Beispiel eines fluoreszierenden Gold(I)-Biscarbenkomplexes mit einem Anthracen-

Um die zelluläre Verteilung der äußerst effektiven Gold(I)-Biscarbenkomplexe 23 und 24 (Abschnitt 4.1.1) zu untersuchen bzw. zu visualisieren, wurde ein entsprechendes, Anthracen-substituiertes Imidazol-Derivat hergestellt (25, Abbildung 38). Hierfür wurde einer der Phenylringe im CA-4-abgeleiteten 4,5-Diarylimidazol-Strukturmotiv des NHC-Liganden durch einen 9-Anthracenylrest ersetzt. Auf weitere Substituenten an den beiden Arylresten, wie z.B. Methoxygruppen oder Halogene, wurde in diesem Fall verzichtet. Durch die Einführung des Anthracen-Fluorophors weist der Goldkomplex 25 eine starke, blaue Fluoreszenz auf und kann daher für die Visualisierung seiner intrazellulären Verteilung eingesetzt werden.

Abbildung 38: Struktur des blau-fluoreszierenden Gold(I)-Biscarbenkomplexes 25 mit Anthracen-substituiertem NHC-Liganden.

Vor Durchführung der Lokalisierungsexperimente wurde zunächst die antiproliferative Aktivität von 25 gegenüber verschiedenen Krebszelllinien ermittelt (Tabelle 5). Hierbei erwies sich der Anthracen-Goldkomplex 25 mit IC50-Werten im Bereich von ~1-2 µM gegenüber der mehrfachresistenten KB-V1/Vbl-Zelllinie sowie gegenüber den beiden Kolon-Adenokarzinomzellen HT-29 und DLD-1 im Rahmen der untersuchten Auswahl an Tumor-zellen am unwirksamsten. In den eher sensitiven Zelllinien 518A2 und Panc-1 zeigte der Komplex 25 dagegen eine gesteigerte Toxizität im Bereich von etwa 650 nM. Mit einem IC₅₀ -Wert von nur 200 nM war der Anthracen-Komplex 25 insgesamt gegenüber den MCF-7/Topo-Brustkrebszellen am effektivsten. Da eine ähnlich starke antiproliferative Wirkung gegenüber den MCF-7/Topo-Zellen bereits für die Biscarbenkomplexe 23 und 24 beobachtet wurde, weist diese Art von Gold(I)-NHC-Komplexen anscheinend generell eine gewisse Selektivität für diese Brustkrebszelllinie auf.

Tabelle 5: IC50-Werte [µM] des Anthracen-substituierten Gold(I)-Biscarbenkomplexes 25 gegenüber einer Auswahl an humanen Krebszelllinien. Bei den IC50-Werten handelt es sich um Mittelwerte aus vier Messreihen ± Standardabweichung (SD), die jeweils nach 72 h Inkubation mittels eines MTT-Vitalitätstests bestimmt wurden.

518A2 Panc-1 MCF-7/Topo KB-V1/Vbl HT-29 DLD-1 25 0,64 ± 0,01 0,66 ± 0,08 0,20 ± 0,05 0,96 ± 0,29 1,6 ± 0,1 2,0 ± 0,2 518A2-Melanomzellen, Panc-1-Pankreas-Adenokarzinomzellen, MCF-7/Topo-Mammakarzinom-zellen, KB-V1/Vbl-ZervixkarzinomMCF-7/Topo-Mammakarzinom-zellen, kolorektale HT-29- und DLD-1-Adenokarzinomzellen

Als nächstes wurde überprüft, ob der Anthracen-Komplex 25 auf zellulärer Ebene die gleichen Auswirkungen in 518A2-Melanomzellen zeigt wie die Gold(I)-Biscarbenkomplexe 23 und 24 (vgl. Abschnitte 4.1.1). Bei vergleichbaren Ergebnissen bezüglich des zellulären Wirkmechanismus sollte nämlich auch eine Übertragbarkeit der Ergebnisse aus den Lokalisierungsexperimenten gewährleistet sein. Genau wie die Gold(I)-NHC-Komplexe 23 und 24 induzierte auch das fluoreszierende Derivat 25 eine signifikante Ausbildung von stress fibers in 518A2-Zellen (Abbildung 39), die mit einer Akkumulation der Melanomzellen in der G1-Phase des Zellzyklus einherging (Abbildung 40).

Abbildung 39: Effekte des Anthracen-substituierten Gold(I)-Biscarbenkomplexes 25 (2 µM) auf das Aktinzytoskelett von 518A2-Melanomzellen nach 24 h Inkubation. Das Aktinzytoskelett (grün) wurde mit Hilfe von Alexa Fluor® 488-konjugiertem Phalloidin visualisiert, während die Zellkerne (blau) mit DAPI gefärbt wurden. Maßstabsbalken – 50 µm.

So erhöhte eine Behandlung der 518A2-Melanomzellen mit Komplex 25 den Anteil an Zellen in der G1-Phase von ~45 % (Kontrolle) auf ~64 % (2 µM) bzw. ~69 % (5 µM), während die S- und G2/M-Populationen jeweils beträchtlich verringert wurden. Sowohl die oben beschrie-benen Goldkomplexe 23 und 24 als auch der Anthracen-Komplex 25 lösen also die gleiche Art von Zellzyklusarrest aus. Die zytostatische Aktivität von 25 ist dabei jedoch deutlich geringer als die der Komplexe 23 und 24 (vgl. Abbildung 32).

Auch in vaskulären Endothelzellen (HUVECs) führte der Komplex 25 zur Entstehung von stress fibers, während die Organisation der Mikrotubuli nicht beeinträchtigt wurde (vgl.

Abbildung A-4 im Anhang). Die durch 25 ausgelöste Reorganisation des Aktinzytoskeletts erfolgte also, wie bereits bei den anderen untersuchten Gold(I)-Biscarbenkomplexen, unabhängig von einer direkten Interaktion mit Tubulin bzw. unabhängig von einer Inhibition der Tubulinpolymerisation.

Abbildung 40: Effekte des Anthracen-substituierten Gold(I)-NHC-Komplex 25 (2 µM und 5 µM) auf den Zellzyklus von 518A2-Melanomzellen nach 24 h Inkubation. Dargestellt sind die prozentualen Anteile der Zellen in der G1-, S- und G2/M-Phase sowie der Anteil an apoptotischen Zellen (sub-G1).

Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± SD aus drei unabhängigen Experimenten.

Zusätzlich konnte in Wound-Healing Assays eine antimigratorische Aktivität des Anthracen-Komplexes 25 festgestellt werden, da dieser ebenfalls die Schließung von in Monolayern aus 518A2-Melanomzellen künstlich eingeführten „Wunden“ verhinderte (Abbildung 41 und Tabelle A-9 im Anhang). Während die Zellen die Wunden in den Kontrollansätzen nach 24 h bereits zum größten Teil (~83 %) und nach 48 h auch wieder vollständig geschlossen hatten, war für 518A2-Zellen, die mit dem Goldkomplex 25 behandelt wurden, nach 24 h Inkubation nur eine Wundheilung von etwa 50 % bzw. nach 48 h von lediglich ~64 % zu beobachten.

Somit scheint die inhibitorische Aktivität des Anthracen-substituierten Gold(I)-Biscarben-komplexes 25 im Laufe der Inkubationszeit deutlich zuzunehmen. Dies ist vermutlich aufgrund der signifikanten stress fiber-Induktion^236,237 sowie den damit einhergehenden starken morphologischen Veränderungen der 518A2-Zellen zu erklären, die insbesondere nach 48 h Inkubation mit dem Goldkomplex deutlich zu erkennen sind. Vergrößerungen von Aufnahmen der 518A2-Zellen nach 24 h bzw. 48 h Inkubation mit Komplex 25 im Wound-Healing Assay sind in Abbildung 42 einer entsprechenden Aufnahme mit unbehandelten Kontrollzellen (24 h) gegenübergestellt, um die Veränderungen des morphologischen

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Abbildung 41: Antimigratorische Aktivität des Anthracen-substituierten Gold(I)-Biscarbenkomplexes 25 (2 µM) auf 518A2-Melanomzellen im Wound-Healing Assay. Die lichtmikroskopischen Auf-nahmen sind repräsentativ für zwei (Kontrolle) bzw. drei (25) unabhängige Experimente.

Die 518A2-Melanomzellen besitzen typischerweise eine epithelartige Zellmorphologie, d.h.

bei Ausbildung eines konfluenten Zellrasens zeichnen sich diese durch eine relativ gleich-mäßige, polygonale Form aus und sind klar voneinander abgegrenzt.²⁴⁹ Am Rand der Zellschicht können die 518A2-Zellen dagegen eine unregelmäßigere Morphologie aufweisen.

So sind die stark metastasierenden Melanomzellen u.a. in der Lage gestreckte Fortsätze, sogenannte Lamellopodien, auszubilden, welche sowohl die Anheftung an ein Substrat ermöglichen (hier den Boden der wells) als auch die Zellmigration vermitteln können.²³⁶ Lamellopodienartige Fortsätze der Zellen sind in Abbildung 42 mit schwarzen Pfeilen gekennzeichnet. Während diese bei den Zellen der Kontrolle (24 h) vermehrt auftreten und auf eine aktive Fortbewegung der Zellen schließen lassen, konnten solche Fortsätze nach einer Behandlung der 518A2-Zellen mit dem Anthracen-Komplex 25 für 24 h nur noch bedingt beobachtet werden. Nach 48-stündiger Behandlung mit dem Goldkomplex 25 haben die 518A2-Zellen ihre charakteristische Morphologie schließlich vollständig verloren und zeigen selbst in den konfluenten Bereichen eine deutlich abgerundete Form. Trotz der starken morphologischen Veränderungen haften die Zellen jedoch noch am Boden der wells und bilden darüber hinaus auch viele interzelluläre Kontakte aus. Zusammenfassend kann anhand der gemachten Beobachtungen vermutet werden, dass der Anthracen-Komplex 25 tatsächlich eine echte, antimigratorische Aktivität aufweist und die Wundheilung nicht nur aufgrund der antiproliferativen bzw. zytostatischen Wirkung des Goldkomplexes gehemmt wird.

Abbildung 42: Effekte des Anthracen-substituierten Gold(I)-NHC-Komplexes 25 (2 µM) auf die Morphologie von 518A2-Melanomzellen. Es sind Vergrößerungen der bereits in Abbildung 41 dargestellten Aufnahmen des Wound-Healing Assays gezeigt.

Neben den für 4,5-Diarylimidazol-Gold(I)-Biscarbenkomplexe (vgl. auch Komplexe 23 und 24 in Abschnitt 4.1.1) charakteristischen Effekten auf 518A2-Melanomzellen wurde für den Anthracen-substituierten Biscarbenkomplex 25 in ersten Experimenten des CAM Assays auch eine antivaskuläre Wirkung nachgewiesen (Aufnahmen nicht gezeigt). Die vaskular-disruptive Aktivität von 25 war bei einer eingesetzten Stoffmenge von 2,5 nmol jedoch deutlich geringer als die der CA-4 abgeleiteten Gold(I)-Biscarbenkomplexe. Der Assay sollte mit höheren Konzentrationen von 25 erneut durchgeführt werden, um seine antivaskuläre Aktivität zu bestätigen. Zusätzlich sollte der Komplex auch in vitro an vaskulären Endothel-zellen untersucht werden, da antiangiogene Effekte im Tube Formation Assay einfacher nachzuweisen sind als im CAM-Modellsystem.

Insgesamt bestätigen die aus den oben beschriebenen Untersuchungen zum Wirkmechanismus von 25 gewonnenen Erkenntnisse, dass dieser Anthracen-Komplex die gleichen Effekte auf 518A2-Melanomzellen bzw. Blutgefäße hat, wie die Biscarbenkomplexe 23 und 24. Daher sollte eine Übertragbarkeit der Ergebnisse aus den (Co-)Lokalisierungsexperimenten mit 25 gegeben sein. Zunächst wurde die intrazelluläre Verteilung von Komplex 25 in den humanen 518A2-Melanomzellen und PtK2-Nierenzellen der Beutelratte untersucht (Abbildung 43).

Bereits nach 2 h Inkubation konnte der Goldkomplex anhand seiner blauen, intrinsischen Fluoreszenz in beiden Zellarten eindeutig nachgewiesen werden, wobei er sich am stärksten rings um die Zellkerne herum anreicherte. Vereinzelt konnten jedoch auch punktförmige, fluoreszierende Bereiche in der Zellperipherie beobachtet werden.

Abbildung 43: Zelluläre Verteilung des Anthracen-substituierten Gold(I)-Biscarbenkomplexes 25 (10 µM) nach Behandlung von humanen 518A2-Melanomzellen (oben) und PtK2-Nierenzellen der Beutelratte (unten) für 2 h. Dargestellt sind sowohl die Hellfeld- (links) als auch die Fluoreszenz-aufnahmen (rechts). Maßstabsbalken - 20 µm.

Die ausgeprägte Akkumulation des Komplexes um die Zellkerne herum weist darauf hin, dass dieser entweder innerhalb des Endoplasmatischen Retikulums (ER), welches direkt mit der Hülle des Zellkerns verbunden ist, oder aber im mitochondrialen Netzwerk der eukaryotischen Zellen angereichert wird. Bei den punktförmigen, fluoreszierenden Gebilden im Zytoplasma könnte es sich um Vesikel handeln, in die der Goldkomplex 25, oder auch dessen Metabolite, verpackt wurden, um aus den Zellen ausgeschleust zu werden. Möglicher-weise sind diese Strukturen aber auch einzelne Mitochondrien, die sich von dem großen, zusammenhängenden Netzwerk der Organellen abgespalten haben.

Wie bereits in der Einleitung unter Abschnitt 1.3 beschrieben, akkumulieren Goldkomplexe, bei denen es sich um sogenannte delokalisierte, lipophile Kationen (delocalised, lipophilic cations – DLCs) handelt, verstärkt in den Mitochondrien und stören in diesen Organellen essentielle, zelluläre Prozesse.37,79,96–98

Da der Anthracen-substituierte Gold(I)-NHC-Komplex 25 ebenfalls einen solchen DLC-Komplex darstellt, sollte bewiesen werden, dass sich dieser tatsächlich in den Mitochondrien und nicht dem ER anreichert. Hierfür wurde am Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung in Braunschweig ein Co-Lokalisierungsexperiment in HeLa-Zellen durchgeführt, bei dem die HeLa-Zellen zunächst für 2 h mit 25 behandelt und anschließend mit einem spezifischen, roten Fluoreszenzfarbstoff, welcher die Mitochondrien visualisiert

mikroskopischen Analyse der HeLa-Zellen in Abbildung 44 wird ersichtlich, dass der Anthracen-haltige Gold(I)-Biscarben-komplex 25 wirklich in den Mitochondrien akkumuliert.

So korreliert das blaue Fluoreszenz-signal von 25 mit der roten Fluoreszenz des MitoTrackers im mitochondrialen Netzwerk, was durch eine Überlagerung der beiden Signale (Merge in Abbildung 44) eindeutig nachgewiesen werden konnte. Zusätzlich wurde mit Hilfe der Bildanalysesoftware Volocity 3D Image Analysis Software (Perkin Elmer) der sogenannte Pearson-Korrelationskoeffizient bestimmt, welcher ein Maß für die Überlagerung der beiden Fluoreszenzsignale darstellt und im optimalen Fall, d.h. bei vollständiger Deckung bzw. Co-Lokalisation der Fluoreszenzsignale, einen Wert von +1 annimmt. Bei der Co-Co-Lokalisation des blauen Fluoreszenzsignals des Anthracen-Komplex 25 und der roten Fluoreszenz des MitoTracker-Farbstoffs konnten für einzeln analysierte Zellen Korrelationskoeffizienten im Bereich von ~0,9 ermittelt werden. Somit decken sich die beiden Fluoreszenzsignale in diesen Fällen fast vollständig.

Abbildung 44: Fluoreszenzaufnahmen der mit dem Anthracen-substituierten Gold(I)-NHC-Komplex 25 durchgeführten Co-Lokalisation in HeLa-Zellen. Die Zellen wurden für 2 h mit dem Goldkomplex 25 inkubiert, bevor ihre Mitochondrien mit dem MitoTracker® Deep Red FM-Fluoreszenzfarbstoff visualisiert wurden. Gezeigt sind die Fluoreszenzaufnahmen der intrazellulären Verteilung des Anthracen-Komplex 25 (blau), der mit dem MitoTracker gefärbten Mitochondrien (rot) sowie die Überlagerung der beiden Fluoreszenzsignale (Merge). Maßstabsbalken – 20 µm. Die Co-Lokalisation wurde von Sebastian Schrüfer (M.Sc) und Dr. Verena Fetz am HZI in Braunschweig (AG Chemische Biologie) durchgeführt.

Nachdem eine Anreicherung von 25 in den Mitochondrien eindeutig nachgewiesen werden konnte und diese bei Goldkomplexen häufig mit einer signifikanten Inhibition der TrxR einhergeht,^79,92,106 sollte schließlich überprüft werden, ob es sich bei dem Anthracen-substi-tuierten Gold(I)-Biscarbenkomplex 25 ebenfalls um einen Inhibitor dieses antioxidativen Enzyms handelt.

Tatsächlich konnte in vitro eine signifikante Inhibition der TrxR durch den Gold(I)-Biscarbenkomplex 25 beobachtet werden (EC₅₀ = 0,46 ± 0,08 µM, bestimmt von Dr. Julia Schur, Institut für Medizinische und Pharmazeutische Chemie, TU Braunschweig), die um etwa ein Zehnfaches stärker ist als die Hemmung der TrxR durch den in der Einleitung beschriebenen Benzimidazol-basierten Goldkomplex 13b (EC₅₀ =4,89 ± 1,15 µM).¹⁰⁹

Zusammenfassende Diskussion

Um die zelluläre Verteilung von 4,5-Diarylimidazol-basierten Gold(I)-Biscarbenkomplexen, wie den CA-4 abgeleiteten Gold(I)-NHC-Komplexen 23 und 24, zu untersuchen, wurde mit Hilfe eines 4-(Anthracen-9-yl)-5-phenylimidazol-Liganden ein entsprechendes, blau-fluoreszierendes Derivat (25) hergestellt. Die exakte intrazelluläre Lokalisierung des Gold(I)-Biscarbenkomplexes 25 sollte weitere Hinweise auf den Wirkmechanismus dieser Art von Goldverbindungen geben.

Zunächst wurde die antiproliferative Aktivität von 25 gegenüber einer Auswahl an Tumorzellen untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass 25 eine etwas geringere Zytotoxizität gegenüber den getesteten Zelllinien zeigt als die analogen Biscarbenkomplexe 23 und 24, jedoch ebenfalls weitestgehend submikromolare IC50-Werte erreicht. In 518A2-Melanom-zellen induzierte der Goldkomplex 25 genau wie 23 und 24 eine Ausbildung von stress fibers, welche mit einer signifikanten Akkumulation der Zellen in der G1-Phase des Zellzyklus korreliert. Die Reorganisation des Aktinzytoskeletts nach Behandlung der 518A2-Zellen mit dem Gold(I)-NHC-Komplex 25 ist vermutlich auch für die beobachteten Veränderungen in der Zellmorphologie sowie damit einhergehend für die starke Beeinträchtigung der Zellmotilität im Wound-Healing Assay verantwortlich. Insgesamt waren jedoch höhere Konzentrationen von 25 notwendig, um in den 518A2-Melanomzellen ähnlich starke Effekte auszulösen, wie die Biscarbenkomplexe 23 und 24. Mit Hilfe des CAM Assays konnte in ersten Experimenten bei gleicher eingesetzter Stoffmenge dennoch bereits eine moderate, antivaskuläre Wirkung von 25 nachgewiesen werden.

Da der Anthracen-substituierte Gold(I)-Biscarbenkomplex 25 in den durchgeführten Unter-suchungen also die gleichen Effekte wie die CA-4-abgeleiteten Derivate 23 und 24 zeigte, kann bei dieser Art an Goldverbindungen von einem vergleichbaren Wirkmechanismus aus-gegangen werden. Aus diesem Grund sollte auch die intrazelluläre Verteilung der

Gold(I)-In Co-Lokalisationsexperimenten mit dem fluoreszierenden Komplex 25 konnte eindeutig nachgewiesen werden, dass dieser in den Mitochondrien von HeLa-Zellen akkumuliert.

Darüber hinaus zeigte er eine starke inhibitorische Wirkung auf die Aktivität der TrxR und war dabei weitaus effektiver als andere, literaturbekannte Goldkomplexe dieser Art. Zurzeit werden weiterführende Experimente durchgeführt, um zu überprüfen, ob der Komplex 25, aber auch die Biscarbenkomplexe 23 und 24 eine Mitochondrien-schädigende Wirkung aufweisen. Des Weiteren wird untersucht, ob es sich bei den CA-4-abgeleiteten Gold(I)-Biscarbenkom-plexen 23 und 24 um ähnlich effektive TrxR-Inhibitoren wie 25 handelt.

Interessanterweise beobachteten Citta et al. für einen ähnlichen, Anthracen-substituierten Gold(I)-Monocarbenkomplex (26, Abbildung 45) eine starke Akkumulation in den Zellkernen verschiedener Tumorzellen.²⁵⁰ Dennoch konnte zumindest in vitro eine signifikante Inhibition der TrxR durch 26 nachgewiesen werden. Aus diesem Grund werden derzeit der zu 25 analoge, ungeladene Monocarbenkomplex 27a sowie dessen kationisches PPh3-Analogon 27b hergestellt (Abbildung 45), um zu überprüfen, ob diese Komplexe eine ähnliche intrazelluläre Verteilung und einen vergleichbaren Wirkmechanismus wie der Biscarbenkomplex 25 aufweisen oder sich in Tumorzellen anders verhalten als dieser. Vermutlich spielen hierbei sowohl die unterschiedliche Lipophilie der Goldkomplexe 25 und 27 als auch ihr kationischer bzw. neutraler Charakter, wie bereits bei vielen anderen Goldverbindungen beobachtet,⁷⁹ eine essentielle Rolle.

Abbildung 45: Strukturen der Anthracen-substituierten Gold(I)-Monocarbenkomplexe 26 ²⁵⁰ und 27.

4.1.3 Fluor-substituierte Gold(I)-Carbenkomplexe mit 4,5-Diarylimidazol-Strukturmotiv Wie bereits in der Einleitung unter Abschnitt 1.3 beschrieben, gibt es verschiedene Möglichkeiten die biologische Aktivität von Goldkomplexen, aber auch von anderen metall-basierten oder rein organischen Wirkstoffkandidaten, zu optimieren. Hierbei ist vor allem die Modulation der physikochemischen Eigenschaften der Verbindungen entscheidend, da diese für die Verteilung im Organismus, die Aufnahme in Zellen, ihre Interaktion mit dem entsprechenden, zellulären target sowie auch die metabolische Stabilität der Verbindungen eine essentielle Rolle spielen.^37,98

Aufgrund der im Vergleich zu den anderen Halogenen außergewöhnlichen Eigenschaften des Fluoratoms, wie zum Beispiel seiner geringen Größe, starken Elektronegativität und vergleichsweise hohen Lipophilie, haben Fluor- bzw. Fluor-haltige Substituenten einen wesentlichen Einfluss auf die physikochemischen Eigenschaften von organischen Verbin-dungen.^251–256 So können Fluor-Substitutionen die Lipophilie oder metabolische Stabilität von Wirkstoffkandidaten erhöhen und somit auch eine gesteigerte biologische Aktivität herbeiführen. Darüber hinaus kann durch die rationale Einführung von Fluor bzw. Fluor-haltigen Substituenten an geeigneten Positionen von Leitstrukturen mit bekannten Wirkmechanismen zum Beispiel eine verbesserte Protein-Ligand-Wechselwirkung erzielt werden, die ebenfalls zu einer Steigerung der Effektivität des entsprechenden Wirkstoffs führen kann.

Aus diesen Gründen, aber auch durch die Entwicklung von weitaus sichereren und selektiveren Fluorierungs-Agenzien seit den 1970er Jahren,254,257–259

hat die Herstellung von Fluor-haltigen Substanzen in der medizinischen Chemie in den letzten 40 Jahren deutlich zugenommen. So machen Fluor-substituierte Verbindungen mittlerweile etwa 25 % aller derzeit auf dem Markt befindlichen Pharmazeutika zur Behandlung verschiedenster Erkrankungen aus, während bis 1957 noch kein einziger fluorierter Wirkstoff zugelassen war.252,254,255

Beispiele für solche Fluor-haltigen Medikamente sind die Antidepressiva Fluoxetin (Prozac) und Escitalopram (Lexapro), der Cholesterin-senkende Wirkstoff Atorvastatin (Lipitor) sowie das Antibiotikum Ciprofloxacin (Ciprobay).^254,256 Auch bei der Synthese neuer Wirkstoffkandidaten für die Tumortherapie werden mittlerweile vermehrt Fluor-Substitutionen verwendet, um die Pharmakokinetik der Verbindungen sowie die spezifischen Wechselwirkungen mit ihren individuellen, zellulären targets zu optimieren.

Zu den in der modernen Krebstherapie erfolgreich eingesetzten Fluor-haltigen Chemo-therapeutika gehören neben dem Fluoruracil-prodrug Capecitabin, bei dem es sich um einen sogenannten Antimetaboliten handelt, zum Beispiel auch verschiedene (Tyrosin-) Kinase-inhibitoren, wie Gefitinib (Iressa), Sorafenib (Nexavar) oder Sunitinib (Sutent).²⁵⁶

Um zu überprüfen, ob von Fluor-Substituenten bei 4,5-Diarylimidazol-basierten Gold(I)-NHC-Komplexen, wie den CA-4-abgeleiteten Komplexen in Abschnitt 4.1.1, grundsätzlich auch zu einer Steigerung der biologischen Aktivität führen, wurden die Derivate 28-30 synthetisiert (Abbildung 46).

Abbildung 46: Strukturen der Gold(I)-NHC-Komplexe 28-30 mit ihren Fluor-substituierten 4,5-Diarylimidazol-Liganden.

Ihre Effektivität gegenüber einer Auswahl an Krebszelllinien aus vier verschiedenen Entitäten sowie gegenüber vaskulären Endothelzellen (HUVECs) wurde mit Hilfe eines MTT- Proliferationsassays untersucht. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 6 zusammengefasst. Bei den in Abschnitt 4.1.1 beschriebenen CA-4-abgeleiteten Monocarben-komplexen konnte bereits beobachtet werden, dass die Einführung einer Brom-Substitution zu einer signifikanten Steigerung der Effektivität der Goldkomplexe gegenüber den untersuchten Krebszelllinien führte. So weisen beide Brom-Derivate 21b und 22c, mit Ausnahme der Werte für die KB-V1/Vbl-Zervixkarzinomzelllinie, sehr ähnliche IC₅₀-Werte im einstelligen mikromolaren Bereich auf (vgl. Tabelle 1, Abschnitt 4.1.1). Die Reste an den Stickstoffatomen des Imidazolrings (Methyl in 21b bzw. Ethyl in 22c) hatten in diesem Fall keinen Einfluss auf die Aktivität der Komplexe. Ähnliche Ergebnisse wurden auch für die beiden Fluor-haltigen Monocarbenkomplexe 28 erhalten. Beide Komplexe zeigen eine gute antiproliferative Aktivität mit IC₅₀-Werten im einstelligen mikromolaren Bereich gegenüber den getesteten Krebszelllinien sowie den HUVECs. Lediglich gegenüber den beiden resistenten Zelllinien KB-V1/Vbl und DLD-1 sind die Komplexe 28 nur im unteren,

So wurde die Effektivität durch die Einführung der N-Ethyl-Reste in 28b, wie schon bei den CA-4-basierten Gold(I)-Monocarbenkomplexen (21b und 22c), nicht weiter erhöht. Da sich die N-Ethyl-Substitutionen jedoch in den CA-4-analogen Biscarben-komplexen 24, insbesondere auch in Bezug auf die Aktivität gegenüber der mehrfach resistenten KB-V1/Vbl-Zelllinie, als äußerst vielversprechend erwiesen hatten, wurden diese beibehalten und zunächst die beiden Derivate 29 und 30a mit dem neuartigen, fluorierten 4,5-Diarylimidazol-Liganden hergestellt. Während der Komplex 29 neben dem NHC-Liganden einen PPh₃-Rest am Goldzentrum trägt, handelt es sich bei der Verbindung 30a um den analogen Biscarbenkomplex mit zwei identischen NHC-Liganden.

Tabelle 6: IC50-Werte [µM] der Fluor-substituierten Gold(I)-NHC-Komplexe 28-30 gegenüber einer Auswahl an humanen Krebszelllinien und HUVECs. Bei den IC50-Werten handelt es sich um Mittelwerte aus vier Messreihen ± SD, die jeweils nach 72 h Inkubation mittels eines MTT-basierten Vitalitätstests bestimmt wurden.

28a 28b 29 30a 30b

518A2 3,5 ± 0,2 2,5 ± 0,6 0,19 ± 0,04 0,13 ± 0,05 0,18 ± 0,07 Panc-1 3,4 ± 0,1 3,3 ± 0,2 0,20 ± 0,03 0,19 ± 0,01 0,26 ± 0,03 MCF-7/Topo 3,4 ± 0,1 3,9 ± 0,3 0,41 ± 0,06 0,14 ± 0,01 0,20 ± 0,02 KB-V1/Vbl 20,8 ± 1,0 13,9 ± 0,6 2,0 ± 0,3 2,7 ± 0,0 4,3 ± 0,1

HCT-116 3,2 ± 0,8 4,0 ± 0,3 n.b. 0,30 ± 0,06 0,49 ± 0,13 HT-29 4,0 ± 0,3 6,5 ± 0,7 1,2 ± 0,2 0,39 ± 0,02 0,46 ± 0,04 DLD-1 7,2 ± 0,1 10,1 ± 0,8 1,5 ± 0,2 1,4 ± 0,1 1,4 ± 0,1 HUVEC 2,7 ± 0,9 3,2 ± 0,2 0,33 ± 0,04 0,57 ± 0,10 0,22 ±0,03

518A2-Melanomzellen, Panc-1-Pankreas-Adenokarzinomzellen, MCF-7/Topo-Mammakarzinom-zellen, KB-V1/Vbl-ZervixkarzinomMCF-7/Topo-Mammakarzinom-zellen, HCT-116-KolonkarzinomMCF-7/Topo-Mammakarzinom-zellen, kolorektale HT-29- und DLD-1-Adenokarzinomzellen, HUVEC – humane, vaskuläre Endothelzellen; n.b. – nicht bestimmt

Beide Komplexe (29 und 30a) weisen gegenüber den untersuchten Tumorzelllinien und vaskulären Endothelzellen sehr ähnliche IC50-Werte auf, die überwiegend im unteren, dreistelligen nanomolaren Bereich liegen. Die Goldkomplexe 29 und 30a sind somit etwa drei- bis 28-fach aktiver als ihr analoger Monocarbenkomplex 28b. Auch gegenüber den eher resistenten KB-V1/Vbl- und DLD-1-Zellen sind die beiden Gold(I)-NHC-Komplexe 29 und 30a im Vergleich zu 28b deutlich wirksamer (ca. drei- bis siebenfach aktiver).

Insgesamt war der Gold(I)-Biscarbenkomplex 30a dabei meistens geringfügig aktiver als sein PPh₃-Analogon 29. Die Einführung einer weiteren Fluor-Substitution am zweiten Phenylring des NHC-Liganden konnte die antiproliferative Aktivität des Biscarbenkomplexes 30b im Vergleich zu 30a nicht weiter steigern, sondern verringerte diese sogar geringfügig. Somit wurden die beiden Goldkomplexe 29 und 30a, welche die aktivsten Verbindungen dieser Serie darstellen und eine ähnlich gute antiproliferative Aktivität wie die CA-4-abgeleiteten Gold(I)-Biscarbenkomplexe 23 und 24 aufweisen, für weiterführende Analysen des Wirkmechanismus ausgewählt.

Zunächst wurden die Effekte der Komplexe 29 und 30a auf die Organisation des Aktinzytoskeletts in 518A2-Melanomzellen und in HUVECs untersucht (Abbildung 47).

Hierbei wurde, wie auch schon für die CA-4-abgeleiteten

Hierbei wurde, wie auch schon für die CA-4-abgeleiteten