Matrix-Metalloproteinasen (matrix metalloproteinases, MMPs) stellen eine Familie von zinkhaltigen proteolytischen Enzymen dar, die sowohl bei der (Tumor-) Angiogenese als auch bei der Invasion und Metastasierung von Tumorzellen eine essentielle Rolle spielen.205–208 Während der normalen Angiogenese exprimieren und sekretieren aktivierte, vaskuläre Endothelzellen die MMPs, welche in der Lage sind, die extrazelluläre Matrix (extracellular matrix, ECM) abzubauen bzw. umzustrukturieren. Der Abbau der ECM ermöglicht es den Endothelzellen, sich durch das umliegende Gewebe zu bewegen und schließlich tubuläre Strukturen auszubilden, die das Grundgerüst für neue Blutgefäße darstellen.206,207 Durch Quervernetzung und Stabilisierung dieser tubulären Strukturen mittels spezieller Muskel- und Bindegewebszellen (glatte Muskelzellen bzw. Perizyten) entsteht letztendlich ein Netzwerk aus reifen Blutgefäßen. Die Ausbildung neuer Blutgefäße ausgehend von einem bereits existierenden Netzwerk an Kapillaren (Angiogenese) spielt für verschiedene physiologische Abläufe im menschlichen Organismus eine entscheidende Rolle. So stellt das Wachstum neuer Blutgefäße vor allem bei der Entstehung und Differenzierung von Organen während der Embryogenese einen essentiellen Prozess dar.209–211 Darüber hinaus tritt die Angiogenese bei Erwachsenen während der Wundheilung sowie des Reproduktionszyklus von Frauen auf. Die
und für einen begrenzten Zeitraum aktiviert.205,209–211
Sämtliche angiogene Prozesse werden dabei durch pro- und antiangiogene Faktoren gesteuert, deren Gleichgewicht wiederum zeitlich und räumlich strikt reguliert ist. Kommt es jedoch zu einer Disregulation der Angiogenese, kann eine verringerte oder verstärkte Blutgefäßausbildung auftreten, was letztendlich die Entstehung verschiedener Krankheiten zur Folge haben kann.205,208–211
So spielt die pathologische Angiogenese u.a. auch beim Tumorwachstum und der Ausbreitung von Krebszellen im Körper (Metastasierung) eine entscheidende Rolle. Während sich ein kleiner, lokaler Tumor noch ausreichend über das entsprechende umliegende Gewebe und die hierin vorliegenden Blutgefäße mit Nährstoffen sowie Sauerstoff versorgen kann, ist für das Wachstum über einen Durchmesser von einigen Millimetern hinaus sowie die Metastasierung ein eigenes, internes Blutgefäßnetzwerk notwendig.208,212,213
Für die Rekrutierung von neuen Blutgefäßen können Zellen des unterversorgten Tumors spezielle Wachstumsfaktoren sekretieren, die zu einer Aktivierung von umliegenden Endothelzellen und somit letztlich zu einer Initiation der Tumorangiogenese führen.
Darüber hinaus exprimieren und sekretieren viele Tumorzellen selbst MMPs.214–218 Diese proteolytischen Enzyme ermöglichen es den malignen Zellen sich durch den Abbau bzw. eine Reorganisation der ECM sich durch das umliegende Gewebe zu bewegen bzw. in neues Gewebe (Invasion) oder umliegende Blutgefäße einzudringen (Intravasation). Hierbei handelt es sich um Prozesse, die eine entscheidende Rolle für die Metastasierung von Tumorzellen spielen. Aus diesen Gründen stellen die von Endothelzellen exprimierten, aber auch die tumoralen MMPs vielversprechende targets dar, um ein Wachstum von Tumoren oder deren Metastasierung zu inhibieren. Sowohl die in dieser Arbeit verwendeten HUVECs219,220 als auch die humane Melanomzelllinie 518A2217,218,221
exprimieren und sekretieren die Gelatinasen MMP-2 und MMP-9. Wird die Expression und/oder die Sekretion dieser proteolytischen Enzyme durch Behandlung der Zellen mit antiangiogenen bzw. anti-metastatischen Wirkstoffen gehemmt, so kann dies mit Hilfe eines einfachen Zymographie-Assays sichtbar gemacht werden.222 Die Untersuchung, ob ausgewählte Gold(I)-NHC-Komplexe Veränderungen bei der Expression und/oder Sekretion aktiver Matrix-Metalloproteinasen (MMP-2 und MMP-9) in HUVECs oder 518A2-Zellen auslösen, erfolgte weitestgehend nach einem durch Rodríguez-Nieto et al. beschriebenen Protokoll einer Gelatine-Zymographie.223 Diese wurde für die Komplexe 29 und 30a zur Verifizierung der eigenen Ergebnisse zusätzlich von Matthias Rothemund (M.Sc., Universität Bayreuth)
durch-Die HUVECs (6 × 105 Zellen pro well) bzw. 518A2-Zellen (3 × 105 Zellen pro well) wurden in 6-well-Platten ausgesät und über Nacht im Brutschrank inkubiert. Nachdem das alte Medium abgenommen und verworfen wurde, wurden zu den Zellen jeweils 1,5 mL frisches Medium mit 0,1 % BSA gegeben und jedes well mit 200 kIU Aprotinin/mL versetzt. Darüber hinaus erfolgte die Zugabe der zu untersuchenden Metallkomplexe in geeignete Verdünnungsreihen. Als Negativkontrollen wurden Proben der vaskulären Endothelzellen bzw. Melanomzellen verwendet, die ausschließlich mit analogen Mengen an DMF behandelt wurden. Im Anschluss an eine Inkubation der Zellen über 24 h im Brutschrank wurde das Medium abgenommen und jeweils in ein 2 mL-Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt (Medium-Proben). Die Zellen am Boden der 6-well-Platten wurden einmal mit PBS gewaschen, bevor sie mit Hilfe eines Zellschabers in jeweils 0,5 mL Zelllyse-Puffer gekratzt und anschließend ebenfalls in 2 mL-Eppendorf-Reaktionsgefäße transferiert wurden. Die so gewonnenen Zelllysat-Proben wurden 10 s gründlich mit einem Vortexer durchmischt und für 15 min auf Eis gelagert. Anschließend erfolgte eine Zentrifugation der Medium- und Zelllysat-Proben für 20 min bei 14000 rpm und 4 °C. Nachdem die Überstände der Proben in neue Reaktionsgefäße überführt wurden, konnten diese für die Zymographie verwendet werden. Die Proteinkonzentration der Proben (Medium- und Zelllysat-Proben) wurde nach Bradford bestimmt.224
Die Proteinproben wurden anschließend mittels einer nicht-reduzierenden SDS-PAGE aufgetrennt, wobei ein 3 %-iges Sammelgel sowie ein gelatinehaltiges (1 mg/mL) 10 %-iges Trenngel verwendet und von den Proben einer Serie jeweils identische Mengen an Gesamtprotein (10-30 µg) auf das Gel aufgetragen wurden. Als Referenz für das Molekulargewicht der Proteine wurden auf jedes Gel in mindestens einer Bahn 5 µL der PageRuler™ Plus Prestained Protein Ladder (Thermo Scientific) als Molekulargewichts-standard aufgetragen.
Die Elektrophorese erfolgte zunächst für ca. 30 min bei 80 V in SDS-Laufpuffer. Sobald die Lauffront das Trenngel erreicht hatte, wurde die Auftrennung der Proteine für etwa eine weitere Stunde bei 130 V durchgeführt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel unter kontinuierlichem Schwenken für jeweils 10 min zunächst in Waschpuffer I und anschließend in Waschpuffer II gewaschen. Durch diese Waschschritte wurde das SDS aus dem Gel entfernt und eine partielle Rückfaltung der MMPs in den nativen, aktiven Zustand ermöglicht.
Danach wurde das Gel für 18 h bei 37 °C in Substratpuffer inkubiert.
Anschließend erfolgten die Färbung des Gels für 30 min mit Coomassie Brilliant Blue R-250 sowie die Entfärbung für mehrere Stunden, bis die MMP-2 und MMP-9 aufgrund ihrer Gelatinase-Aktivität als ungefärbte Banden in einem dunklen, gefärbten Hintergrund eindeutig zu erkennen waren.