Der Zellzyklus beschreibt den Vorgang eines geordnet ablaufenden Prozesses, den jede eukaryotische Zelle im Rahmen ihres Wachstum und der Proliferation durchläuft (Abbildung 18).168–170 Dieser kann in vier verschiedene Phasen unterteilt werden, welche zyklisch nacheinander durchlaufen werden. Während in der S-Phase des Zellzyklus die DNA der Zellen repliziert wird, bereiten sich diese in der darauffolgenden G2-Phase (G – gap, Lücke) auf die Mitose (M-Phase) vor, in der schließlich die gleichmäßige Aufteilung der DNA und des Zytoplasmas auf die beiden entstehenden Tochterzellen erfolgt.
Diese gehen im Anschluss an die Mitose in die G1-Phase über, welche für das Zellwachstum genutzt wird und den zeitlich gesehen längsten Abschnitt des Zellzyklus darstellt. Zellen, die sich z.B. aufgrund ihrer Ausdifferenzierung nicht mehr teilen, können von der G1-Phase in einen Art Ruhezustand übergehen, den man als G0-Phase bezeichnet. Spezifische äußere und innere Signale, welche die erneute Zellteilung anregen, sind dann notwendig, damit G0-Zellen über die G1-Phase zurück in den Zellzyklus eintreten können. Die Kontrolle und Regulation des Zellzyklus wird durch Cyclin-abhängige Kinasen (cyclin-dependent kinase, Cdk) bzw.
deren Cyclin-Komplexe (Cyclin-Cdks) vermittelt, die als Kontrollpunkte wirken und für die Initiation der einzelnen Phasen essentiell sind.168–170
Abbildung 18: Schematische Darstellung des Zellzyklusablaufs. Die Größen der Abschnitte repräsentieren die relative Dauer der einzelnen Zellzyklusphasen.
So stellen diese regulatorischen Enzyme sicher, dass der nächste Abschnitt des Zellzyklus nur dann begonnen wird, wenn der vorhergehende vollständig und korrekt abgeschlossen ist. Ist dies nicht der Fall, so können an den Kontrollpunkten Unterbrechungen des Zellzyklus erfolgen (Arretierung), die bei zu langer Dauer zu einer Initiation der Apoptose führen. Den wichtigsten Kontrollpunkt des Zellzyklus stellt dabei der sogenannte Restriktionspunkt in der G1-Phase dar. Dieser muss passiert werden, damit eine Zelle die restlichen Phasen des Zellzyklus durchlaufen kann.
Aufgrund ihrer erhöhten Zellteilungs- und/oder einer verminderten Apoptoserate besitzen Tumorzellen die Eigenschaft sich unkontrolliert zu vermehren. Daher haben Wirkstoffe, die Zellen in einer Phase des Zellzyklus arretieren (Zytostatika) und hierdurch letztendlich den programmierten Zelltod einleiten, in der Chemotherapie eine große Bedeutung erlangt. Ob die zu untersuchenden Gold(I)- und Pt(II)-Carbenkomplexe die Fähigkeit besitzen, eine solche Arretierung der Zellen auszulösen, sollte beispielhaft an den 518A2-Melanomzellen mittels einer Propidiumiodidfärbung (PI-Färbung) durchflusszytometrisch analysiert werden.
Hierfür wurden die 518A2-Zellen in 6-well-Platten ausgesät (1 × 105 Zellen/mL; 3 mL pro well) und über Nacht im Brutschrank inkubiert. Nach Zugabe der Testverbindungen in geeigneten Konzentrationen folgte eine weitere Inkubation der Melanomzellen für 24 h. Den Negativkontrollen wurden analoge Mengen des jeweiligen Lösungsmittels (DMF oder DMSO) zugesetzt. Im Anschluss an die Inkubation mit den Metallkomplexen wurde das Medium abgenommen und in eisgekühlte Zentrifugenröhrchen überführt. Die Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen, welches ebenfalls in die Röhrchen überführt wurde, und dann durch Zugabe von Trypsin/EDTA-Lösung sowie Inkubation im Brutschrank bei 37 °C vom Boden der wells abgelöst. Die Zellsuspension wurde anschließend zum Abstoppen der enzymatischen Reaktion direkt in das zuvor abgenommene Medium (und PBS) gegeben.
Schließlich wurden die wells ein weiteres Mal mit PBS gewaschen, um auch die hierin noch verbliebenen Zellen in das Zentrifugenröhrchen zu überführen. Nach einem Zentrifugations-schritt bei 300 g (5 min, 4 °C) wurde das überstehende Medium verworfen, die 518A2-Zellen in jeweils 1 mL eiskaltem Ethanol fixiert und in 2 mL-Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt.
Die Proben wurden bis zur Propidiumiodidfärbung und durchflusszytometrischen Analyse bei 8 °C im Kühlschrank gelagert, mindestens jedoch über Nacht. Vor der Färbung wurden die Zellen pelletiert (2400 rpm, 5 min, RT), das Ethanol verworfen und die 518A2-Melanomzellen zur Rehydratisierung für 5 min mit 1 mL PBS versetzt. Die Zellen wurden erneut abzentrifugiert (2400 rpm, 5 min, RT), anschließend in 200 µL Propidiumiodid-Färbelösung resuspendiert und für 30 min bei 37 °C im Brutschrank inkubiert. Je nach Pelletgröße wurden die Zellen mit 300-800 µL PBS verdünnt und in entsprechende Proben-röhrchen zur Messung am Durchflusszytometer überführt.
Die anschließende Messung von 10.000 Einzelzellen erfolgte am Durchflusszytometer bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einer detektierten Emissionswellenlänge von 620 nm (CXP Acquisition Software, Beckman Coulter). Hierbei wurden drei verschiedene Parameter, nämlich das Vorwärtsstreulicht (forward scatter, FS), das seitliche Streulicht (side scatter, SC; Messung im 90° Winkel zum Ausgangsstrahl) und die Fluoreszenzintensität (FL3), der mit Propidiumiodid gefärbten Zellen gemessen. Während das Vorwärtsstreulicht (FS) ein Maß für die Größe der Zellen darstellt, beschreibt die Menge an seitlich abgelenktem Licht (SS) die Granularität, d.h. die Komplexität einer Zelle. Die bei 620 nm detektierte Fluoreszenztintensiät (FL3) ist direkt proportional zum DNA-Gehalt der analysierten Zellen.
Die Auswertung der aufgenommenen Daten erfolgte mit Hilfe der CXP Analysis Software (Beckman Coulter). Zur Bestimmung der Hauptpopulation der Zellen ist in Abbildung 19-A die Granularität der Einzelzellen gegen die Zellgröße (SS Lin/FS Lin) aufgetragen und eine Begrenzungslinie, ein sogenanntes gate, um die entsprechend ermittelte Hauptpopulation gelegt worden.
Abbildung 19: Zellzyklusanalyse von mit Propidiumiodid gefärbten 518A2-Melanomzellen mittels Durchflusszytometrie. (A) Auftragung des Vorwärtsstreulicht (FS Lin) gegen das Seitwärtsstreulicht (SS Lin) zur Bestimmung der Hauptpopulation. (B) Auswahl der Einzelzellen unter Ausschluss von Zelldubletten durch Auftragung des Höhensignals der Fluoreszenz (AUX) gegen das Flächensignal (FL3 Lin, Fluoreszenzintensität). (C) Charakteristisches Zellzyklushistogramm einer 518A2-Melanomzellpopulation nach Auftragung der Anzahl an Einzelzellen mit einem bestimmten Fluoreszenzsignal gegen die Fluoreszenzintensität (FL3 Lin), welches die Verteilung der 518A2-Zellen in den einzelnen Phasen des Zellzyklus (G1-, S- und G2/M-Phase) sowie den Anteil an apoptotischen Zellen (sub-G1-Bereich) darstellt.
Durch Auftragung der Höhen- und Flächensignale der Propidiumiodidfluoreszenz gegeneinander (vgl. Abbildung 19-B) können sogenannte Zelldubletten von der Auswertung der durchflusszytometrischen Daten ausgeschlossen werden, da diese ein verfälschtes Ergebnis liefern würden. Bei Zelldubletten handelt es sich um zwei Zellen in der G1-Phase (einfacher DNA-Gehalt), die aneinander haften (es war keine Vereinzelung möglich) und hinsichtlich der Intensität der gemessenen Fluoreszenz (Peakfläche) dasselbe Signal liefern, wie eine einzelne Zelle in der G2-Phase (doppelter DNA-Gehalt). Lediglich die Peakhöhe des Fluoreszenzsignals unterscheidet sich bei diesen beiden Fällen, weshalb G1-Zelldubletten mit einer geringeren Peakhöhe von G2/M-Einzellzellen differenziert werden können. Aufgrund ihres identischen DNA-Gehalts können die G2- und die M-Phase des Zellzyklus bei der durchflusszytometrischen Analyse nicht unterschieden werden und werden daher als G2/M-Phase zusammengefasst. Trägt man die Anzahl an Einzelzellen mit einem bestimmten Fluoreszenzsignal gegen die entsprechende, linear skalierte Fluoreszenzintensität (FL3 Lin)
Nach Anpassung der Markerregionen (Position und Länge) der einzelnen Zellzyklusphasen (G1-, S- und G2/M-Phase) sowie des sub-G1-Bereichs (apoptotische Zellen) in den Negativ-kontrollen wurden diese auf die behandelten Proben übertragen. Hierdurch wird es möglich, Veränderungen in der prozentualen Verteilung der Zellen in den einzelnen Phasen des Zellzyklus und des Anteils an apoptotischen Zellen nach Behandlung mit den Metall-komplexen zu erkennen.