Probenpräparation (Schnittpräparate)

Für die elektronenmikroskopische Immunocytologie wurden die Proben stets unter Ver-wendung von Kryogenen fixiert. Hierzu kam entweder eine bei Robards (1985) beschriebene Kryofixierung mit Propan zur Anwendung (2.8.1.1), welche eine Fixierung ohne vorherige Infiltration erlaubt, oder die in der Arbeit von Stark-Urnau und Mendgen (1995) beschriebene Hochdruck-Kryofixierung nach Infiltration mit 10% Methanol.

2.8.1.1 Kryofixierung in Propan (nach Robards (1985))

Handelsübliches Propan aus einer 5 kg Propancampingflasche wurde durch ein mit flüssigem Stickstoff gekühltes, wendelförmig gedrehtes Rohr aus Kupfer (Innendurchmesser 4 mm) geleitet. In einem Messingbehälter, der in einem Bad aus flüssigem Stickstoff aufgestellt wurde, konnte das vorverflüssigte Propan aufgefangen und nahe seinem Gefrierpunkt (-190 °C) aufbewahrt werden.

Aus infizierten Blättern wurden ca. 8 auf 8 mm große Stücke ausgeschnitten und mit einer spitzen Pinzette schnell in das flüssige Propan getaucht. Nach ca. 20 sec wurde die Probe

wieder aus dem Propanbad entnommen und anhaftendes Propan kurz abgestreift. Zur Aufbewahrung erfolgte eine Lagerung in flüssigem Stickstoff.

2.8.1.2 Hochdruck-Kryofixierung (nach Stark-Urnau und Mendgen (1995)) Vor der Infiltration, wurden von den infizierten Blättern die Blattränder abgeschnitten. Die Infiltration erfolgte mit 10% (v/v) Methanol unter Vakuum (20 mmHg) für 30 sec und wurde bei nicht ausreichender Infiltration (Blätter zeigten helle und dunkle Stellen) wiederholt.

Durch anlegen des Vakuums sollte das Luftvolumen in den Interzellularen vollständig durch das Infiltrationsmedium ersetzt werden um Kompressionen bei der Hochdruckfixierung zu vermeiden. Anschließend wurden die Blätter in n-Heptan überführt und mit einem 1,6 mm Korkbohrer runde Scheibchen aus den Blättern ausgestochen. Die Scheibchen wurden unter n-Heptan zwischen zwei 0,3 mm tiefe Aluminium-Probenhalter geklemmt und mithilfe einer Balzers HPM 010 Hochdruck-Gefrieranlage (BAL-TEC AG, Balzers, Liechtenstein) kryo-fixiert (Moor, 1987). Nach der Kryofixierung wurden die Proben in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.

2.8.1.3 Gefriersubstitution und Einbettung in Acrylharz nach Kryofixierung in Propan

Für die Gefriersubstitution der in Propan kryofixierten Proben wurde zunächst ein Aceton–

Methanol-Gemisch (1:1) (v/v) hergestellt und dieses Gemisch in 50 mL Greiner PP-Röhrchen mithilfe von flüssigem Stickstoff so weit gekühlt, bis die Hälfte des Gemisches wachsartig gefroren war. Die in flüssigem Stickstoff gelagerten Proben wurden in das gekühlte Substitutionsmedium überführt und für 7 Tage bei -70 °C inkubiert. Nach der Inkubation erfolgte ein Transfer nach -20 °C für weitere 24 h sowie nach 4 °C für 12 h. Durch zwei Waschschritte in vorgekühltem Aceton wurden die Proben für die Einbettung in Acrylharz vorbereitet.

Die Überführung in Harz erfolgte wie in 2.7.3.4.4 ausgeführt in einer aufsteigenden Konzentrationsreihe, jedoch wurden alle Schritte bei 4 °C durchgeführt. Die Polymerisation erfolgte wie bereits beschrieben auf Eis und die Nachpolymerisation bei RT.

2.8.1.4 Gefriersubstitution und Einbettung in Epon/Araldit nach Hochdruck-Kryofixierung

Die Gefriersubstitution der Hochdruck-kryofixierten Proben erfolgte in einem Substitutions-medium welches Osmiumtetroxid, Uranylacetat und Glutaraldehyd enthielt (P&M 17) und nach Koop (1981) die Fixierung von Mikrofilamenten ermöglicht.

P&M 17 Substitutionsmedium

49,0% (v/v) Aceton 49,0% (v/v) Methanol

0,2% (w/v) Uranylacetat 1,0% (w/v) Osmiumtetroxid 2,0% (v/v) Glutaraldehyd

Das Mischen aller Bestandteile erfolgte bei -80 °C um ein Reagieren der Substanzen zu vermeiden.

Das Substitutionsgemisch wurde in 2 mL Eppendorf-Reaktionsgefäße zu je 1,5 mL aliquotiert und in der FSU 010 Gefriersubstitutionsanlage (BAL-TEC AG, Balzers, Liechtenstein) auf - 80 °C vortemperiert. Wie von Bachem (1995) vorgeschlagen, um freie Wassermoleküle bei der Substitution aus dem Medium zu entfernen, wurden pro Ansatz 250 mg Molekularsieb 0,4 nm und 250 mg Molekularsieb 0,3 nm in Perlform mit einer Korngröße von ca. 2 mm zu-gesetzt und ebenfalls temperiert.

Die in flüssigen Stickstoff gelagerten Hochdruck-kryofixierten Proben wurden mit einer vorgekühlten Pinzette in das Substitutionsmedium überführt und hierin 80 h bei konstant -80 °C inkubiert um das Wasser durch Lösungsmittel zu substituieren. Die Erwärmung der Proben erfolgte aufgrund der technischen Gegebenheiten der Substitutionsanlage stufenweise auf -60 °C für 6 h, -35 °C für 3 h und für die Fixierung der Proben 1 h bei -20 bis -15 °C.

Nach beendeter Fixierung erfolgten 3 Waschschritte in einem Aceton-Methanolgemisch (1:1 v/v) für jeweils 60 min bei -15 °C.

Um die Proben für die Einbettung vorzubereiten, folgte eine abgestufte Überführung in Propylenoxid. Hierzu wurden die Proben zunächst über Nacht bei -20 °C in einem Gemisch aus Aceton-Methanol-Propylenoxid im Verhältnis 1:1:2 (v/v/v) inkubiert. Nach erneutem Waschen im Aceton-Methanol-Propylenoxid-Gemisch, folgte zunächst für 1 h eine Inkubation bei 4 °C und anschließend bei RT. 3 Waschschritte in Propylenoxid à 60 min sollten verhindern, dass Methanol in den Proben zurückblieb und so die Polymerisation behindert.

Entsprechend der Beschreibung von Graham und Beveridge (1990) wurde für die Epoxid-Einbettung ein modifiziertes Gemisch aus Epon und Araldit verwendet (P&M 18). Die Harz-infiltration erfolgte in einer aufsteigenden Konzentrationsreihe mit jeweils 12 h Inkubations-zeit bei 10, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 und 100%, wobei der 100% Schritt 3 mal wiederholt wurde, bis die Proben frei von Propylenoxid waren. Ab einer Konzentration von 70% wurden 2,5 Tropfen des thermosensitiven Polymerisationsstarters (Epoxy-Einbettungsmittel, Be-schleuniger; Fluka GmbH, Neu-Ulm) pro mL Harzmischung zugesetzt.

Die Polymerisation wurde für 24 h bei 60 °C durchgeführt.

P&M 18 Epon-Araldit-Mischung (nach Graham und Beveridge (1990))

20,7% Epoxy-Einbettungsmittel (Fluka GmbH, Neu-Ulm)

17,0% Durcupan^® ACM (Fluka GmbH, Neu-Ulm) 2,3% Phthalsäuredibutylester

50,0% Epoxy-Einbettungsmittel, Härter DDSA (Fluka GmbH, Neu-Ulm)

Alle Komponenten wurden unter einer Stickstoffatmosphäre gemischt, aliquotiert und bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert.

2.8.1.5 Ultramikrotomie

Sowohl die Semidünnschnitte der Acrylharzproben als auch die Ultradünnschnitte der Epoxidharzproben erfolgten mithilfe des Reichert OmU3-Ultramikrotoms (Reichert, Wien, Österreich) unter Verwendung eines Diatome MX122 Diamantmessers (Diatome AG, Biel, Schweiz).

Für das Tiefätzen der Acrylharzproben wurden 150 bis 200 nm dicke serielle Semidünn-schnitte präpariert und mit Kohlefilm beschichteten Nickel-Grids (3,05 mm 200 mesh, Plano GmbH, Wethzlar) aufgenommen.

Von den Epoxidharzproben ließen sich 50 bis 80 nm dicke serielle Ultradünnschnitte angefertigten, welche mit Schlitzgrids aus Nickel aufgenommen und auf einen Pioloform-Film überführt wurden (Strobel und Stuermer, 1994).