2.7 Licht- und Epilfluoreszenzmikroskopie
2.7.3 Immunocytologie
2.7.3.1 Präadsorption von Antikörpern für die Immunocytologie
Um eine Hintergrundfluoreszenz durch unspezifische Bindungen der verwendeten Anti-körpern zu vermeiden, wurden die Antikörper vor Anwendung, an Blattpuffer präadsorbiert.
2.7.3.1.1 Blattpuffer aus infizierten Pflanzen
Hierzu musste zunächst infiziertes Blattmaterial unter Stickstoff gemörsert und 0,6:1 (w:v) in TE+SDS-Puffer (P&M 11) suspendiert werden. Das Homogenisieren erfolgte durch vier Ultraschallbehandlungen mit einem Branson-Sonifier 250 mit „Standard Microtip“ (G.
Heinemann, Schwäbisch-Gmünd) bei 20 kHz und 100 Watt sowie einer Impulsfrequenz von 40 Impulsen pro Minute für jeweils 2 min. Um pilzliche und pflanzliche Proteine vollständig aus dem Präabsorptionsmedium zu entfernen, wurde dieses durch Zugabe von 200 µg/mL Proteinase K für 18 h bei 30 °C inkubiert und anschließend die nicht löslichen Bestandteile durch Zentrifugation für 15 min bei 16.000 rpm in einem SS34-Rotor pelletiert. Nach Ver-werfen des Überstandes wurde das Pellet in TBS (10 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7,5) durch Vortexen resuspendiert, wobei das halbe für den TE+SDS-Puffer berechnete Volumen eingesetzt wurde. Durch Autoklavieren konnten Restaktivitäten der Proteinase K vermieden werden.
P&M 11 TE+SDS-Puffer (nach Lorkovic et al. (2004))
10 mM 1M Tris/HCl pH 7,5 1 mM Na2-EDTA
0,5% (w/v) SDS Der pH wurde mit HClkonz. auf 8,0 eingestellt.
2.7.3.1.2 Blattpuffer aus nicht infizierten Pflanzen
Hierzu wurden Blätter unter Stickstoff gemörsert und durch Ultraschall wie oben ausgeführt, in TBS homogenisiert. Das Homogenat wurde 15 min bei 16.000 rpm in einem SS34-Rotor abzentrifugiert und das Pellet 2 mal in TBS gewaschen. Nach den Waschschritten wurde das Pellet in der Hälfte des Ausgangsvolumens TBS, durch eine weitere Ultraschallbehandlung resuspendiert und vor der Verwendung autoklaviert, um pflanzliche Proteinasen zu inaktivieren.
2.7.3.1.3 Präadsorption
Für die Präadsorption wurde jeweils der Blattpuffer aus infizierter sowie nicht infizierter Pflanze an das zu untersuchende Pflanzenmaterial angepasst.
Für die Präadsorption wurde 40% (v/v) Inkubationspuffer (P&M 12), 10% (v/v) Blockpuffer (P&M 13), 24,5% (v/v) Blattpuffer von infizierter Pflanze (2.7.3.1.1), 24,5% (v/v) Blattpuffer von nicht infizierter Pflanze (0) sowie 1% (v/v) des jeweiligen gereinigten Antikörpers gemischt.
P&M 12 Inkubationspuffer
1% BSA-C (Aurion, Wageningen, Niederlande) Nach dem Lösen in TBS wurden zur Konservierung 3 mM Natriumazid zugesetzt.
P&M 13 Blockpuffer
5% BSA (Albumin bovine Fraction V) 5% Serotec Goat Serum (Serotec GmbH,
Düsseldorf)
Nach dem Lösen in TBS wurden zur Konservierung 3 mM Natriumazid zugesetzt.
Die Inkubation erfolgte unter ständigem invertieren für 10 min, bevor alle unspezifisch gebundenen Antikörper durch eine 10-minütige Zentrifugation bei 10.000 g in der Tisch-zentrifuge pelletiert wurden. Der Überstand enthielt nun die präabsorbierte Antikörperlösung und wurde auf die Proben überführt.
2.7.3.2 Hintergrund- und Gegenfärbungen
Verschiedene Hintergrund- und Gegenfärbungen mit Fluoreszenzfarbstoffen zur besseren Identifikation von Organellen oder Kompartimenten wurden jeweils nach Inkubation mit Sekundärantikörpern durchgeführt:
• Kernfärbung (verändert nach Schmued et al. (1982))
Die Kernfärbung wurde mit einer 0,001-%igen bisBenzimide Lösung in TBS durch-geführt. Die Inkubationszeit betrug 10 min bei RT.
Für Betrachtung und Digitalfotografie wurde ein DAPI-Filtersatz (ex.: 360/50; split.:
400 LP; em.: 460/50) (Zeiss GmbH, Göttingen) verwendet.
• Hintergrundfärbung durch selektive Färbung von Pilzzellwänden (verändert nach Wachsmuth (1988))
Zur Darstellung von Zellwänden der Pilze, erfolgte eine Färbung mit einer 0,1-%igen Uvitex 2B Lösung (Ciba-Geigy, Rueil Malmaison, Frankreich) in TBS für 5 min.
Für Betrachtung und Digitalfotografie wurde der Blauviolett 5-Filtersatz (ex.: 395-440; split.: 460 LP; em.: 470 LP) (Zeiss GmbH, Göttingen) verwendet.
• Gegenfärbung mit DIOC6(3)
Als Gegenfärbung wurden die Schnitte vor den 3 abschließenden Waschschritten 30 sec in einer 1 µM DIOC6(3)-Lösung (Kodak, Rochester, USA) in TBS inkubiert,
welche mithilfe eines FITC-Filtersatzes (ex.: 480/40; split.: 505 LP; em.: 510 LP) (AF Analysentechnik, Tübingen) ausgewertet werden konnte.
2.7.3.3 Konservieren der Fluoreszenzproben
Vor der mikroskopischen Auswertung wurden alle Proben in DABCO pH 8,5 überführt, da dieses die Fluoreszenzfarbstoffe stabilisiert und vor Ausbleichen schützt (Longin et al., 1993).
P&M 14 DABCO pH 8,5 (Longin et al., 1993)
81,9 mM 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octan 50% (v/v) Glycerin
Nach Zugabe des entsprechenden Volumens H2Odest wurde der pH auf 8,5 ein-gestellt.
2.7.3.4 Fixierung und Einbettung
2.7.3.4.1 Fixierung und Aufbereitung von Totalpräparaten infizierter V. faba Blätter Infizierte V. faba Blätter wurden 8 Tage nach Inokulation (siehe 2.3.1) abgeerntet und wie für die Protoplastierung beschrieben (siehe 2.3.4) mit Verdauungslösung (P&M 1) infiltriert. Die infiltrierten Blattstücke wurden zunächst zu 0,25 cm2 großen Stücken einheitlich zurecht-geschnitten und für 1,5 h bei 26 °C im Eppendorf Thermomixer 5436 (Eppendorf AG, Hamburg) inkubiert. Um die Verdauungslösung zu entfernen erfolgten 3 Waschschritte für jeweils 10 min bei 26 °C in Protoplastenpuffer A (P&M 2).
Die Fixierung und Permeabilisierung des Gewebes erfolgte mit Veränderungen nach einem Protokoll von Frigerio et al. (2000).
Der Fixierungsschritt wurde für 15 min in einer 3,7-%igen Formaldehydlösung in Proto-plastenpuffer A (P&M 2) bei RT durchgeführt. Um das Gewebe für den immuno-cytologischen Nachweis von Uf-RTP1p zu permeabilisieren wurde unmittelbar nach der Fixierung die Permeabilisierung durch zweimaliges Waschen in TSW-Puffer (P&M 15) für jeweils 5 min vorgenommen. Bevor die Proben für den Immunonachweis verwendet werden konnten, mussten durch drei Waschschritte in TBS die im TSW-Puffer enthaltenen Detergentien entfernt werden.
P&M 15 TSW-Puffer (nach Frigerio et al. (2000))
10 mM Tris/HCl pH 7,5 154 mM NaCl
0,25% (w/v) Gelatine 0,02% (w/v) SDS
0,10% (w/v) Triton X-100
2.7.3.4.2 Fixierung und Aufbereitung von Protoplasten (verändert nach Frigerio et al.
(2001))
Die Fixierung der Proben erfolgte 30 min mit 2% Formaldehyd in Protoplastenpuffer A bei RT und wurde nach Ende der Inkubationszeit durch Waschen für 5 min in 0,1 M Glycin in TBS gestoppt. Ein Permeabilisierungsschritt von 5 min in TSW-Puffer wurde durchgeführt, um so die Diffusion der Reagenzien für den immunocytologischen Nachweis in den plasten zu erleichtern. Um die Autofluoreszenz durch Formaldehyd in den fixierten Proto-plasten zu reduzieren, erfolgte eine 15-minütige Behandlung durch 13 mM Natriumboranat in TBS, gefolgt von zwei weiteren 5-minütigen Waschschritten in 0,1 M Glycin in TBS (Newman und Hobot, 2001).
2.7.3.4.3 Fixierung mit Essigsäure – Ethanol
Zur schnellen chemischen Fixierung und Entwässerung von Zellsuspensionskulturen und infiziertem Blattmaterial, wurde ein Gemisch aus Essigsäure und Ethanol (1:3) hergestellt (Clarke, 1851). Für die Fixierung von Zellsuspensionskulturen war es nötig, den Überstand möglichst vollständig zu entfernen und durch das Fixierungsgemisch zu ersetzten. Zum voll-ständigen Entfernen des Wassers, musste das Fixierungsmittel zwei mal ausgetauscht werden.
Im Falle von Blattmaterial wurden aus den Blättern runde Scheibchen mit 1,6 mm Durch-messer ausgestanzt und in jeweils 1,5 mL Fixierlösung überführt. Die Fixierung der Proben erfolgte 4 h bei RT. Anschließend wurde 2 mal jeweils 15 min und 2 mal jeweils 1 h in Ethanol gewaschen. Nach dem letzten Waschschritt erfolgte eine Inkubation in Ethanol bei 4 °C über Nacht.
2.7.3.4.4 Harzeinbettung, Polymerisation und Mikrotomie
Das Überführen von in Essigsäure – Ethanol fixierten Proben (2.7.3.4.3) in eine Acrylharz-mischung (P&M 16), erfolgte in einer Konzentrationsreihe mit 10% und 25% für 1 h, 50% für 2 h, 75% für 3 h und 100% für 30 min sowie über Nacht. Die 100% Schritte wurden 2 mal wiederholt, bevor die Polymerisation durch Zugabe von 0,15 mM N,N- Dimethylaniline (Lal und Green, 1955) gestartet wurde. Die Polymerisation erfolgte zunächst 24 h auf Eis, bevor bei RT für 48 Tage nachpolymerisiert wurde.
P&M 16 Acrylharzmischung (verändert nach Erben (1997))
80% (v/v) Butylmethacrylat 20% (v/v) Methylmethacrylat
40 mM Benzoylperoxid 75%
10 mM DTT
Das Lagern der Probe erfolgte unter einer Stickstoffatmosphäre.
Serielle Schnitte wurden mit einem Reichert OmU3-Ultramikrotom (Reichert, Wien, Österreich) hergestellt, wobei eine Schnittdicke von 0,5 µm gewählt wurde. Die Herstellung der hierzu verwendeten Glasmesser erfolgte mithilfe eines KnifeMaker 7800 B (LKB, Bromma, Schweden). Das Montieren der Schnitte erfolgte auf Biobond (BBI International, Cardiff, UK) beschichteten Objektträgern.
2.7.3.5 Immunocytochemie an Totalpräparaten und Protoplsten
Der immunocytologische Nachweis an Totalpräparaten erfolgte in 1,5 mL Eppendorf-Reaktionsgefäßen. Für das Wechseln der Puffer mussten die Protoplasten nach jedem Schritt durch Zentrifugation für 1 min bei 80 g in der Tischzentrifuge pelletiert werden, während das Wechseln der Puffer für die Blattstücke ohne Zwischenschritte erfolgen konnte. Für jeden Schritt wurden, falls nicht ausdrücklich erwähnt 500 µL Puffer verwendet und die Probe rotierend bei zwei Umdrehungen pro Minute inkubiert.
Um unspezifische Bindungen zu verhindern, erfolgte zunächst, verändert nach Hahn et al.
(1997), ein 20-minütiger Blockierungsschritt in Blockpuffer (P&M 13), gefolgt von einem ebenfalls 20 min dauernden Äquilibrierungsschritt in Inkubationspuffer (P&M 12).
Sowohl für die Totalpräparate als auch für die Protoplasten wurde das Antiserum S844p, wie in 2.7.3.1 ausgeführt, präadsorbiert und die Proben über Nacht bei 4 °C in der Lösung inkubiert.
Zum Auswaschen nicht gebundener Antikörper erfolgten drei Waschschritte in Inkubations-puffer für jeweils 5 min sowie drei weitere Waschschritte zu jeweils 15 min.
Die Detektion der Primärantikörper erfolgte durch fluoreszenzmarkierte Sekundärantikörper.
Sowohl für den Nachweis von nativem Uf-RTP1p in infizierten V. faba Blättern als auch von ΠRTP1p in Protoplasten, wurden Alexa Fluor 488 Ziege-anti-Kaninchen IgGs (H+L) (Invitrogen, Karlsruhe) verwendet. Die Sekundärantikörper wurden 1:400 in Inkubations-puffer verdünnt und die Proben für 2 h bei RT darin inkubiert. Anschließend folgten 2 Waschschritte zu jeweils 10 min sowie 1 Waschschritt mit 20 min Inkubationszeit in TBS.
Zur Montierung der Protoplasten für die mikroskopische Auswertung, wurde eine Fläche von ca. 1 cm2 mit einem PAP-PEN (Gerlinde Kisker Produkte, Mühlhausen) auf Polysine-Objekt-trägern (Menzel GmbH & Co KG, Braunschweig) umringt und die Protoplastensuspension zur Sedimentation in diesen Bereich pipettiert. Nach 1 h Sedimentationszeit konnte der Über-stand vorsichtig entfernt und durch DABCO pH 8,5 (P&M 14) ersetzt werden.
Die Auswertung der Lokalisation erfolgte mithilfe eines Axioplan 2 imaging-Systems mit ApoTome Zusatzmodul zur Erhöhung des Kontrasts sowie zur Erstellung von 3D Bildstapeln.
Für die Betrachtung kam ein Langpass FITC-Filtersatz und für die Digitalaufnahmen ein
E-GFP-Filtersatz (ex.: 470/40; split.: 495 LP; em.: 525/50) (AF Analysentechnik, Tübingen) zur Anwendung.
2.7.3.6 Immunocytochemie an Schnittpräparaten
Für das Ätzen (verändert nach Newman und Hobot (2001)) der in Acrylharz eingebetteten Proben (2.7.3.4.4), wurden die beschichteten Objektträger mit den anhaftenden Schnitten 2,5 min in Aceton inkubiert und anschließend in TBS gewaschen. Für alle weiteren Inkubationsschritte wurden jeweils 100 µL der entsprechenden Lösungen und Puffer auf die Objektträger pipettiert, welche während den Inkubationszeiten in feuchten Kammern auf einem Polymax 1040-Schüttler (Heidolph Instruments, Schwabach) bei 40 rpm inkubiert wurden.
Wie für die Totalpräparate beschrieben (siehe 2.7.3.5) erfolgte zunächst ein Blockierungs-schritt in Blockpuffer sowie das Äquilibrieren in Inkubationspuffer. Beide Schritte wurden für die Inkubation der Schnitte auf 10 min reduziert. Die Präadsorption der Antiseren S746p, S844p und S849 wurde wie in 2.7.3.1 beschrieben durchgeführt.
Die Inkubation der Schnitte in präadsorbierten Antiseren erfolgte über 2 h, gefolgt von 6 Waschschritten zu je 5 min in Inkubationspuffer. Als Sekundärantikörper wurde für S844p und S849p ein Cy3-markierter Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper (Biotrend Chemikalien GmbH, Köln) und für S746p ein Ziege-anti-Meerschwein-Antikörper verwendet, jeweils in einer Verdünnung von 1:400. Für die Markierung der Primärantikörper durch die fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper erwies sich bei den Schnitten eine Inkubationszeit von 1 h als ausreichend. Zum Abschluss erfolgten 3 Waschschritte zu je 10 min in TBS sowie ein Einbetten der Schnitte in DABCO pH 8,5 (2.7.3.3).
Sowohl für die Betrachtung als auch für die Digitalfotografie der Cy3-Markierung wurde ein Cy3 HQ-Filtersatz (ex.: 545/30; split.: 565 LP; em.: 610/75) (AF Analysentechnik, Tübingen) verwendet.
2.7.3.7 Kontrollexperimente zur Immunocytologie
Zur Bewertung der Spezifität der Antikörper wurden zwei Kontrollen durchgeführt: Zum Einen wurden die Schnitte unmittelbar nach dem Ätzen mit Proteinase K behandelt um zu klären ob unspezifische Bindungen der Antikörper an nicht-Protein Komponenten in den Schnitten erfolgen; zum Anderen erfolgte ein chemischer Abbau von Zuckern, um unspezi-fische Bindungen an diese auszuschließen.
• Proteinase K-Behandlung (verändert nach Urbanczyk-Wochniak et al. (2002))
50 µg/mL Proteinase K wurden in TE+SDS-Puffer (P&M 11) gelöst und auf die geätzten Schnitte überführt. Nach einer Inkubation bei 37 °C für 30 min erfolgte die Deaktivierung der Proteinase K in kochendem Wasser für 5 min. Um Restaktivitäten der Proteinase K auszuschließen erfolgten 3 Waschschritte zu je 5 min in 0,1 M Glycin in TBS. Alle weiteren Schritte der Immunolokalisation wurden wie oben beschrieben ausgeführt.
• Natriumperiodat-Behandlung (verändert nach Newman und Hobot (2001))
Die Deglykosylierung erfolgte jeweils mit einer frisch angesetzte gesättigten Lösung Natriumperiodat. Hierzu wurde die Lösung auf die Schnitte überführt und für 20 min bei RT inkubiert. Das Entfernen der Lösung erfolgte durch 3 maliges Waschen in TBS.
Die weitere Immunolokalisation erfolgte wie beschrieben (2.7.3.6).