages) war nur geringfügig besser.
W ied e r f i n d u n g :
w iedergefunde n au s B l u t a u s U r i n
C oca i n 86 95
B enzoy l e c g o n i n
75 87I
S tab i l i t ä t :
B ei - 2 0 ' C u n t e r F e u c h t i g k e i t s a u s s c h l u ß i s t
p ent a f l u o r o z.sopro p y l e s t e r m i n d e s t e n s 4 T a g e
e r B e n z o y l e c g o n i n - a ge s a b z
8 . B ef u n d e
In Tabelle 1 sind Untersuchungsergebnisse für zoylecgonin angegeben. Die ermittelten Konzept positiv verlaufenden immunochemisc
(6)) bestimmt. In Blut wurden, mit Ausnahm~
Untersuchungen, keine Werte über 80 pg/L ermitt l t o a en h ierfür könnte in der kurzen Plasma-H l b . D ie Ur sa c h e
1-1,5 Stunden) und der noch in vitro aktiven k"
r asen liegen. Erwartungsgemäß fand e ' ' o p g en e n E st e - Konzentrationen von C o c a in und von Ben
enzoy l e c g o n i n .
101 T +K ( 1 9 9 1 ) 5 8 ( 4 - 6 ) : 1 01
Tabe ll e 1 : U n t er s u c h u n g s b e f u n d e m i t F P I A ( 6 ) u n d G C /M S
Prob e F a l l M at e r i a l
Gc/MS
F PI A ( T D x )Cocai n Be n z o y l -
e cgoni n
Vg/L ~g/L ~g/L
1 Ch
Uri n
> 10 0 0 > 1 0 0 0 > 5 0 0 02
3 Ch U r i n 200 > 1 0 0 0 > 5 0 0 0
Ch U r i n 50 300 550
4 Ch U r i n 60 > 1 0 0 0 > 2 0 0 0
5 6 Ch
Uri n
0 > 1 0 0 0 > 2 0 0 0ch
U r i n 300 > 1 0 0 0 > 5 0 0 07
8 Ch
Uri n
0 > 1 0 0 0 > 5 0 0 0Ba B l u t 30 210 2 5 0 - 5 0 0
U r i n 290 > 1 0 0 0 > 5 0 0 0
9 Ba B l u t 80 580 2 5 0 - 5 0 0
10 S B l u t 120 170 2 5 0 - 5 0 0
11 S B l u t 0 290 2 5 0 - 5 0 0
U r i n 160 1 6 0 0 0 > 5 0 0 0
12 B l u t 170 0 1 1 8 0 0 > 5 0 0
U r i n 200 7 6 0 0 0 > 5 0 0 0
C h = c h e m i s c h - t o x i k o l o g i s c h e r F a l l , B a = F a l l n a c h r o u t i n e m ä ß i g e r B luta l k o h o l b e s t i m m u n g , S = S e k t i o n s f a l l .
L i t e r a t u r
1 . Ma t s a b u r a K . , M a s e d a C . , F u k u i Y .
Q ua n t i f i c a t i o n o f c o c a i n e , b e n z o y l e c g o n i n e a n d e cgo n i n e m e t h y l e s t e r b y G C C I - S I M a f t e r
e xtr e l u t e x t r a c t i o n , F o r e n s i c . S c i . I n t . 1 2 , 1 81 - 1 8 9 ( 1 9 8 4 )
2 . Mul e S . J . , C a s e l l a G . A .
C on f i r m a t i o n a n d q u a n t i t a t i o n o f c o c a i n e , b en z o y l e c g o n i n e , e c g o n i n e m e t h y l e s t e r i n h uma n u r i n e b y G C / M S , J . A n a l . T o x i c o l 1 2 ,
153 - 1 5 5 ( 1 9 8 8 )
3 . Is e n s c h m i d S . , L e v i n e S . , C a p l a n H .
A m e t h o d f o r t h e s i m u l t a n e o u s d e t e r m i n a t i o n o f
cocaine, benzoylecgonine and ecgonine methyl ester in blood and urine using GC/MS with
derivatisation to produce high mass molecular
i ons , J . A n a l . T o x i c o l 1 2 , 2 4 2 - 2 4 5 ( 1 9 8 8 ) 4 . Z h a n g J . , F o l t z R . L .
Cocaine metabolism in man: Identification of four previosly unreported cocaine metabolites in
h uma n u r i n e , J . A n a l . T o x i c o l 1 4 , 2 0 1 - 2 0 5 ( 1 9 9 0 ) 5 . Ad e r j a n R . , S c h m i t t G . , W u M . , M e y e r C .
