Cytologie und Funktion
eines amyloidähnlichen Proteins aus Rostpilzen
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades des Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
an der Universität Konstanz Fachbereich Biologie
Vorgelegt von Eric Kemen
Konstanz, im November 2006
Tag der mündlichen Prüfung: 30.04.2007 Referent: Prof. Dr. K. Mendgen Referent: Prof. Dr. P. Kroneck Referent: Prof. Dr. H. Deising
Konstanzer Online-Publikations-System (KOPS) URL: http://www.ub.uni-konstanz.de/kops/volltexte/2007/3108/
URN: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:352-opus-31085
Für Ariane
Wahrscheinlich darf man ganz allgemein sagen, dass sich in der Geschichte des menschlichen Denkens oft die fruchtbarsten Entwicklungen dort ergeben haben, wo zwei verschiedene Arten des Denkens sich getroffen haben.
Werner Heisenberg
An dieser Stelle möchte ich allen Personen recht herzlich danken, die mich bei dieser Arbeit tatkräftig unterstützt haben. Mein besonderer Dank gilt:
Herrn Prof. Dr. Kurt Mendgen für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes sowie des Arbeits- themas, wobei er mir viel Freiheit zur eigenen Gestaltung des Projekts ließ. Ohne seine ständige Bereitschaft zur Diskussion und seine Ratschläge zu allen Teilen der Arbeit wäre die Verwirklichung des Projekts nicht möglich gewesen. Durch die Vermittlung seines Wissens bekam ich detaillierte Einblicke in Methoden und Techniken der Mikroskopie und Cytologie, für die ich ihm besonders danken möchte.
Herrn Prof. Dr. Peter Kroneck nicht nur für die Übernahme des Zweitgutachtens, sondern auch für die unermüdliche Bereitschaft zur Diskussion sowie für seine wertvollen Ratschläge, welche diese Arbeit entscheidend bereichert haben.
Herrn Dr. Ralf Vögele für die vielfältige Unterstützung dieser Arbeit, die aufmerksame Korrektur des Manuskripts sowie die zahlreichen Diskussionen. Nicht zu vergessen, seine konstruktive Kritik bei Seminaren und Besprechungen („sRTP1p“).
Herrn Dr. Günter Fritz und Dipl.-Biol. Michael Koch für gute Ratschläge, extra lange Pipettenspitzen sowie die Hilfe bei der CD-Spektroskopie und deren Auswertung.
Herrn Prof. Dr. Ewald Daltrozzo sowie Herrn Dipl.-Chem. Andreas Ehlers für die tatkräftige Unterstützung bei der Fluoreszenzspektroskopie und deren Auswertung.
Herrn Prof. Dr. Alexander Bürkle und Herrn Prof. Dr. Wolfram Welte für wertvolle Anregungen im Umgang mit amyloiden Proteinen, bzw. für die Expression und Analyse dieser Proteine.
Den Kooperationspartnern in Kaiserslautern, Herrn Prof. Dr. Matthias Hahn für anregende intensive und lange Diskussionen sowie MSc. Maryam Rafiqi für die Erkenntnisse, die aus ihrem Teil der Arbeit gewonnen werden konnten.
Frau PD Dr. Christine Struck für ein glückliches Händchen bei der Auswahl von Pflanzen sowie den Versuch südliche Sprachen und Kulturen zu verstehen.
Herrn Dipl.-Ing. (FH) Heinz Vahlenkamp für die gute Zusammenarbeit in der Mikroskopie sowie die ermunternden Worte über die gesamte Zeit der Dissertation hinweg (Zitat: „Mit einem Theologiestudium wäre dir das nicht passiert“).
Frau Christine Giele für die Unterstützung bei der Arbeit sowie für Ratschläge in und zu allen Lagen des Lebens sowie Frau Annette Schmid für unzählige RT-PCRs mit unvorhersehbarem Ausgang.
Frau Dr. Elisabeth Rehn für die Literaturbeschaffung sowie die Hilfe bei allen organi- satorischen Dingen.
Allen bisher nicht erwähnten Kolleginnen und Kollegen die für ein freundschaftliches und fruchtbares Arbeitsklima sorgten, was entscheidend zum gelingen dieser Arbeit beigetragen hat. Unvergesslich werden die Apfelfeste, Weihnachtsfeste sowie die zahlreichen Kuchen- völlereien, für die es immer einen triftigen Anlass gab, bleiben. Ebenfalls danken möchte ich den Mitarbeitern des „botanischen Forschungslabors“ für die Pflege und Bereitstellung des Pflanzenmaterials sowie allen Vertiefungskursstudenten und Hiwis, die an der Bearbeitung dieses Projekts beteiligt waren. Unter allen nicht zu vergessen die „RTP1p-Nachfolgerin“
Dipl.-Biol. Klara Pretsch, die sich trotz intensiver Arbeit nicht abschrecken ließ.
Ein besonderer Dank gilt natürlich meinen Eltern, ohne deren Unterstützung und Zuspruch weder Studium noch Promotion möglich gewesen wäre. Ebenso danke ich meiner gesamten
„Schwiegerfamilie“ für alle Hilfen und Unterstützungen die ich von ihnen erhalten habe.
Schließlich möchte ich mich bei Ariane Kemen bedanken, die trotz vieler ausgefallener Ideen und wechselnder Hypothesen mich mit viel Liebe und Geduld unterstützt hat. Zusammen konnten wir am 30.07.2005 die beste aller Ideen verwirklichen. Ich freue mich auf unsere gemeinsame Zeit nach der Fertigstellung dieser Arbeit wenn die Erkenntnis kommt: Es gibt auch ein Leben außerhalb der Uni.
Im Verlauf dieser Arbeit wurden folgende Publikationen erstellt oder sind in Vorbereitung:
Kemen, E., Hahn, M., Mendgen, K., and Struck, C. (2005). Different resistance mecha- nisms of Medicago truncatula ecotypes against the rust fungus Uromyces striatus.
Phytopathology 95, 153-157.
Kemen, E., Kemen, A.C., Rafiqi, M., Hempel, U., Mendgen, K., Hahn, M., and Voegele, R.T. (2005). Identification of a protein from rust fungi transferred from haustoria into infected plant cells. Mol Plant Microbe Interact 18, 1130-1139.
Kemen, E., Kemen, A.C., Voegele, R.T., and Mendgen, K. RTP1p: Rust Transferred Protein 1 – A protein with amyloid-like properties. (Manuskript in Vorbereitung) Abbildung 3-2 A wurde publiziert in:
Webster, J., and Weber, R.W.S. (2007). Introduction to fungi. (Cambridge: Cambridge University Press). 3rd edition.
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG ... 1
1.1 Rostpilze... 1
1.2 Cytologie und Physiologie der Rosthaustorien ... 3
1.3 Sekretierte Proteine bei Pilzen... 6
1.4 Zielsetzung... 8
2 MATERIAL UND METHODEN... 9
2.1 Verwendete Computerprogramme und Onlinedatenbanken ... 9
2.2 Verwendete Chemikalien ... 10
2.3 Pflanzenmaterial ... 10
2.3.1 Kultivierung und Inokulation von V. faba, P. sativum, V. unguiculata, P. vulgaris und G. max... 11
2.3.2 Kultivierung und Inokulation von M. sativa und M. truncatula... 11
2.3.3 Zellsuspensionskulturen ... 12
2.3.3.1 Nicotiana tabacum BY-2 Suspensionskulturen ... 12
2.3.3.2 Phaseolus vulgaris ’Kaboon’ Suspensionskulturen... 12
2.3.4 Protoplasten... 12
2.4 Antikörper... 13
2.5 Heterologe Expression von Uf-RTP1p in Pichia pastoris... 14
2.5.1 Verwendete Stämme ... 14
2.5.2 Überexpression... 14
2.5.3 Affinitätsreinigung von ΠRTP1p... 15
2.6 Tests zur Aufnahme von ΠRTP1p in pflanzliche Zellen ... 16
2.6.1 Infiltration von V. faba Blättern... 16
2.6.2 Inkubation von Suspensionskulturen mit ΠRTP1p ... 16
2.6.3 Inkubation von V. faba Protoplasten... 17
2.7 Licht- und Epilfluoreszenzmikroskopie... 18
2.7.1 Lebendbeobachtung ... 18
2.7.2 Hemmstoffversuche... 19
2.7.3 Immunocytologie... 20
2.7.3.1 Präadsorption von Antikörpern für die Immunocytologie ... 20
2.7.3.1.1 Blattpuffer aus infizierten Pflanzen... 20
2.7.3.1.2 Blattpuffer aus nicht infizierten Pflanzen... 20
2.7.3.1.3 Präadsorption ... 20
2.7.3.2 Hintergrund- und Gegenfärbungen ... 21
2.7.3.3 Konservieren der Fluoreszenzproben ... 22
2.7.3.4 Fixierung und Einbettung ... 22
2.7.3.4.1 Fixierung und Aufbereitung von Totalpräparaten infizierter V. faba Blätter ... 22
2.7.3.4.2 Fixierung und Aufbereitung von Protoplasten ... 23
2.7.3.4.3 Fixierung mit Essigsäure – Ethanol... 23
2.7.3.4.4 Harzeinbettung, Polymerisation und Mikrotomie ... 23
2.7.3.5 Immunocytochemie an Totalpräparaten und Protoplsten ... 24
2.7.3.6 Immunocytochemie an Schnittpräparaten... 25
2.7.3.7 Kontrollexperimente zur Immunocytologie... 25
2.7.4 Lichtmikroskopische Auswertung ... 26
2.8 Elektronenmikroskopie... 26
2.8.1 Probenpräparation (Schnittpräparate) ... 26
2.8.1.1 Kryofixierung in Propan ... 26
2.8.1.2 Hochdruck-Kryofixierung ... 27
2.8.1.3 Gefriersubstitution und Einbettung in Acrylharz nach Kryofixierung in Propan ... 27
2.8.1.4 Gefriersubstitution und Einbettung in Epon/Araldit nach Hochdruck-Kryofixierung... 27
2.8.1.5 Ultramikrotomie ... 29
2.8.2 Immunocytochemie... 29
2.8.3 Kontrastierung... 30
2.8.3.1 Negativkontrastierung... 30
2.8.3.2 Kontrastierung mit Uranylacetat und Bleicitrat ... 30
2.8.4 Analyse der Oberfläche von Haustorien im Transmissionselektronenmikroskop ... 31
2.8.4.1 Präparation der Haustorien ... 31
2.8.4.2 Immunocytologischer Nachweis von Totalpräparaten für das Transmissionselektronen- mikroskop ... 33
2.8.4.3 Kontrastierung und Auswertung... 33
2.8.5 Cryo-Rasterelektronenmikroskopie ... 33
2.9 Strukturelle Analysen von RTP1p ... 34
2.9.1 In silico Analysen ... 34
2.9.2 Synthetisches Peptid ... 34
2.9.3 Bestimmung der Proteinkonzentration durch UV/VIS-Spektroskopie ... 34
2.9.4 CD-Spektroskopie... 35
2.10 Nachweis der Bildung von Aggregaten... 36
2.10.1 Nachweis amorpher Aggregate ... 36
2.10.2 „Conversion“ ... 36
2.10.3 Nachweis amyloidähnlicher Aggregate durch Thioflavin T... 37
2.10.4 Bestimmung der kritischen Konzentration der Aggregation ... 38
3 ERGEBNISSE ... 39
3.1 Transfer von RTP1p in die pflanzliche Wirtszelle ... 39
3.1.1 Charakterisierung von Kompartimenten für den Transfer in die pflanzliche Zelle... 39
3.1.2 Semipermeabilität der extrahaustoriellen Membran ... 45
3.1.3 Aufnahme von ΠRTP1p in pflanzliche Zellen ... 46
3.2 Zielkompartimente von RTP1p... 48
3.2.1 Vergleich der Lokalisation von RTP1p mit verschiedenen Antikörpern... 48
3.2.2 Lokalisation von Uf-RTP1p und Us-RTP1p in der extrahaustoriellen Matrix ... 51
3.2.3 Lokalisation von RTP1p im pflanzlichen Cytoplasma... 54
3.2.4 Lokalisation von Uf-RTP1p und Us-RTP1p im pflanzlichen Zellkern ... 56
3.2.5 Lokalisation von Uf-RTP1p im dynamischen Prozess der Interaktion zwischen Pflanze und Pilz ... 58
3.2.5.1 In vivo Analyse infizierter pflanzlicher Zellen ... 58
3.2.5.2 Einfluss des haustoriellen Entwicklungsstadiums auf die Lokalisation von Uf-RTP1p ... 61
3.2.5.3 Einfluss des Cytoskeletts auf die Akkumulation der Chloroplasten sowie die Lokalisation von Uf-RTP1p... 66
3.3 Die Funktion von RTP1p ... 68
3.3.1 Die Bedeutung von RTP1p in weiteren Wirt-Parasit-Systemen ... 68
3.3.2 Die Bedeutung von RTP1p in kompatiblen und inkompatiblen Interaktionen ... 69
3.3.3 In silico Analysen funktioneller und struktureller Aspekte von RTP1 ... 72
3.3.4 Strukturelle Analyse eines synthetischen Peptids der β-Aggregationsdomäne ... 75
3.3.5 Das Aggregationsverhalten von RTP1p135-155 ... 76
3.3.6 Aggregationsverhalten des gesamten, heterolog exprimierten ΠRTP1p ... 80
4 DISKUSSION... 84
4.1 Transfer von RTP1p in die pflanzliche Wirtszelle ... 86
4.1.1 Direkter Übertritt von RTP1p über die extrahaustorielle Membran in das pflanzliche Cytoplasma ... 91
4.1.2 Transporter vermittelte Aufnahme in das pflanzliche Cytoplasma ... 97
4.1.3 Endosomaler Transfer in das Cytoplasma ... 98
4.1.4 Retrograder Transport ... 101
4.2 Zielkompartimente... 107
4.2.1 Zielkompartiment Matrix ... 107
4.2.2 Zielkompartiment Cytoplasma ... 110
4.2.3 Zielkompartiment Zellkern ... 112
4.2.4 Dynamik der Lokalisation... 114
4.3 Funktion von RTP1p ... 120
4.3.1 Kompatible und inkompatible Interaktionen... 120
4.3.1.1 RTP1p in kompatiblen Interaktionen... 120
4.3.1.2 RTP1p in inkompatiblen Interaktionen... 122
4.3.2 Analyse funktioneller und struktureller Aspekte von RTP1p ... 126
4.3.2.1 Strukturelle Analyse von RTP1p... 126
4.3.2.2 Funktionelle Aspekte der Aggregationsdomäne für das gesamte RTP1p ... 129
5 AUSBLICK ... 135
6 ZUSAMMENFASSUNG ... 137
7 SUMMARY ... 139
8 LITERATURVERZEICHNIS ... 141 ANHANG: SEQUENZVERGLEICH DER PROTEINSEQUENZEN VON UF-, US- UND UA-RTP1P 160
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abbildung 1-1 Makrozyklischer, heterözischer Rostzyklus am Beispiel des hypothetischen Kreislaufs des
Rostpilzes U. striatus auf M. sativa. ... 2
Abbildung 1-2 Schematische Darstellung einer Uredosporeninfektion. ... 3
Abbildung 1-3 Schema eines Haustoriums mit Haustorienmutterzelle... 4
Abbildung 3-1 Lokalisation von Uf-RTP1p und Us-RTP1p in der Interaktion zwischen Pflanze und Pilz... 40
Abbildung 3-2 Lokalisation von Uf-RTP1p in Einstülpungen der extrahaustoriellen Membran. ... 42
Abbildung 3-3 Lokalisation von Us-RTP1p in einer Einstülpung der extrahaustoriellen Membran ... 43
Abbildung 3-4 Lokalisation von Uf-RTP1p in pflanzlichen Dictyosomen. ... 44
Abbildung 3-5 Ausdehnung der extrahaustoriellen Matrix eines Haustoriums nach Infiltration mit 0,9% NaCl und 2% Saccharose. ... 45
Abbildung 3-6 Anlagerung von ΠRTP1p an der Plasmamembran von Vicia faba Protoplasten und Aufnahme in die Zellen. ... 47
Abbildung 3-7 Lokalisation von ΠRTP1p in V. faba Protoplasten nach Inkubation mit gereinigtem Protein.. 47
Abbildung 3-8 Vergleich der Lokalisation von RTP1p im Pathosystem U. fabae auf V. faba und U. striatus auf M. sativa mit den Antikörpern S746p, S844p und S849p... 50
Abbildung 3-9 Verteilung und Struktur von RTP1p in der extrahaustoriellen Matrix von U. fabae. ... 52
Abbildung 3-10 Akkumulation von Us-RTP1p an Kontaktstellen der extrahaustoriellen Matrix mit pflanzlichen Organellen... 54
Abbildung 3-11 Immunocytologischer Nachweis von Uf-RTP1p im pflanzlichen Cytoplasma nach Tiefätzen 55 Abbildung 3-12 Vergleich der Kernlokalisation von RTP1p 10 Tage nach Infektion. ... 57
Abbildung 3-13 Vergleich der Lokalisation von Us-RTP1p (S849p) und Uf-RTP1p (S844p) im pflanzlichen Zellkern... 57
Abbildung 3-14 Lebend-Zell-Mikroskopie der Differenzierung von U. fabae Haustorien in Parenchymzellen von Vicia faba... 59
Abbildung 3-15 Immunocytologischer Nachweis von Uf-RTP1p in verschiedenen Entwicklungsstadien der Interaktion zwischen U. fabae und V. faba. ... 63
Abbildung 3-16 Immunocytologischer Nachweis von PIG5p in den Stadium A, B und C der Interaktion zwischen U. fabae und V. faba. ... 65
Abbildung 3-17 Immunocytologischer Nachweis von PIG15p in den Stadium A, B und C der Interaktion zwischen U. fabae und V. faba. ... 65
Abbildung 3-18 Einfluss des Hemmstoffes Cytochalasin B auf die Lokalisation der Chloroplasten in infizierten V. faba Zellen... 67
Abbildung 3-19 Vergleich der Lokalisation von RTP1p bei U. vignae auf Vigna unguiculata und U. appendiculatus auf Phaseolus vulgaris... 68
Abbildung 3-20 Lokalisation von Us-RTP1p in drei resistenten Ökotypen von M. truncatula... 70
Abbildung 3-21 Hypersensitive Reaktion und Lokalisation von Us-RTP1p im M. truncatula Ökotyp GRC.098 ... 72
Abbildung 3-22 In silico Analysen von Aggregationsdomänen in RTP1p ... 73
Abbildung 3-23 CD-spektroskopische Analyse von RTP1p135-155... 75
Abbildung 3-24 Filamente des synthetischen Peptids der β-Aggregationsdomäne. ... 77
Abbildung 3-25 Aggregationskinetik des synthetischen RTP1p135-155-Peptids ... 78
Abbildung 3-26 Kritische Schwelle der Aggregation von RTP1p135-155... 79
Abbildung 3-27 Morphologie von ΠRTP1p Aggregaten nach Negativkontrastierung im TEM. ... 81
Abbildung 3-28 Antigenizität der ΠRTP1p Plaques und Filamente ... 82
Abbildung 4-1 Übersicht der aktuellen Analyse von RTP1p in Hinblick auf die Verknüpfung biochemischer und cytologischer Aspekte... 85
Abbildung 4-2 Schema möglicher Wege für den Transfer von RTP1p aus dem Haustorium in das pflanzliche Cytoplasma ... 91
Abbildung 4-3 Modell zur Verteilung und Funktion von RTP1p. ... 133
TABELLENVERZEICHNIS
Tabelle 2-1 Verwendete Computerprogramme... 9
Tabelle 2-2 Verwendete Onlinedatenbanken und Programme ... 9
Tabelle 2-3 Herkunft verwendeter Chemikalien... 10
Tabelle 2-4 Übersicht über verwendetes Pflanzenmaterial, sowie Herkunft und Inokulum... 10
Tabelle 2-5 Verwendete Antikörper sowie für die Immunisierung verwendete Antigene und Spenderorganismen ... 13
Tabelle 2-6 Reinigungsprotokoll ... 15
Tabelle 2-7 Zusammenstellung der Infiltrationsmedien, die je nach Fragestellung zur Anwendung kamen. ... 18
Tabelle 2-8 Ausgangs- und Endkonzentrationen verwendeter Hemmstoffe des Cytoskeletts... 19
Tabelle 2-9 Kombinationen von Primär- und Sekundärantikörper in der Elektronenmikroskopie... 30
Tabelle 2-10 Bedingungen zur Bestimmung der kritischen Konzentration der Aggregation ... 38
Tabelle 3-1 Stadien der intrazellulären Interaktion zwischen Pilz und Pflanze aufgrund von Lebendbeobachtungen ... 58
Tabelle 3-2 Lokalisation von Uf-RTP1p in Stadien der intrazellulären Interaktion zwischen Pilz und Pflanze, analysiert an Schnittpräparaten... 61
Tabelle 3-3 Vergleich ausgewählter M. truncatula Ökotypen nach Resistenzreaktion und Immunocytologischem Nachweis von RTP1p ... 69
VERWENDETE ABKÜRZUNGEN
1B5 Suspensionskulturmedium nach Gamborg mit 1 mg/L 2,4-D und 5 B-Vitaminen
2,4-D (2,4-Dichlorphenoxy)essigsäure ASL alcali-sensitive linkage
cDNA complementary desoxyribonucleic acid / copy DNA CPP cell penetrating peptide
DABCO 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octan
DTT Dithiotreitol
EST expressed sequence tag
FPLC fast protein liquid chromatography GPI-Anker glycosyl-phosphatidyl-inositol-Anker HESP haustorially expressed secreted proteins
HR hypersensitive response
kV Kilo-Volt
MD minimal dextrose
MES 2-Morpholinoethansulfonsäure
MGY minimal glycerol
MM Minimal Medium
MS Mineralmedium nach Murashige und Sköog NBS-LRR nucleotide binding site-leucine rich repeat P&M Puffer und Medien
PEXEL Plasmodium export element
PIG in planta induced gene
PIR protein with internal repeats
PrP Prion-Protein
REM Rasterelektronenmikroskop
RT Raumtemperatur (ca. 21 °C)
RTP1 Rust Transferred Protein 1 - Gen RTP1p Rust Transferred Protein 1 - Protein RxLR Arginin-variabel-Leucin-Arginin SAR Systemic acquired resistance
SDS sodium dodecylsulfate
TBS Tris buffered saline
TEM Transmissionselektronenmikroskop TE-Puffer Tris-EDTA-Puffer
TIR Toll/IL-1 receptor
TSW-Puffer Tritone-SDS-washing-Puffer
Ua-RTP1p Rust Transferred Protein 1 von Uromyces appendiculatus Uf-RTP1p Rust Transferred Protein 1 von Uromyces fabae
Us-RTP1p Rust Transferred Protein 1 von Uromyces striatus
YNB yeast nitrogen base
ΠRTP1p Rust Transferred Protein 1 – heterolog in Pichia pastoris exprimiertes, mit His-Tag versehenes Protein
1 EINLEITUNG
1.1 Rostpilze
Rostpilze (Uredinales) sind mit 7.000 beschriebenen Arten die größte Gruppe phytopatho- gener Pilze und stellen aufgrund dieser Artenvielfalt ein Drittel aller bisher beschriebenen Basidiomyceten dar (Aime, 2006). An Wildtyppflanzen, in Regionen ihrer natürlichen Ver- breitung, verursachen die obligat biotrophen Rostpilze nur geringe Schäden. Erfolgt jedoch eine Verbreitung der Pilze, über ihr natürliches Vorkommen hinaus, so können sie ins- besondere an nicht resistenten Pflanzen in genetisch einheitlichen Kulturen, wie Mono- kulturen von Feldfrüchten, Forsten oder Zierpflanzen, erhebliche Schäden anrichten (Böllmann und Scholler, 2006). Einer der aggressivsten sich derzeit weltweit ausbreitenden Roste, ist eine asiatische Rasse des Sojabohnenrosts, Phakopsora pachyrhizi, welche in Brasilien zu Ernteverlusten von bis zu 75% führte (Del Ponte et al., 2006). Ihre schnelle Aus- breitung verdanken Rostpilze in erster Linie der Verbreitung durch den Wind, mit dessen Hilfe sie innerhalb weniger Tage mehr als 500 km zurücklegen können (Brown und Hovmøller, 2002). P. pachyrhizi konnte so im September 2004 mithilfe des Hurrikans Ivan die karibische See überqueren und so von Kolumbien aus in die USA gelangen (Isard et al., 2005).
Dieser Ferntransport von Rostpilzen erfolgt in den meisten Fällen in Form der Uredosporen (Isard et al., 2006). Obwohl Uredosporen durch Tageslicht schnell geschädigt werden und nur unter einer Wolkendecke ausreichend lang für einen Transport überleben (Isard et al., 2006), sind sie aufgrund der enormen Anzahl produzierter Sporen sehr effektiv. Ein Uredo- sporenlager ist in der Lage ca. 10.000 Uredosporen pro Tag zu produzieren, so dass auf einem Hektar bis zu 5 kg Sporen produziert werden, was einer Anzahl von ca. 2 x 109 Sporen entspricht (Roelfs, 1984). Ihren Namen verdanken die Rostpilze der rost- oder rotbraunen Farbe dieser Sporenlager sowie den als Dauersporen angelegten Teleutosporen.
Der Lebenszyklus eines Rostpilzes kann bis zu fünf verschiedene Sporentypen umfassen sowie Kernphasen- und Wirtswechsel beinhalten (Cummins und Hiratsuka, 2003). Unter- schieden werden bei den Sporentypen die bereits erwähnten Uredo- und Teleutosporen sowie Basidiosporen, Spermatiosporen (= Pyknosporen) und Aecidiosporen.
Rostpilze, welche alle fünf Sporentypen umfassen und einen Kernphasenwechsel durchlaufen, werden als makrozyklisch bezeichnet, solche mit unvollständigem Entwicklungszyklus als mikrozyklisch (Staples, 2000). Obwohl bei P. pachyrhizi nicht alle Stadien bekannt sind, kann
aufgrund der bekannten Sporenformen geschlossen werden, dass es sich hierbei um einen makrozyklischen Rostpilz handelt (Bromfield, 1984). Bei den ebenfalls auf Leguminosen vorkommenden Uromyces Arten, U. fabae und U. striatus konnten hingegen alle Sporen- formen nachgewiesen werden (Gäumann, 1959). Während U. fabae die Entwicklungsstadien auf ein und derselben Leguminose durchläuft und daher als autözisch bezeichnet wird (Holway und Arthur, 1918), benötigt U. striatus wie alle Vertreter des Formenkreises U. pisi,
einen Wirtswechsel von Fabacea auf Euphorbiacea, wes- halb er als heterözisch bezeichnet wird (Pilet, 1953) (siehe Abbildung 1-1). Hier- bei sind die dikary- otischen Stadien auf Leguminosen, die monokaryotischen hin gegen auf Euphorbien zu finden (Pfunder et al., 2001). Für die vorliegende Arbeit wurde insbesondere das Modellsystem U. fabae auf V. faba genutzt, da für dieses Pathosystem sowohl molekulare als auch fundierte cytologische Daten von nahezu einem halben Jahr- hundert Forschung vorlagen (Voegele, 2006). Während in diesem Modellsystem überwiegend Ergebnisse von pilzlicher Seite zur Verfügung standen, wurde das zweite Wirt- Pathogensystem, U. striatus auf M. truncatula gewählt, da hier mehr Informationen auf pflanzlicher Seite zur Verfügung standen. M. truncatula stellt aufgrund seines kleinen
Abbildung 1-1 Makrozyklischer, heterözischer Rostzyklus am Beispiel des hypothetischen Kreislaufs des Rostpilzes U. striatus auf M. sativa.
(für U. striatus angepasst nach einer Vorlage von Esser (2000))
Genoms im Vergleich zu anderen Leguminosen wie z. B. Vicia faba, ein ideales Modell- system für Leguminosen dar (Zhu et al., 2005). Hinzu kommt, dass aufgrund seines großen natürlichen Verbreitungsraums zahlreiche Ökotypen von M. truncatula zur Verfügung stehen, welche so einen genetischen Pool zur Analyse verschiedener Kompatibilitätstypen bereit- stellen (Kemen et al., 2005a).
1.2 Cytologie und Physiologie der Rosthaustorien
Abhängig von der Kernphase können Rostpilze nicht nur auf verschiedene Wirtspflanzen wechseln, sondern entwickeln zusätzlich morphologisch unterschiedliche Infektionsstrukturen (Gold und Mendgen, 1991). Aufgrund ihrer Bedeutung für die Verbreitung und Vermehrung, wurde der Schwerpunkt in dieser Arbeit auf die dikaryotische Uredosporeninfektion gelegt.
Abbildung 1-2 Schematische Darstellung einer Uredosporeninfektion.
Die erste Infektionsstruktur, die von einer Uredospore (U) nach der Anheftung auf einem Blatt ausgebildet wird, ist der Keimschlauch (KS). Der thigmotrophe Reiz einer Spaltöffnung führt zur Ausbildung eines Appressoriums (A), mit dessen Hilfe der Pilz in den Interzellularraum der Pflanze eindringt. Ausgehend von einem substomatären Vesikel (SV) bildet der Pilz zahlreiche Interzellularhyphen (IH), welche in der Lage sind Haustorienmutterzellen (HM) zu differenzieren. Mithilfe der Haustorienmutterzellen werden Haustorien (H) in den pflanzlichen Zellen ausgebildet. Während junge Haustorien (JH) rund und unverzweigt sind, zeigen alte Haustorien (AH) eine starke Lappung (verändert nach Harder (1984)).
Uredosporen von U. fabae und U. striatus durchlaufen nach ihrer Keimung eine Reihe spezialisierter Infektionsstrukturen (Abbildung 1-2), um die Wirtspflanze durch die Spalt- öffnung zu besiedeln und in die Mesophyllzellen einzudringen (Mendgen und Hahn, 2002).
Während die Infektionsstrukturen der frühen Infektionsstadien wie Keimschlauch, Appressorium, substomatäres Vesikel, Interzellularhyphen sowie in geringem Umfang auch Haustorienmutterzellen, in vitro induziert werden können, ist die weitere Differenzierung des Pilzes nur in planta möglich (Deising et al., 1991). Für die Penetration in die Wirtszelle ist zunächst die Kontaktaufnahme der Spitze einer Interzellularhyphe mit der pflanzlichen Zell- wand wichtig, welche daraufhin zu einer Haustorienmutterzelle differenziert. Nur wenig ist bisher über die Regulierung der Differenzierung dieser Zelle bekannt sowie über den Mechanismus, welcher zur Penetration der Wirtszelle führt (Hardham, 2001).
Das für obligat biotrophe Parasiten charakteristische Haustorium (Abbildung 1-2) wird gebildet, indem sich eine dünne Penetrationshyphe durch die Zellwand schiebt und nach kurzem Spitzenwachstum in eine Phase der Expansion über geht, in der der Haustorien- körper differenziert (Harder und Chong, 1984;
Mendgen und Hahn, 2002). Ein typisches Merkmal dieser Haustorien ist die Abgrenzung des Haustorien- körpers vom pflanzlichen Cytoplasma durch eine Plasmamembran, welche als extrahaustorielle Membran bezeichnet wird (Littlefield und Heath, 1979). Ob diese besonders differenzierte Membran durch Einstülpen der pflanzlichen Plasmamembran gebildet wird und somit das Kompartiment, in dem sich der Pilz befindet, ähnlicher dem Apoplasten ist, oder ob die Membran ähnlich phagocytotischen Prozessen gebildet wird und somit das Kompartiment, dem einer Vakuole gleicht, konnte bisher nicht hinreichend geklärt werden (Parniske, 2000). Auffällig ist jedoch, dass die extrahaustorielle Membran nicht durchgehend glatt ist, sondern Einstülpungen aufweist, die in das Cytoplasma hineinreichen (Mendgen et al., 1991) und bei einigen Rosten eine starke Verzweigung aufweisen (Mims et al., 2002). Die Funktion dieser
Abbildung 1-3 Schema eines Haus- toriums (H) mit Haustorienmutterzelle (HM).
PZ: pilzliche Zellwand, R: Halsring, G:
Golgi, ER: endoplasmatisches Reticulum, PN: pflanzlicher Nucleus, HN: haus- torieller Nucleus, E: Einstülpungen der extrahaustoriellen Membran, EM: extra- haustorielle Membran, EHM: extra- haustorielle Matrix (verändert nach Prof.
Dr. K. Mendgen)
Strukturen sowie ihre Entstehung konnte bisher jedoch nicht geklärt werden. Zwischen der extrahaustoriellen Membran und der Zellwand des Pilzes entsteht ein Kompartiment, welches als extrahaustorielle Matrix bezeichnet wird (Bushnell, 1972; Knauf et al., 1989). Eine Ab- trennung dieses Kompartiments vom pflanzlichen Apoplasten erfolgt im Bereich Elektronen- dichter Strukturen am Hals des Haustoriums. Diese als Halsring bezeichnete Struktur, besitzt eine funktionelle Ähnlichkeit zu den Caspary-Streifen der Pflanze wie experimentell gezeigt werden konnte (Heath, 1976).
Die Matrix selbst enthält bei Rostpilzen sowohl Bestandteile der pilzlichen Zellwand, als auch Bestandteile der primären pflanzlichen Zellwand, wobei die pflanzlichen Bestandteile zur extrahaustoriellen Membran hin zunehmen (Chong et al., 1986; Stark-Urnau und Mendgen, 1995). Die Konsistenz der Matrix wird häufig als gelartig postuliert, da sie insbesondere an isolierten Haustorien eine deutliche Quellung zeigt (Hahn und Mendgen, 1992).
Neben den kovalent vernetzten fibrillären Zellwandbestandteilen, welche stabilisierend gegen Expansion wirken, besitzt die pilzliche Wand ebenfalls eine Matrix, welche vor Kompression schützt (Wessels, 1994). In dieser Matrix, welche auch als Zellwandmatrix bezeichnet wird (Farkas, 1979), befinden sich zahlreiche Glykoproteine, die entweder frei in der Matrix diffundieren oder über Glykosyl-Phosphatidylinositol-Anker (GPI-Anker) sowie interne Repeats (Proteins with internal repeats, Pir) an der Zellwand verankert sind (Carlile et al., 2001). Insbesondere die Zellwand-gebundenen Proteine, sind für die Porosität und damit die Durchlässigkeit der Zellwand verantwortlich und verhindern so, dass lösliche Proteine wie z. B. Invertasen oder Vorstufen von Zellwandproteinen durch Diffusion verloren gehen (De Groot et al., 2005). Der Bereich zwischen Zellwand und Plasmamembran des Pilzes, in welchem die Proteine zurückgehalten werden, wird als periplasmatischer Spalt bezeichnet (Pitson et al., 1999).
Betrachtet man den Differenzierungsprozess eines Haustoriums weiter, so beginnt, nachdem die Expansionsphase des Haustoriums abgeschlossen und ein Zellkern aus der Haustorien- mutterzelle in das Haustorium eingewandert ist, die Differenzierung eines Wachstumspols und damit das intrazelluläre Spitzenwachstum des Haustoriums (Harder und Chong, 1984).
Die Bedeutung eines solchen Haustoriums bei der Wirt-Parasit-Interaktion wird deutlich, wenn man resistente Pflanzen betrachtet, in denen der Rostpilz trotz Ausbildung von Interzellularhyphen abstirbt und nicht in der Lage ist sich zu vermehren (Kemen et al., 2005a). Die Resistenz beruht meist darauf, dass keine Haustorien gebildet werden können (prähaustorielle Resistenz) oder, dass bei Penetration des Pilzes und Ausbildung eines Haustoriums in der Wirtszelle, eine hypersensitive Reaktion ausgelöst wird, bei der die
pflanzliche Zelle abstirbt und so die Ausbildung einer differenzierten Interaktionszone zwischen Haustorium und pflanzlichem Cytoplasma verhindert wird (posthaustorielle Resistenz) (Rohringer und Heitefuss, 1984; Heath, 1997).
Funktionell besitzen die Haustorien als „Saugorgane“ in der pflanzlichen Zelle, eine wichtige Aufgabe bei der Aufnahme von Nährstoffen (Mendgen, 1979; Voegele, 2006). In erster Linie sind diese Nährstoffe Aminosäuren (Hahn et al., 1997; Struck et al., 2002) sowie Zucker, die eine Reproduktion des Pilzes gewährleisten (Voegele und Mendgen, 2003). Es ist daher nicht verwunderlich, dass HXT1p, ein Hexosetransporter in der haustoriellen Plasmamembran allein ca. 1,2% der gesamten mRNA darstellt (Voegele et al., 2001). Um sich jedoch in der Wirtszelle zu etablieren, muss das Haustorium ebenfalls in der Lage sein, Signale mit der penetrierten Zelle auszutauschen, um so die Abwehr der Pflanze zu unterdrücken (Heath und Skalamera, 1997). Für eine Unterdrückung der Abwehr wird postuliert, dass Pilze entweder in der Lage sind eine Erkennung durch die Pflanze zu vermeiden, oder aktiv durch Sekretion von Effektoren wie z. B. Proteinen, die Abwehr zu reprimieren (Hahn und Mendgen, 2001), wie dies von phytopathogenen Bakterien bekannt ist (Nomura et al., 2006).
1.3 Sekretierte Proteine bei Pilzen
Filamentöse Pilze wie Aspergillus sp. oder Trichoderma sp. sind in der Lage, extrem große Mengen an Protein (bis zu 30 g/L Kulturmedium) zu sekretieren und werden daher für die Produktion von heterologen Proteinen in der Biotechnologie eingesetzt (Conesa et al., 2001).
Unter natürlichen Bedingungen werden in diesen Konzentrationen überwiegend lytische Enzyme sekretiert, die dem extrazellulären Aufschluss organischer Polymere dienen (Wessels, 1993). Während bei saprophytischen Pilzen die Sekretion lytischer Enzyme für die Entwicklung und Vermehrung des Organismus hinreichend ist, müssen von biotrophen oder auch nekrotrophen Pflanzenparasiten zusätzlich Proteine zum Schutz vor antifungalen Substanzen oder Enzymen sowie zur Unterdrückung pflanzlicher Abwehrreaktionen sekretiert werden (Panstruga, 2005; Rep, 2005). Die Sekretion solcher als Virulenz-Faktoren bezeichneten Proteine birgt jedoch Gefahren für den Pilz, sobald diese von Resistenz- Rezeptoren der Pflanze erkannt werden und ihrerseits eine Abwehr induzieren. In diesem Fall werden die Virulenz-Faktoren zu Avirulenz-Faktoren (Hammond-Kosack und Jones, 1997).
So sekretiert Cladosporium fulvum bei seiner Infektion von Tomate (Lycopersicon esculentum) Avr2, ein Protein, welches Cystein-Proteinasen der Pflanze inhibiert. Interagiert Avr2 jedoch mit der Cystein-Proteinase Rcr3, so kann dieser Komplex mit dem pflanzlichen, extrazellulären Rezeptor Cf-2 interagieren und so eine hypersensitive Reaktion auslösen, die
das Wachstums des Pathogens stoppt (Rooney et al., 2005). Den so sekretierten pilzlichen Effektorproteinen ist gemeinsam, dass sie häufig relativ klein sind, einen hohen Anteil an Cysteinen enthalten und aufgrund des Selektionsdrucks eine starke Divergenz in der Amino- säuresequenz aufweisen (Rep, 2005).
Eine bei Asco- und Basidiomyceten weit verbreitete Proteinklasse, welche kleine, cystein- reiche Proteine umfasst, die häufig an der Interaktion zwischen Pilz und Pflanze beteiligt sind, ist die Klasse der Hydrophobine (Whiteford und Spanu, 2002). Hydrophobine stellen sekretierte Zellwandproteine dar, welche der pilzlichen Zellwand einen Schutz vor chemischen, enzymatischen und physikalischen Einflüssen bieten (Wösten, 2001). Diese außergewöhnliche Stabilität gegenüber physiko-chemischen Einflüssen, erhalten die Proteine durch ihre ungewöhnliche Eigenschaft zur Ausbildung amyloidähnlicher Filamente, welche sich ihrerseits zu sogenannten „Rodlets“ zusammenlagern (Mackay et al., 2001). Die Aus- bildung amyloidähnlicher Fibrillen beruht meist auf einer Zusammenlagerung von β-Faltblättern zu sogenannten cross-β-Strukturen (Nelson et al., 2005). Für das KlasseI- Hydrophobin EAS aus Neurospora crassa konnte gezeigt werden, dass die Filamentbildung und somit die Aggregation des Proteins auch hier auf einer Zusammenlagerung von β-Faltblattstrukturen beruht (Kwan et al., 2006). Insbesondere Versuche mit Thioflavin T, einem selektiven Farbstoff zum Nachweis amyloider Strukturen (LeVine, 1997) belegen, dass auch weitere Hydrophobine wie z. B. SC3 aus Schizophyllum commune, amyloidähnliche β-Faltblattstrukturen aufweisen (De Vocht et al., 2000).
Für MHP1, einem Hydrophobin aus Magnaporthe grisea, konnte gezeigt werden, dass dieses Hydrophobin nicht nur für die Entwicklung des Pilzes selbst und den Zellwandaufbau von Bedeutung ist, sondern auch bei der Besiedlung der Wirtspflanze eine entscheidende Rolle spielt (Kim et al., 2005). Häufig besitzen Pilze jedoch nicht nur ein Hydrophobin, sondern mehrere, die wie für C. fulvum beschrieben, stadienspezifisch während der Besiedlung des Wirtes sekretiert werden (Whiteford et al., 2004).
Wie bei C. fulvum für die Hydrophobine, so konnte bei Rostpilzen gezeigt werden, dass zahlreiche Proteine stadienspezifisch exprimiert werden und nur nach Ausbildung bestimmter Infektionsstrukturen vorhanden sind (Deising et al., 1991). Ca. 47% der pilzlichen Gene, welche nach Infektion von U. fabae auf V. faba aktiv sind, werden nur in der Pflanze und nicht von gekeimten Uredosporen exprimiert (Jakupovic et al., 2006). Bereits in früheren Studien konnte gezeigt werden, dass zahlreiche Proteine spezifisch von Haustorien und nicht durch in vitro induzierte Infektionsstrukturen gebildet werden (Hahn und Mendgen, 1997).
Aufgrund ihrer spezifischen Expression in der Pflanze, wurden diese Proteine daher als
„in planta induced genes“ (PIGs) bezeichnet (Hahn und Mendgen, 1997).
Unter den stadienspezifisch exprimierten Proteinen konnten insbesondere in den frühen Stadien der Infektion des Rostpilzes zahlreiche zellwanddegradierende, sekretierte Proteine identifiziert werde (Mendgen und Deising, 1993). Nicht überraschend war daher, dass auch in späteren Stadien wie Haustorien, einige Proteine sekretiert werden. So wurden aus einer haustorienspezifischen cDNA-Bank von Melampsora lini von 429 Unigenen, 21 (4,9%) als haustoriell exprimierte und sekretierte Proteine (HESPs) identifiziert (Catanzariti et al., 2006).
Für drei dieser 21 HESPs wurde zudem gezeigt, dass sie spezifisch mit cytoplasmatischen Resistenz-Rezeptoren der Wirtspflanze interagieren und somit in der Lage sein müssen, über die Plasmamembran in das pflanzliche Cytoplasma zu gelangen, um so die beobachteten Resistenzreaktionen auszulösen (Catanzariti et al., 2006; Dodds et al., 2006). Wie diese pilz- lichen Proteine jedoch in die pflanzliche Zelle gelangen, wo sie dort lokalisiert sind und welche Funktion sie besitzen, konnte bisher nicht geklärt werden (Ellis et al., 2006).
1.4 Zielsetzung
Im Rahmen eines haustorienspezifischen EST Projekts von U. fabae, konnten von Hahn und Mendgen (1997) 31 PIGs identifiziert werden. 6 dieser PIGs wurden aufgrund von potenziellen Sekretionssignalen ausgewählt und von Hempel (2005) weiter analysiert sowie durch Herstellung von polyklonalen Antikörpern charakterisiert. Immunocytologische Ana- lysen ergaben Hinweise darauf, dass eines dieser PIGs, PIG7, vom Haustorium in die pflanz- liche Wirtszelle transferiert wird. Im Rahmen eines Kooperationsprojekts mit A. Kemen (siehe hierzu (Kemen, 2006)), erfolgte eine Charakterisierung von PIG7, welches aufgrund der neuen Erkenntnisse in „Rust Transferred Protein 1“ (RTP1) umbenannt wurde (Kemen et al., 2005b). Während von A. Kemen die molekularbiologischen und biochemischen Aspekte des Proteins bearbeitet wurden, standen in der vorliegenden Arbeit cytologische sowie strukturelle Aspekte des Proteins im Vordergrund.
Folgende grundlegende Fragestellungen ergaben sich somit für die vorliegende Arbeit:
1.) Wie und wo wird RTP1p in die pflanzliche Wirtszelle transferiert?
2.) Wohin wird RTP1p transferiert und was sind die Zielkompartimente des Proteins?
3.) Welche Funktion hat RTP1p und welche strukturellen Eigenschaften besitzt RTP1p um seine Funktion zu erfüllen?
2 MATERIAL UND METHODEN
2.1 Verwendete Computerprogramme und Onlinedatenbanken
Tabelle 2-1 Verwendete Computerprogramme
Produktbezeichnung Bezugsquelle / Referenz Verwendungszweck
Adobe Photoshop® CS Adobe Systems, Mountain View, CA, USA
Bildbearbeitung AxioVision 4.0 Zeiss GmbH, Göttingen Bilddokumentation,
Mikroskopsteuerung CDNN 2.1 Gerald Böhm, Institut für Biotechnologie,
Martin-Luther-Universität Halle-Witten- berg
Dekonvolution von CD- Spektren
DNAstar* Paket DNAstar Inc., Madison, WI, USA Sequenzbearbeitung, Sequenzvergleich EndNote6.0 ISI Research Soft, Berkeley, CA, USA Literaturrecherche FE-PC SEM
Operation Part Ver 3.4 Control Part Ver 2.4
HISCO Europe GmbH, Ratingen REM Steuerung und Bilddokumentation
Microsoft®Excel 2003 Microsoft Corporation, Unterschleißheim Berechnungen Microsoft®Power
Point 2003
Microsoft Corporation, Unterschleißheim Bildbearbeitung Microsoft®Word 2003 Microsoft Corporation, Unterschleißheim Textbearbeitung UNICORN 4.12 GE Healthcare Deutschland, München FPLC Steuerung
Tabelle 2-2 Verwendete Onlinedatenbanken und Programme
Bezeichnung Adresse / Referenz Verwendungszweck
BETApro http://www.ics.uci.edu/~baldig/betasheet.html (Cheng und Baldi, 2005)
Analyse paralleler oder antiparalleler
β-Flatblattstrukturen GOR IV http://abs.cit.nih.gov/gor/
(Garnier et al., 1996) Sekundärstrukturanalyse NCBI BLAST® http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/
(Altschul et al., 1997)
BLAST-Suche SignalP V3.0 http://www.cbs.dtu.dk/
services/SignalP/
(Nielsen et al., 1997)
Vorhersage von Signal- sequenzen
SSpro 4.0 http://www.ics.uci.edu/~baldig/scratch/
(Cheng et al., 2005)
Sekundärstrukturanalyse Tango 1.1 http://tango.embl.de/
(Fernandez-Escamilla et al., 2004; Linding et al., 2004)
Analyse von Aggrega- tionsdomänen
2.2 Verwendete Chemikalien
Nähere Angaben zu den verwendeten Chemikalien können dem Text entnommen werden.
Dort nicht näher erläuterte Chemikalien wurden mit analytischem Reinheitsgrad von folgenden Firmen bezogen:
Tabelle 2-3 Herkunft verwendeter Chemikalien
Firma Firmenstandort
BD Biosciences Heidelberg
Carl Roth GmbH & Co. Karlsruhe
Electron Microscopy Sciences Fort Washington, USA
Merck Eurolab GmbH Darmstadt
PeqLab Biotechnologie GmbH Erlangen SERVA Feinbiochemica GmbH & Co.KG Heidelberg Sigma-Aldrich Chemie GmbH Taufkirchen
2.3 Pflanzenmaterial
Alle in der vorliegenden Arbeit verwendeten Pflanzen, deren Herkunft sowie die zur In- okulation verwendeten Rostpilze sind der Tabelle 2-4 zu entnehmen.
Tabelle 2-4 Übersicht über verwendetes Pflanzenmaterial sowie Herkunft und Inokulum
Wirtspflanze Herkunft des
Saatguts
Inokulum
Vicia faba L. ’Con Amore’ Nickerson- Zwaan, Edemissen
Uromyces fabae (PERS.) SCHROETER (Rasse I2) Pisum sativum ’Progress Nr. 9’ Weigelt, Niederwalluf U. fabae (Rasse I2) (PERS.)
SCHROETER oder U. striatus SCHROETER (Rasse KN1) Medicago sativa L. ’Europe’ Kleinwanzlebener
Saatzucht AG, Einbeck Medicago truncatula GAERTN.
`Jemalong´ A17
Medicago truncatula GAERTN. F11.0008
Medicago truncatula GAERTN. DZA.045
Medicago truncatula GAERTN. ESP.100
Medicago truncatula GAERTN. ESP.162
Medicago truncatula GAERTN. GRC.098
INRA- Montpellier, Montpellier,
Frankreich
U. striatus SCHROETER (Rasse KN1)
Vigna unguiculata ’California Monsanto Company, U. vignae CPRI
Black Eye’ St Louis, MO, USA Phaseolus vulgaris ’Primel’ Enza Zaden
Deutschland GmbH &
Co. KG, Dannstadt- Schauernheim
U. appendiculatus SWBRI
Glycine max ’Erin’ PZO Saat GmbH, Schwäbisch-Hall
Phakopsora pachyrhizi ThaiI
2.3.1 Kultivierung und Inokulation von V. faba, P. sativum, V.
unguiculata, P. vulgaris und G. max
Samen von V. faba, V. unguiculata, P. vulgaris oder G. max wurden in einem Topf mit ge- dämpfter Einheitserde ausgelegt. Hierauf folgte eine 21-tägige Anzucht der Pflanzen in Phytokammern (Heraeus Vötsch Typ VVZPHQ 200/S) bei 21 °C und einer Tag-Nacht- Periode von 16 / 8 h.
Die für die Inokulation verwendeten Uredosporen des entsprechenden Rostes (Tabelle 2-4) wurden in einer Uredosporen-Milchpulversuspension (25 mg Uredosporen + 35 mg Milch- pulver + 50 mL H2O entionisiert) mit einer Druck-Pump-Sprühflasche auf die 21 Tage alten Pflanzen aufgebracht. Die Pflanzen wurden für 24 h bei 100% Luftfeuchtigkeit im Dunkeln inkubiert und danach im Gewächshaus wie von Deising et al. (1991) beschrieben, bei einer Tag-Nacht-Periode von 16 / 8 h für 6 bis 14 Tage je nach Versuch kultiviert.
Die Ernte von Uredosporen für weitere Inokulationen erfolgte nach 7 bis 15 Tagen. Die Sporen wurden bei –80 °C gelagert.
2.3.2 Kultivierung und Inokulation von M. sativa und M. truncatula
Die Samen von M. sativa, M. truncatula `Jemalong´ A17, F11.0008, DZA.045, ESP.100, ESP 162 und GRC.098 wurden auf gedämpfter Einheitserde ausgesät und nach einer Woche pikiert. Die Anzucht erfolgte wie in 2.3.1 beschrieben. Drei Wochen nach dem Pikieren konnten die Pflanzen mit Uredosporen von Uromyces striatus (Rasse KN2) inokuliert werden.
Für die Inokulation wurden die Sporen in Kerosin suspendiert (10 mg Sporen pro mL Kerosin) und mithilfe einer Sogolee HP-200 Airbrush-Pistole mit einer 0,2 mm Sprühdüse (Conrad, Hirschau) auf 21 Tage alte Pflanzen aufgebracht (Kemen et al., 2005a).
Mit einer Druck-Pump-Sprühflasche wurden die Pflanzen nach Abdampfen des Kerosins leicht befeuchtet und für 16 h im Dunkeln bei 20 °C inkubiert. Nach dieser Behandlung wurden die infizierten Luzernen für 8 bis 14 Tage je nach Versuch im Gewächshaus kultiviert.
Die Uredosporen wurden zwischen 10 bis 14 Tage nach Inokulation geerntet und bis zu ihrer Verwendung bei -80 °C eingelagert.
2.3.3 Zellsuspensionskulturen
2.3.3.1 Nicotiana tabacum BY-2 Suspensionskulturen
Die BY-2 Tabaksuspensionskulturen wurden von T. Merkle (Universität Bielefeld, Bielefeld) zur Kultivierung bereitgestellt. Die Kultivierung erfolgte wie von Merkle (1996) beschrieben in MS-Medium.
Alle zwei Wochen wurden die Kulturen in frisches Medium überimpft. Um die Kulturen für weitere Versuche abzuernten, wurden die Zellen in einer Heraeus Multifuge 3 S-R-Zentrifuge (Kendro, Osterode) mit Ausschwingrotor Nr. 75006445 bei 50 g für 10 min pelletiert und der Überstand mit Pasteurpipetten abgenommen und verworfen. Die Lagerung der Zellen bis zur Verwendung in den entsprechenden Versuchen erfolgte bei RT.
2.3.3.2 Phaseolus vulgaris ’Kaboon’ Suspensionskulturen
Die Phaseolus vulgaris Suspensionskulturen wurden von I. Heiser (Technische Universität München, Freising-Weihenstephan) zur Verfügung gestellt. Die Kultivierung der Kulturen erfolgte in 1B5-Medium (Gamborg et al., 1968), welches wie von Jackson et al. (1984) vor- geschlagen mit 4,5 mM 2,4-D komplettiert wurde.
Das Umsetzten der Kulturen für die Erhaltung erfolgte alle vier Wochen. Das Abernten der Kulturen erfolgte wie für die Nicotiana tabacum BY-2 Suspensionskulturen beschrieben (2.3.3.1).
2.3.4 Protoplasten
Die Protoplastierung wurde adaptiert nach einer Methode von Okuno und Furusava (1977) mit Modifikationen nach Obi et al. (1989). Für die Durchführung mussten zunächst die Blatt- ränder sowie die Mittelrippe entfernt und die erhaltenen Blattteile mit Verdauungslösung (P&M 1) vakuuminfiltriert werden. Um einen besseren Austausch der Verdauungslösung mit dem Blattinneren zu gewährleisten, erfolgte ein zurechtschneiden des infiltrierten Blatt- materials zu ca. 0,25 cm2 großen Stücken. In einer Petrischale mit 25 mL Verdauungslösung, wurden die Blattfragmente flottierend inkubiert. Nach einer 3 bis 4-stündigen Inkubation bei 25 °C, zeigte die Verdauungslösung durch freigesetzte phenolische Verbindungen eine dunkelbraun bis schwarze Verfärbung. Zu diesem Zeitpunkt war das Blattmaterial gerade so weit mazeriert, dass die Verdauungslösung vorsichtig gegen den Protoplastenpuffer A (P&M 2) ausgetauscht werden konnte, ohne dass das Gewebe komplett zerfiel. Dieser Waschschritt wurde zwei mal wiederholt, bevor das mazerierte Blattgewebe durch eine 125 µm Gaze in 50 mL Greiner PP-Röhrchen filtriert wurde. Um die noch im Gewebe festsitzenden Protoplasten auszuschwemmen, wurde mit 45 mL Protoplastenpuffer A nachgespült.
P&M 1 Verdauungslösung
2,0% (w/v) Cellulase Onozuka R10 (SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg)
0,3% (w/v) Macerozyme R10 (SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg)
Die Enzyme wurden in Protoplastenpuffer A gelöst und vor der Anwendung 10 min bei RT inkubiert.
P&M 2 Protoplastenpuffer A
500 mM D-Sorbitol 1 mM CaCl2
5 mM MES
Der Protoplastenpuffer A wurde mit 1 M KOH auf pH 5,5 eingestellt.
Ein Ankonzentrieren der Protoplasten erfolgte durch 5-minütige Zentrifugation bei 50 g (Heraeus Multifuge 3 S-R-Zentrifuge), wobei der Überstand vorsichtig mit einer Pasteur- pipette soweit abgenommen wurde, dass nur noch ein dünner Flüssigkeitsfilm über dem Pellet stand. Durch vorsichtiges Drehen des PP-Röhrchens wurde das Protoplastenpellet in der verbliebenen Flüssigkeit resuspendiert.
Die Aufbewahrung der Protoplasten erfolgte stets auf Eis, wobei eine Lagerung von mehr als 1 h stets vermieden wurde.
2.4 Antikörper
Eine Liste aller in der Arbeit eingesetzten Antikörper sowie deren Herkunft ist in Tabelle 2-5 zusammengefasst.
Tabelle 2-5 Verwendete Antikörper sowie für die Immunisierung verwendete Anti- gene und Spenderorganismen
Bezeichnung Antigen Serum von Quelle
S746p Uf-RTP1p mit N- terminalem His-Tag
Meerschwein (Hempel, 2005) S844p Uf-RTP1p mit N-
terminalem His-Tag
Kaninchen (Kemen, 2006) S849p Us-RTP1p mit N-
terminalem His-Tag Kaninchen (Kemen, 2006) S767p PIG5p mit N-
terminalem His-Tag
Kaninchen (Hempel, 2005) S750p PIG15p mit N-
terminalem His-Tag
Kaninchen (Hempel, 2005)
Die Aufreinigung der Seren erfolgte in allen Fällen über Positiv-Negativ-Adsorption (Voegele et al., 2001) und wurde von den jeweils angegebenen Autoren durchgeführt. Die Reinheit und Spezifität der Antiseren wurde vor Anwendung in der Immunocytologie durch Westernblot- analysen getestet.
2.5 Heterologe Expression von Uf-RTP1p in Pichia pastoris
2.5.1 Verwendete Stämme
Für die Überexpression wurde von A. Kemen der P. pastoris Stamm KM71 pPIC3.5::ΠRTP1 zur Verfügung gestellt, Kontrollversuche wurden mit dem Stamm P. pastoris KM71 pPIC3.5 durchgeführt.
2.5.2 Überexpression (verändert nach Stratton (1998))
Um gleichmäßige Kultivierungsbedingungen zu erhalten, mussten zunächst die P. pastoris Zellen von Festmedium in Flüssigmedium überführt werden. Zum Anlegen der Vor-Vor- Kulturen, wurden 25 mL MGY-Medium (P&M 3) in einem 300 mL Kolben mit 5 bis 6 Kolonien von MD-Agar (P&M 6) beimpft und über Nacht bei 360 rpm und 30 °C in einem KS10 Rotationsschüttler (Edmund Bühler, Tübingen) inkubiert. Mithilfe der Vor-Vor-Kultur wurden 200 mL Vor-Kultur auf eine OD von 0,25 in frischem MGY-Medium eingestellt und in 1 L Schikanekolben 12 h bei 360 rpm und 30 °C inkubiert. Das Ernten der Vorkulturen erfolgte bei 2.000 rpm für 5 min, in einem GSA-Rotor. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet zunächst in H2Odest. resuspendiert, bevor die Zellen erneut bei 2.000 rpm und 5 min im GSA- Rotor pelletiert wurden.
Für die Überexpression erfolgte eine Resuspension des Pellets in MM-Medium (P&M 7), wobei die Kultur in 300 mL Schikanekolben auf eine OD von 30 eingestellt wurde. Die Inkubation fand erneut im Rotationsschüttler bei 360 rpm und 30 °C statt, wobei nach 24 h der pH mit 24% Ammoniaklösung auf 6,0 titriert wurde und eine Nachinduktion der Kulturen durch Gabe von 0,5% Methanol erfolgte.
P&M 3 MGY-Medium
0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 6 1,0% (v/v) Glycerin
10,0% (v/v) 10x YNB
0,1% (v/v) Biotin-Stammlösung
Zunächst wurden Kaliumphosphatpuffer und Glycerin mit dem entsprechenden Volumen H2Odest angesetzt und autoklaviert, bevor die Zugabe von 10x YNB sowie der Biotin-Stammlösung erfolgte.
P&M 4 10x YNB
3,4% (w/v) DifcoTM Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate (BD, Heidelberg)
0,76 M Ammoniumsulfat
Die Komponenten wurden in H2Odest gelöst und für die Lagerung autoklaviert
P&M 5 Biotin-Stammlösung
0,82 mM D(+)- Biotin (Vitamin H) FCC II (Merck, Darmstadt)
Die Lösung in H2Odest wurde vor der Anwendung filtersterilisiert
P&M 6 MD-Agar
1,5% (w/v) Agar (SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg)
2,0% (w/v) Dextrose 10,0% (v/v) 10x YNB
0,2% (v/v) Biotin-Stammlösung
Zunächst wurde der Agar zusammen mit dem entsprechenden Volumen H2Odest
autoklaviert, bevor die Zugabe der übrigen Bestandteile erfolgte.
P&M 7 MM-Medium
0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 6
1,0% (v/v) Uvasol Methanol (Merck, Darmstadt) 10,0% (v/v) 10x YNB
0,2% (v/v) Biotin-Stammlösung
Der Kaliumphosphatpuffer wurde zunächst autoklaviert, bevor die Zugabe der übrigen Bestandteile steril erfolgte.
72 h nach Erstinduktion wurden die Zellen bei 6.000 rpm für 10 min im GSA-Rotor pelletiert.
Für die Aufreinigung von ΠRTP1p über Affinitätschromatographie wurde der Überstand durch einen 0,45 µm Filter sterilfiltriert.
2.5.3 Affinitätsreinigung von ΠRTP1p
Für die Affinitätsreinigung des ΠRTP1p über FPLC wurde von Kemen (2006) ein Reinigungsprotokoll etabliert, welches im folgenden angewandt wurde.
Die Aufreinigung des Proteins erfolgte mithilfe der ÄKTAFPLC© (GE Healthcare, München), unter Verwendung eines Stufengradienten. Hierfür wurde das von A. Kemen erstellte Programm Affimit2step angewandt. Die wesentlichen Schritte des Reinigungsprotokolls sind Tabelle 2-6 zu entnehmen.
Tabelle 2-6 Reinigungsprotokoll
Funktion Puffer / Auftrag Flussrate Volumen
Äquilibrieren Puffer A 1 mL/min 5,0 mL
Auftragen Pichia Überstand 1 mL/min 9,5 mL
Waschen Puffer A 1 mL/min 4,0 mL
Eluieren Gradient 1 85% Puffer A + 15% Puffer B 1 mL/min 5,0 mL Gradient 2 70% Puffer A + 30% Puffer B 1 mL/min 5,0 mL Für den Auftrag auf die mit Nickel beladene HisTrapTM HP 1 mL Säule (GE Healthcare, München), wurde der sterilfiltrierte P. pastoris KM71 pPIC3.5::ΠRTP1 Kulturüberstand
zunächst mit 1 mM reduziertem L-Glutathion (Sigma-Aldrich, Steinheim) sowie mit 45 mM Imidazol (Acros Organics, Geel, Belgien) versetzt und der pH mit 1 M NaOH auf 6,5 ein- gestellt. Imidazol wurde bereits beim Auftrag zugesetzt, um die Spezifität zu erhöhen.
P&M 8 Puffer A
50 mM NaH2PO4
300 mM NaCl
1 mM L-Glutathion reduziert
Der pH wurde mit 5 M NaOH auf 8,0 eingestellt und die Lösung anschließend steril- filtriert und unter Vakuum (30 mmHg) entgast.
P&M 9 Puffer B
50 mM NaH2PO4
300 mM NaCl
500 mM Imidazol, kristallin 5 mM L-Glutathion reduziert
Der pH wurde mit 5 M NaOH auf 8,0 eingestellt und die Lösung anschließend steril- filtriert und unter Vakuum (30 mmHg) entgast.
Nach Ende des Programms Affimit2step wurden die Fraktionen 8, 9 und 10 gepoolt, da aus Westernblotanalysen bekannt war, dass diese Fraktionen nahezu das gesamte Protein ent- hielten.
2.6 Tests zur Aufnahme von ΠRTP1p in pflanzliche Zellen
2.6.1 Infiltration von V. faba Blättern
Für die Infiltration von ΠRTP1p in Blätter an lebenden Bohnenpflanzen, wurde Kulturüber- stand von P. pastoris KM71 pPIC3.5::ΠRTP1 (siehe 2.5.2) mithilfe von 0,45 x 25 mm Einmal-Injektions-Kanülen (Braun, Melsungen) in die Interzellularen injiziert. Vor der Injektion wurde der pH des Überstandes kontrolliert und falls nötig mit 1 M KOH auf pH 6,0 titriert. Ebenso wurde mit dem Kulturüberstand des P. pastoris KM71 pPIC3.5- Stammes verfahren, welcher als Kontrolle verwendet wurde.
Für die Auswertung des Versuchs wurden Proben vor Injektion, unmittelbar nach Injektion sowie 1 Tag bzw. 2 Tage nach Infiltration entnommen. Die Probennahme, sowie die immunocytologische Auswertung des Versuches erfolgte wie in 2.7 beschrieben.
2.6.2 Inkubation von Suspensionskulturen mit ΠRTP1p
Für die Inkubation der N. tabacum BY-2- oder P. vulgaris ’Kaboon’-Suspensionkulturen (siehe 2.3.3.1 bzw. 2.3.3.2) mit gereinigtem ΠRTP1p (siehe 2.5.3), wurde das Protein zunächst in die den Kulturen entsprechenden Medien umdialysiert. Hierdurch konnte das bei der Reinigung zugesetzte Imidazol entfernt werden, welches die O2- Produktion in pflanz-
lichen Zellen durch Inhibition der NADPH-Oxidase beeinflusst (Auh und Murphy, 1995). Das Umdialysieren erfolgte, indem das gereinigte Protein zunächst in 10fachem Volumen MS- bzw. 1B5-Medium aufgenommen und in Vivaspin 15R Ultrafiltrationseinheiten mit einer 5.000 MWCO HY-Membran (Vivascience AG, Hannover) bei 2.000 g im Ausschwingrotor der Heraeus Multifuge 3 S-R-Zentrifuge auf das halbe Volumen eingeengt wurde. Die Filtrationseinheit wurde 3 mal neu mit Puffer befüllt, bevor die Zellen aus 25 mL Suspensionskultur in 10 mL der verdünnten Proteinlösung aufgenommen wurden. Die Inkubation der N. tabacum BY-2-Zellen bzw. P. vulgaris ’Kaboon’-Zellen erfolgte für zwei Stunden bei RT. Für Kontrollexperimente wurden ebenfalls 25 mL der jeweiligen Suspensionskultur abgeerntet, jedoch statt in Proteinlösung in den jeweiligen Puffern resuspendiert. Durch wiederholtes leichtes Schütteln wurde ein Absetzen der Suspensions- kulturen während der Inkubation verhindert. Nach Ende der Inkubationszeit erfolgte ein Pelletierungsschritt für 10 min bei 50 g im Ausschwingrotor der Heraeus Multifuge 3 S-R- Zentrifuge, wobei der Überstand mit einer Pasteurpipette entfernt wurde, und das Pellet wie in 2.7.3.6 beschrieben fixiert und eingebettet wurde. Die Auswertung erfolgte durch eine immunocytologische Analyse (siehe 2.7.3.4.3).
2.6.3 Inkubation von V. faba Protoplasten
Wie in 2.6.2 beschrieben, erfolgte zunächst ein Umpuffern das gereinigten ΠRTP1p mithilfe der Vivaspin 15R Ultrafiltrationseinheiten. Für den Versuchsansatz mit Protoplasten, wurden jedoch 3 mL des gereinigten Proteins (siehe 2.5.3) mit insgesamt 48 mL Protoplastenpuffer A (P&M 2) versetzt und am Ende der Zentrifugationsschritte auf 3 mL Gesamtvolumen eingestellt. Um die Aggregation des Proteins und somit den Verlust bei der Zentrifugation so gering wie möglich zu halten (siehe Ergebnisteil Aggregation 3.3.6), musste der pH des Protoplastenpuffers A mit 1 M KOH auf 7,0 titriert werden. Jeweils 500 µL der Proteinlösung wurden in 1,5 mL Eppendorf-Reaktionsgefäße übertragen und der gewünschte pH unmittelbar oder nach Einstellen einer Konzentration von 10 mM reduziertem Glutathion mit 0,5 M HCl oder 0,5 M KOH titriert. Für die Tests ausgewählt wurden pH 5, 6, 7 und 8 sowie nach Zu- gabe von reduziertem Glutathion pH 5 und pH 8.
200 µL der Protoplastensuspension (siehe 2.3.4) wurden in 1,5 mL Eppendorf-Reaktions- gefäße überführt und 1 min bei 80 g in einer Eppendorf 5415 C Tischzentrifuge (Eppendorf AG, Hamburg) abzentrifugiert. Nach vollständigem Abnehmen des Überstandes, erfolgte das Resuspendieren der Pellets in den vorbereiteten Proteinlösungen, gefolgt von 2 h Inkubation bei RT. Als Kontrolle wurde zum Einen ein Pellet in Protoplastenpuffer A pH 7,0 ohne Protein inkubiert, zum Anderen wurde ein Aliquot der Protoplastensuspension mit zwei
Kristallen Kaliumcyanid versetzt und nach 30 min zwei mal mit Protoplastenpuffer A gewaschen, bevor eine Inkubation mit Protein bei pH 7,0 erfolgte.
Nach der Inkubation wurden alle Proben zwei mal 10 min in Protoplastenpuffer A gewaschen, wobei nach jedem Waschschritt die Zellen 1 min bei 80 g in der Tischzentrifuge sedimentiert wurden. Unmittelbar im Anschluss an die Waschschritte erfolgte die Fixierung der Proben sowie der immunocytologische Nachweis (siehe Präparation von Protoplasten 2.7.3.4.2).
2.7 Licht- und Epilfluoreszenzmikroskopie
2.7.1 Lebendbeobachtung
Lebendbeobachtungen der Infektionsstrukturen von U. fabae auf V. faba oder U. striatus auf M. sativa wurden vier bis sechs Tage nach Infektion durchgeführt.
Hierzu wurde zunächst Infiltrationsmedium mit einer 0,40 x 20 mm Einmal-Injektions-Kanüle (Braun, Melsungen) in die Interzellularen injiziert und ein 1 cm2 großes Blattstück ausgeschnitten. Das Entfernen der stark lichtbrechenden Kutikula erfolgte in Infiltrations- medium um eine Schädigung des Gewebes durch schnelles Austrocknen zu verhindern.
Die Beobachtung der Proben und Aufnahme der Zeitreihen erfolgte mithilfe eines Axioplan2 imaging Systems (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Göttingen). Das beste Kontrast- zu Auflösungsverhältnis konnte im Differenzial-Interferenzkontrast mithilfe des Plan- Apochromat 63x / 1,4 Öl- oder 100x / 1,4 Öl-Objektivs erzielt werden.
Um eine möglichst einheitliche Belichtung des Pflanzenmaterials zu gewährleisten, wurden alle Proben in 30 sec Intervallen fotografiert, wobei die Aufnahmebedingungen so gewählt wurden, dass eine nur schwache Belichtung zwischen den Aufnahmen erfolgte (4,0 V bei Verwendung einer 100 W Halogenlampe). 1 sec vor der Aufnahme und während der Auf- nahme wurde die Beleuchtung auf maximale Lichtintensität eingestellt (12,2 V), um Bewegungsunschärfen von Organellen durch kurze Belichtungszeiten zu vermeiden.
Für die verschiedenen Fragestellungen im Hinblick auf die Lebendbeobachtungen kamen unterschiedliche Infiltrationsmedien zur Anwendung. Tabelle 2-7 gibt einen Überblick über die durchgeführten Beobachtungen sowie die jeweils verwendeten Medien.
Tabelle 2-7 Zusammenstellung der Infiltrationsmedien, die je nach Fragestellung zur Anwendung kamen.
Medium Versuch
0,9% NaCl
0,9% NaCl mit 1% Saccharose 0,9% NaCl mit 2% Saccharose
Versuche zur Analyse der Semipermeabilität der extrahaustoriellen Membran
BG11 mit 2 mM Tris/HCl und 1%
Saccharose (P&M 10)
Langzeitbeobachtungen der Infektions- strukturen
P&M 10 BG11 mit 2 mM Tris/HCl und 1% Saccharose (BG11 verändert nach Rippka et al. (1979))
1,0% (w/v) Saccharose
2,0 mM 1M Tris/HCl pH 7,5 5,9 mM NaNO3
0,2 mM K2HPO4
0,3 mM MgSO4 x 7H2O 0,3 mM CaCl2 x 2H2O 0,2 mM Na2CO3
30,0 µM Citronensäure
0,6% (w/v) Ammoniumeisen(III)- citrat 0,3 µM Na2-EDTA
46,2 µM H3BO3
9,2 µM MnCl2 x 4H2O 0,8 µM ZnSO4 x 7H2O 1,6 µM Na2MoO4 x 2H2O 0,3 µM CuSO4 x 5H2O 0,2 µM Co(NO3)2 x 6H2O
Nach dem Autoklavieren wurde sterilfiltriertes, 200 mM NaHCO3 zu einer End- konzentration von 4 mM zugesetzt.
2.7.2 Hemmstoffversuche (nach Kobayashi et al. (1997))
Für Hemmstoffversuche zur Analyse des Cytoskeletts, wurden die verwendeten Inhibitoren zunächst in den in Tabelle 2-8 angegebenen Konzentrationen in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und anschließend in BG11 (P&M 10) auf die gewünschte Konzentration eingestellt (siehe Tabelle 2-8, Verdünnungen).
Tabelle 2-8 Ausgangs- und Endkonzentrationen verwendeter Hemmstoffe des Cytoskeletts
Verdünnungen Hemmstoff Handelsname Ausgangs-
konzentration 1:10 1:100 1:100
Taxol Paclitaxel 2,3 mM 0,23 mM 23 µM 2,30 µM
Oryzalin Oryzalin Pestanal ®
28,9 mM 2,89 mM 289 µM 28,9 µM Colchicin Colchicin 25,0 mM 2,50 mM 250 µM 25,0 µM Cytochalasin B Cytochalasin B 10,0 mM 1,00 mM 100 µM 10,0 µM Die Infiltration der Hemmstoffe in das Blatt erfolgte wie für die Lebendbeobachtung beschrieben (siehe 2.7.1). Vor der Beobachtung oder Fixierung der Proben, wurden diese zunächst 8 h in Dunkelheit und anschließend 4 h bei Licht inkubiert. Anschließend erfolgte die Lebendbeobachtung wie in 2.7.1 beschrieben. Für immunocytologische Analysen im Lichtmikroskop wurden die Proben unmittelbar nach der Inkubation in Essigsäure - Ethanol fixiert (siehe 2.7.3.4.3). Für die Elektronenmikroskopie erfolgte eine Hochdruck-Kryo- fixierung (2.8.1.2)
2.7.3 Immunocytologie
2.7.3.1 Präadsorption von Antikörpern für die Immunocytologie
Um eine Hintergrundfluoreszenz durch unspezifische Bindungen der verwendeten Anti- körpern zu vermeiden, wurden die Antikörper vor Anwendung, an Blattpuffer präadsorbiert.
2.7.3.1.1 Blattpuffer aus infizierten Pflanzen
Hierzu musste zunächst infiziertes Blattmaterial unter Stickstoff gemörsert und 0,6:1 (w:v) in TE+SDS-Puffer (P&M 11) suspendiert werden. Das Homogenisieren erfolgte durch vier Ultraschallbehandlungen mit einem Branson-Sonifier 250 mit „Standard Microtip“ (G.
Heinemann, Schwäbisch-Gmünd) bei 20 kHz und 100 Watt sowie einer Impulsfrequenz von 40 Impulsen pro Minute für jeweils 2 min. Um pilzliche und pflanzliche Proteine vollständig aus dem Präabsorptionsmedium zu entfernen, wurde dieses durch Zugabe von 200 µg/mL Proteinase K für 18 h bei 30 °C inkubiert und anschließend die nicht löslichen Bestandteile durch Zentrifugation für 15 min bei 16.000 rpm in einem SS34-Rotor pelletiert. Nach Ver- werfen des Überstandes wurde das Pellet in TBS (10 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7,5) durch Vortexen resuspendiert, wobei das halbe für den TE+SDS-Puffer berechnete Volumen eingesetzt wurde. Durch Autoklavieren konnten Restaktivitäten der Proteinase K vermieden werden.
P&M 11 TE+SDS-Puffer (nach Lorkovic et al. (2004))
10 mM 1M Tris/HCl pH 7,5 1 mM Na2-EDTA
0,5% (w/v) SDS Der pH wurde mit HClkonz. auf 8,0 eingestellt.
2.7.3.1.2 Blattpuffer aus nicht infizierten Pflanzen
Hierzu wurden Blätter unter Stickstoff gemörsert und durch Ultraschall wie oben ausgeführt, in TBS homogenisiert. Das Homogenat wurde 15 min bei 16.000 rpm in einem SS34-Rotor abzentrifugiert und das Pellet 2 mal in TBS gewaschen. Nach den Waschschritten wurde das Pellet in der Hälfte des Ausgangsvolumens TBS, durch eine weitere Ultraschallbehandlung resuspendiert und vor der Verwendung autoklaviert, um pflanzliche Proteinasen zu inaktivieren.
2.7.3.1.3 Präadsorption
Für die Präadsorption wurde jeweils der Blattpuffer aus infizierter sowie nicht infizierter Pflanze an das zu untersuchende Pflanzenmaterial angepasst.
