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Zusammenfassend  wurden  zahlreiche  Purin  -­  basierte  2´-­Deoxynucleotide  auf  ihre  Anwendbarkeit   für   die   Detektion   von   5mC   getestet,   wodurch   Position   6   als   am   vielversprechendsten   für   weitere   Modifizierungen   identifiziert   wurde.   Daraufhin   wurde   eine   Vielzahl   an   6-­modifizierten   dGTP   Analoga   synthetisiert,   die   sowohl   variierende   H-­Brückenbindungs-­Eigenschaften,   als   auch   verschieden   große   Modifikationen  mit  unterschiedlichen  sterischen  Ansprüchen  aufweisen.    

Da  nun  eine  Vielzahl  an  verschiedenartig  modifizierten  Nukleotiden  zur  Verfügung  stand,  wurden   diese  in  Bezug  auf  ihr  Diskriminierungsverhalten  zwischen  C  und  5mC  getestet.  Eine  Diskriminierung   sollte   durch   den   Einbau   dieser   Nukleotide   mit   Hilfe   von   verschiedenen   DNA-­Polymerasen   zustande   kommen.   Alle   modifizierten   Nukleotide   wurde   von   allen   getesteten   DNA-­Polymerasen   (KlenTaq,   KOD  exo   und   9°   Nord   exo)   akzeptiert,   auch   wenn   die   modifizierten   Derivate   mit   verminderter   Effizienz   umgesetzt   wurden.   Die   Anwendung   der   KlenTaq   DNA-­Polymerase   führte   zu   keinen   nennenswerten   Unterschieden   der   Einbaueffizienzen   gegenüber   C   und   5mC.   Im   Gegensatz   dazu,   konnten   für   beide   B-­Familien   DNA-­Polymerasen   vielversprechende   Tendenzen   mit   bevorzugtem   Einbau  gegenüber  C  beobachtet  werden.  Im  Allgemeinen  wurde  eine  erhöhte  Diskriminierung  erreicht,   wenn  die  Sperrigkeit  der  in  Position  6  eingeführten  Modifikationen  bis  zu  einem  gewissen  Grad  erhöht   wurde,  auch  wenn  die  Einbaueffizienzen  gleichzeitig  sanken.  Diese  Entdeckungen  legen  nahe,  dass   das  Erkennen  von  5mC  ein  generelles  Phänomen  ist,  das  nicht  an  eine  bestimmte  Modifikation  oder   eine  bestimmte  DNA-­Polymerase  gebunden  ist.    

Die  beste  Diskriminierung  zwischen  C  und  5mC  konnte  durch  die  DNA-­Polymerase  KOD  exo  und  das   Nukleotid  O6-­Ethyl-­dGTP  1b   erzielt   werden.   Diese   Ergebnisse   wurden   durch   steady-­state   Kinetiken   bestätigt,   die   einen   4.2   fach   effizienteren   Einbau   gegenüber   C   als   gegenüber   5mC   zeigten.  

Nachfolgende   Selektivitäts-­Studien   offenbarten   einen   Selektivitäts-­Verlust   von   allen   in   Position   6   modifizierten  Nukleotiden  zwischen  C  und  T.  Dadurch  wird  die  Anwendung  dieser  Ergebnisse  für  eine   Sequenzierung   durch   einen   einzigen   Lauf   verhindert.   Diese   Effekte   können   jedoch   in   der   positions-­

spezifischen  Detektion  von  5mC  Anwendung  finden.[1]    

 

Da   die   Arbeit   mit   Radioaktivität   offensichtliche   Nachteile   birgt   und   die   Analyse   von   Primer-­

Verlängerungs-­Reaktionen  über  denaturierende  PAGE  den  Durchsatz  erheblich  beeinträchtigt,  haben   wir   durch   den   Einsatz   von   Fluoreszenz-­markierten   Primern   und   Kapillarelektrophorese   eine   neue   Methode   entwickelt.   Durch   die   Optimierung   der   Lauf-­Parameter   konnten   wir   eine   Einzel-­Nukleotid-­

Auflösung  erreichen  und  somit  eine  robuste  Methode  präsentieren,  die  die  gleichzeitige  Analyse  von   über  hundert  Reaktionen  ermöglicht.  Diese  Methode  wurde  genutzt  um  alle  modifizierten  Nukleotide  in   Kombination  mit  der  DNA  Polymerase  9°  Nord  exo  für  den  Einsatz  zur  5mC  Detektion  zu  testen.    

 

Beachtliche  Unterschiede  in  Einbaueffizienzen  gegenüber  C  und  5mC  konnten  durch  den  Einsatz   von   modifizierten   Nukleotiden   erreicht   werden.   Die   besten   Effekte   konnten   hierbei   durch   die   in   Position  6  modifizierten  Nukleotide  erzielt  werden.  Diese  zeigten  jedoch  keine  Selektivität  zwischen  C   und   T.   Eine   andere   Klasse   an   modifizierten   Nukleotiden   -­   modifiziert   in   Position   8   -­   zeigt   weniger  

5.  Zusammenfassung   98    

ausgeprägte   Trends   in   Bezug   auf   Diskriminierung,   weist   jedoch   Selektivität   für   C   auf.   Daher   wurde   beschlossen,   diese   Modifikationen   zu   kombinieren,   um   Nukleotide   zu   erhalten,   die   unter   Erhalt   ihrer   Selektivität  für  C  eine  erhöhte  Diskriminierung  zwischen  C  und  5mC  aufweisen.  Nach  Synthese  dieser   in  Position  6  und  8  doppelt  modifizierten  Nukleotide,  wurden  diese  auf  ihr  Einbauverhalten  durch  DNA-­

Polymerasen   untersucht.   Hierbei   musste   jedoch   festgestellt   werden,   dass   diese   Nukleotide   von   KOD  exo   zwar   eingebaut   wurden,   jedoch   weder   erhöhte   Diskriminierung,   noch   Selektivität   für   C   aufwiesen.    

 

Durch  den  Verlust  der  Selektivität  der  diskriminierenden  Nukleotide,  können  sie  ausschließlich  zur   positions-­spezifischen   Detektion   von   5mC   eingesetzt   werden.   Daher   wurde   im   nächsten   Schritt   ein   Fokus   auf   die   Modifikation   der   verwendeten   DNA-­Polymerase   gelegt.   Hierzu   sollten   DNA-­

Polymerasen   Mutanten   identifiziert   werden,   die   eine   erhöhte   Diskriminierung   zwischen   C   und   5mC   aufweisen.   Da   DNA-­Polymerasen   5mC   normalerweise   ohne   Probleme   replizieren   können   und   die   Methylgruppe  in  Position  5  nicht  mit  der  Watson-­Crick  Basenpaarung  interferiert,  ist  dies  jedoch  eine   herausfordernde  Aufgabe.  Claudia  Huber  und  Martina  Adam  haben  hierzu  34  verschiedene  KOD  exo  

Bibliotheken  generiert,  in  dem  sie  verschiedene  Positionen  in  unterschiedlichen  Domänen  über  „site-­

directed“   Mutagenese   variiert   haben.   Nachdem   diese   Mutanten   auf   ihre   Aktivität   getestet   worden   waren,   wurden   ihre   Diskriminierung   zwischen   C   und   5mC   untersucht.   Hierfür   wurden   dGTP   und   8-­

vinyl-­dGTP  3  eingesetzt.  Die  Position  G245  wurde  als  vielversprechendste  Stelle  gefunden.  Durch  die   Umsetzung   von  3   konnte   keine   verbesserte   Diskriminierung   erzielt   werden.   Die   Einbaueffizienzen   sanken  jedoch  deutlich.  Daher  wurde  der  Fokus  im  Folgenden  auf  die  Umsetzung  von  dGTP  gelegt.  

Nachdem  steady-­state  Kinetiken  für  den  Einbau  von  dGMP  gegenüber  von  C  und  5mC  durchgeführt   wurden,   konnte   die   Mutante   G245D   als   Variante   mit   den   besten   Diskriminierungs-­Eigenschaften   bestätigt   werden.   Zusätzlich   konnte   gezeigt   werden,   dass   die   Selektivität   dieser   Mutante   für   C   erhalten   geblieben   war.   Um   diese   Effekte   für   Sequenzierungen   anwenden   zu   können,   wurde   ein   weiteres   Nukleotid   synthetisiert,   an   dessen   terminalem   Phosphat   ein   Fluoreszenz-­Farbstoff   angebracht   wurde   (32).   Das   Verhalten   dieses   Nukleotides   in   DNA-­Polymerasen-­katalysierten   Experimenten   wurde   wiederum   anhand   von   steady-­state   Kinetiken   untersucht.   Diese   Studien   haben   gezeigt,   dass   Nukleotid  32   von   G245D   mit   einer   4.1   fach   höheren   katalytischen   Effizienz   (kcat)   gegenüber  C  als  gegenüber  5mC  eingebaut  wird.  Allerding  wurde  ebenfalls  gezeigt,  dass  der  Einsatz   des  modifizierten  Nukleotides  32  die  DNA  Polymerasen  deutlich  verlangsamt  hat.  Um  die  Anwendung   dieser  Ergebnisse  in  SMRT  Sequenzierungen  zu  ermöglichen,  muss  die  Effizienz  des  Umsatzes  des   Nukleotids  32  durch  die  KOD  exo  Variante  verbessert  werden.  In  der  Literatur  wurde  bereits  gezeigt,   dass   eine   zusätzliche   Phosphatgruppe   in   der   Phosphatkette   des   Nukleotids   die   Fähigkeit   der   DNA-­

Polymerasen  diese  Nukleotide  umzusetzen  erheblich  gesteigert  wird.  Aus  diesem  Grund  sollten  in  der   Zukunft  weitere  Derivate  des  Nukleotids  32  mit  zusätzlichen  Phosphatgruppen  synthetisiert  werden.    

 

Aktuelle   Forschungen   legen   die   Vermutung   nahe,   dass   5hmC   nicht   nur   als   Intermediat   in   der   Demethylierung  von  5mC,  sondern  auch  selbst  als  epigenetischer  Marker  dient.  Da  wir  eine  Vielzahl   an   modifizierten   Nukleotiden   synthetisiert   haben,   sollten   diese   ebenfalls   für   die   Detektion   von   5hmC   getestet   werden.   Für   die   Diskriminierung   zwischen   C   oder   5mC   und   5hmC   wurden   ähnliche  

Tendenzen   beobachtet.   Alle   Nukleotide   wurden   von   allen   DNA-­Polymerasen   eingebaut,   wenn   auch   mit   verminderter   Effizienz.   Durch   die   DNA-­Polymerase   KlenTaq   konnte   keine   bedeutende   Diskriminierung   beobachtet   werden.   Im   Gegensatz   dazu   wurden   wiederum   deutliche   Diskriminierungen  zwischen  C,  5mC  und  5hmC  beobachtet,  wenn  die  B-­Familien  DNA-­Polymerasen   KOD  exo  und  9  °Nord  exo  eingesetzt  wurden.  Hierbei  konnte  gezeigt  werden,  dass  alle  Nukleotide  -­  

einschließlich  dGMP  -­  deutlich  schlechter  gegenüber  5hmC  als  gegenüber  von  C  eingebaut  wurden.    

 

Modifizierte   Nukleotide   sind   nicht   nur   in   DNA   sondern   auch   in   RNA   bekannt.   Über   150   verschiedene   Modifikationen   konnten   bereits   in   zellulärer   RNA   nachgewiesen   werden,   wobei   diese   teilweise   sehr   geringe   Konzentrationen   aufweisen.   Dies   erschwert   deren   Detektion   erheblich.   Nina   Blatter   entwickelte   eine   KlenTaq   Mutante   (RT-­KTq2),   die   DNA   ausgehend   von   einem   RNA   Templat   synthetisieren  kann.  Daher  entschieden  wir,  die  Vielzahl  an  modifizierten  Nukleotiden  in  Kombination   mit  dieser  Mutante  zur  Detektion  von  RNA-­Modifikationen  einzusetzen.    

Die   Methylierung   der   2´-­OH   Gruppe   der   Ribose   ist   eine   der   weitverbreitetsten   RNA-­Modifikationen.  

Daher   haben   wir   alle   modifizierten   Nukleotide   für   die   Anwendung   zur   Detektion   von   RNA-­

Modifikationen  in  Verbindung  mit  der  KlenTaq  Mutante  RT-­KTq2  getestet.  Wie  wir  bereits  beobachten   konnten,   nahm   die   Einbaueffizienz   der   modifizierten   Nukleotide   mit   zunehmender   Größe   der   Modifikationen  ab.  Manche  Nukleotide  konnten  auch  nach  deutlicher  Erhöhung  der  DNA-­Polymerasen   Konzentration  nicht  eingebaut  werden.  Interessanterweise  konnte  bereits  für  das  unmodifizierte  dGMP   ein   1.42   höherer   Einbau   gegenüber   C   als   gegenüber   2´-­OMe-­C   beobachtet   werden.   Die   höchste   Diskriminierung   (Faktor   7.40)   konnte   allerdings   durch   den   Einbau   des   Nukleotids  3   erzielt   werden.  

Wiederum  wurden  alle  Nukleotide  bevorzugt  gegenüber  dem  unmodifizierten  C  eingebaut.    

 

Eine   weitere   wichtige   RNA-­Modifikation,   Pseudouridin   Ψ,   konnte   mittlerweile   mit   verschiedenen   menschlichen   Krankheiten   assoziiert   werden.   Daher   sind   auch   zur   Detektion   dieser   Modifikationen   einfache  und  robuste  Methoden  von  Nöten.  Da  bereits  erkannt  wurde,  dass  in  6-­Position  modifizierte   Nukleotide  bevorzugt  gegenüber  von  T  eingebaut  werden,  wurden  diese  Nukleotide  auch  in  Bezug  auf   die  Detektion  von  Ψ  untersucht.  Nicht  alle  modifizierten  Nukleotide  konnten  von  RT-­KTq2  gegenüber   von   U   oder   Ψ   eingebaut   werden.   Die   Nukleotide,   die   eingebaut   wurden   zeigten   jedoch   sehr   interessante   Effekte.   Derivate,   welche   der   Struktur   von   dATP   und   dessen   H-­Brücken   Basenpaarungsmuster  mehr  glichen  als  dem  von  dGTP  zeigten  einen  bevorzugten  Einbau  gegenüber   von  U.  Andere  Nukleotide  hingegen  bewiesen  einen  bevorzugten  Umsatz  gegenüber  von  Ψ.  Dies  ist   somit   das   erste   Mal,   dass   ein   effektiverer   Einbau   eines   Nukleotides   gegenüber   einer   Nukleinsäure-­

Modifikation   und   somit   eine   invertierte   Diskriminierung   beobacht   werden   konnte.   Nachdem   diese   Effekte   durch   steady-­state   Kinetiken   verifiziert   werden   konnten,   erwies   sich   Nukleotid  9n   mit   einem   15-­fach  effektiverem  Umsatz  gegenüber  Ψ  als  gegenüber  U  als  vielversprechendstes  Derivat.  Diese   beachtliche   Diskriminierung   konnte   im   Folgenden   für   die   Entwicklung   einer   neuartigen   Detektionsmethode   auf   artifizieller   RNA   eingesetzt   werden.   Um   diese   sehr   viel   versprechende   Methode   auf   RNA   Extrakte   übertragen   zu   können,   müssen   jedoch   noch   einige   Untersuchungen   angestellt   werden,   da   Nukleotid  9n   nicht   gegenüber   von   RNA   Extrakten   als   Templat   umgesetzt   werden  konnte.  

5.  Zusammenfassung   100    

 

Zusammenfassend  wurde  eine  Vielzahl  an  verschiedenartig  modifizierten  Nukleotiden  synthetisiert   und   ihre   Einbaueffizienzen   durch   DNA   Polymerasen   gegenüber   unterschiedlicher   Nukleinsäure-­

Modifikationen   getestet.   Da   die   biologische   Auswirkung   dieser   Nukleinsäure-­Modifikationen   zurzeit   intensiv   untersucht   wird,   sehe   ich   ein   sehr   großes   Potential   in   der   Anwendung   dieses   Ansatzes   zur   Detektion  von  modifizierten  Nukleotiden  in  DNA,  wie  auch  in  RNA.