Zielkompartiment Matrix

Sowohl in symbiontischen als auch in parasitischen Interaktionen stellt die Zellwand die äußerste Zone der Interaktion dar. Die pilzliche Zellwand ascomyceter Hefen, welche häufig als Modellsysteme verwendet werden, besteht zu 50 bis 60% aus Glucanen, zu 1 bis 2% aus Chitin und zu 35 bis 40% aus Mannoproteinen (Molina et al., 2000). Tritt ein Pilz mit seiner Wirtspflanze in Interaktion, so kommt es zu einer stadienspezifischen Umformung von Zellwandbestandteilen, die sowohl die Zusammensetzung der Polysaccharide als auch der Zellwandproteine betrifft (Hardham und Mitchell, 1998).

Während in Appressorien bereits zahlreiche Proteine lokalisiert werden konnten (Hutchinson et al., 2002), liegen über Proteine der haustoriellen Zellwand sowie der extrahaustoriellen

Matrix bisher nur wenige Daten vor. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass sowohl Uf- als auch Us-RTP1p vor ihrem Transfer in die pflanzliche Zelle, eine starke Akkumulation in der extrahaustoriellen Matrix aufweisen. Während Proteine wie das 62 kDa Glykoprotein von Erysiphe pisi sowohl in der extrahaustoriellen Matrix, als auch in der Zellwandmatrix von Hyphen nachgewiesen werden konnte (Mackie et al., 1991), wurde RTP1p spezifisch nur in der extrahaustoriellen Matrix detektiert. Als Grenze für eine Ausbreitung des Proteins in die Zellwandmatrix der Haustorienmutterzelle oder des pflanzlichen Apoplasten, wurde der Halsring identifiziert (siehe 3.2.2), welcher schon seit langem als generelle Diffusionsbarriere für Moleküle der extrahaustoriellen Matrix diskutiert wird (Heath, 1976). Eine Begrenzung der Lokalisation von RTP1p auf die extrahaustorielle Matrix und das verhindern des Austretens in den Apoplasten könnte für den Pilz von Bedeutung sein, da zahlreiche sekretierte pilzliche Glykoproteine wie z. B. Avr2 von Cladosporium fulvum (Rooney et al., 2005), im Apoplasten der Pflanze als Elicitoren fungieren und somit Abwehrreaktionen induzieren (Nimchuk et al., 2003).

Während die meisten Proteine an der Hyphenspitze sekretiert werden und von dort aus in die Zellwand oder Zellwandmatrix gelangen (Conesa et al., 2001), scheint dies für RTP1p nicht der Fall zu sein. Weder Uf- noch Us-RTP1p konnten an der Wachstumsspitze von Haustorien lokalisiert werden, nur vollständig differenzierte Bereiche der Matrix wiesen ein starkes Signal auf. Dies unterstützt die Beobachtungen von Harder und Chong (1984), dass Haustorien in der Postpenetrationsphase weitere Differenzierungen durchlaufen. Auch verdeutlicht dies, dass RTP1p offensichtlich nicht frei entlang der extrahaustoriellen Matrix diffundiert, sondern auf bestimmte Subkompartimente beschränkt ist.

Die elektronenmikroskopischen Daten zeigen, dass RTP1p nicht nur eine longitudinale Subkompartimentierung in der extrahaustoriellen Matrix aufweist (Abbildung 3-9), sondern zusätzlich eine transversale Kompartimentierung vorliegt (siehe 3.1.1, insbesondere Abbildung 3-1). Sowohl Uf- als auch Us-RTP1p akkumulieren an einem Übergang zwischen einem Elektronen-dichten Bereich, und einem Elektronen-transparenten Bereich der Interaktionszone zwischen Pilz und Pflanze. Hierbei entspricht der Elektronen-dichte Bereich der modifizierten haustoriellen Zellwand (Chong et al., 1986) und der Elektronen-transparente Bereich, der als gelartig postulierten extrahaustoriellen Matrix (Hardham und Mitchell, 1998).

Je nach Dicke dieser Matrix konnte RTP1p entweder dichter an, oder in größerem Abstand von der extrahaustoriellen Membran detektiert werden. Dies bekräftigt die These, dass RTP1p nicht frei in der gelartigen Matrix diffundiert. Für die meisten Proteine der Zellwandmatrix ist bekannt, dass sie entweder wie das Zellwandprotein aus Magnaporthe grisea, EMP1

(„Extracellular matrix protein 1“), über GPI- Anker (Ahn et al., 2004) oder wie die „alcali-sensitive linkage“-Zellwandproteine (ASL-CWPs) über noch unbekannte kovalente Bindungen mit der Zellwand verbunden sind (De Groot et al., 2005). Obwohl RTP1p weder signifikante Modifikationsstellen für GPI-Anker aufweist (Eisenhaber et al., 1999), noch Homologie zu Konsensussequenzen von PIR Proteinen, einer Hauptgruppe der ASL-CWPs zeigt (De Groot et al., 2005), konnte RTP1p auch auf der Oberfläche isolierter Haustorien detektiert werden, bei welchen lösliche Proteine durch zahlreiche Waschschritte entfernt werden. Auf der Oberfläche dieser Haustorien zeigen immunocytologische Studien eine Markierung filamentartiger Strukturen ähnlich den bei pathogenen Pilzen wie Candida albicans (Chaffin et al., 1998) oder Colletotrichum sp. (Hutchinson et al., 2002) gefundenen pilzlichen Fimbriae. Pilzliche Fimbriae enthalten überwiegend Glykoproteine deren Zusammensetzung zwischen verschiedenen Arten und je nach Aufgabe stark variiert (Celerin und Day, 1998). Bei Brandpilzen wie Microbotryum violaceum konnte gezeigt werden, dass die pilzlichen Fimbriae ein Kollagen-ähnliches Protein enthalten (Celerin et al., 1996). Ob die immunocytologisch markierten Filamente in der extrahaustoriellen Matrix aus einer Agglomeration von RTP1p mit anderen Proteinen wie z. B. Kollagen-ähnlichen entstehen oder ob RTP1p in der Lage ist selbst Filamente in diesem extrazellulären Kompartiment zu bilden, konnte in vivo nicht eindeutig geklärt werden. Die Tatsache, dass heterolog exprimiertes ΠRTP1p sowie ein von der RTP1p Sequenz abgeleitetes Peptid, RTP1p135-155, ebenfalls in der Lage ist Filamente auszubilden (siehe Ergebnisse 3.3.5 und 3.3.6 sowie Diskussion 4.3.2), spricht dafür, dass RTP1p das strukturgebende Protein in den Filamenten in der extrahaustoriellen Matrix sein könnte.

Die Bedeutung von Fimbriae liegt überwiegend in der Adhäsion eines Pathogens an seinen Wirt (Perfect et al., 2001; Krautgartner et al., 2003). Die Adhäsion an die Wirtszelle wird durch eine Bindung von Lectin-ähnlichen Glykoproteinen in den Fimbriae an Sphingolipide der Membran erreicht (Krautgartner et al., 2003). Wie bereits in vorhergehenden Kapiteln ausgeführt (Aufnahme in die Zelle über retrograden Transfer 4.1.4), besitz RTP1p ebenfalls eine potenzielle Glykolipid-Bindedomäne. RTP1p könnte somit eine strukturgebende oder zumindest stabilisierende Eigenschaft in der extrahaustoriellen Matrix zukommen, noch bevor große Mengen des Proteins in die Pflanze transferiert werden. Da RTP1p jedoch nicht an der Membran akkumuliert, und die gelartige Matrix stark ausgedehnt werden kann, so dass der Abstand zwischen den RTP1p-Lokalisationssignalen und der Membran größer wird, scheint eine Bindung mit Bestandteilen der Zellwand wahrscheinlicher, als eine Interaktion mit der extrahaustoriellen Membran. Zudem scheint die extrahaustorielle Membran im Vergleich zur

pflanzlichen oder pilzlichen Plasmamembran, geringere Mengen an Glykolipiden zu ent-halten, wie durch Kontrastierung mit Phosphorwolframsäure gezeigt wurde (Soylu, 2004). Zu klären bleibt jedoch, ob die Einstülpungen der extrahaustoriellen Membran besondere Membrankompartimente mit erhöhten Glykolipidanteilen darstellen. Da RTP1p in den Ein-stülpungen, im Gegensatz zu den übrigen Bereichen der extrahaustoriellen Membran, eine dichte Membranassoziation aufweist, könnte zum Einen wie bereits für den endosomalen Transfer (4.1.3) oder den retrograden Transport (4.1.4) diskutiert, hier der Transfer statt-finden, zum Anderen könnte RTP1p für eine Stabilisierung dieser Subkompartimente verantwortlich sein.