Charakterisierung der Rust Transferred Proteins, einer Rostpilz-spezifischen Effektor-Familie

Charakterisierung der Rust Transferred Proteins, einer Rostpilz-spezifischen Effektor-Familie

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades des Doktors der Naturwissenschaften

an der Universität Konstanz Fachbereich Biologie

vorgelegt von

Klara Pretsch

Konstanz 2012

Tag der mündlichen Prüfung: 20.01.2012 1. Referent: Prof. Dr. Kurt Mendgen 2. Referent: Prof. Dr. Ralf Vögele

Konstanzer Online-Publikations-System (KOPS) URL: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:352-181817

1. Einleitung

Erkrankungen an Pflanzen werden durch eine Vielzahl unterschiedlicher Organismen hervorgerufen. Zu den bedeutendsten Gruppen von Pflanzenpathogenen zählen Viren, Bakterien, Oomyceten und Pilze, die unterschiedliche Strategien entwickelt haben, ihre Wirtspflanzen zu besiedeln, sich von pflanzlichem Gewebe zu ernähren und sich dort zu reproduzieren (Berger et al. 2007). Krankheitssymptome werden durch die Manipulation des pflanzlichen Stoffwechsels durch Sekretion von Toxinen, Enzymen und vielen weiteren Substanzen und den Entzug von Nährstoffen durch die Pathogene verursacht (Agrios 2002).

Im Gegenzug haben die Wirtspflanzen vielfältige Abwehrmechanismen gegen die Besiedelung durch Pathogene entwickelt, die sowohl basale wie spezifische Resistenzmechanismen umfassen (Glazebrook 2005). Im Laufe dieser Coevolution von Pflanzen und Pathogenen sind verschiedene Formen der Interaktion entstanden. Bakterien, Oomyceten und Pilze sind in den meisten Fällen extrazelluläre Pathogene, die nicht in die pflanzlichen Zellen eindringen. Da sie jedoch auf die Aufnahme von Komponenten aus den Wirtszellen angewiesen sind, haben diese Pathogene verschiedene Strategien entwickelt an diese Nährstoffe zu gelangen. Filamentöse Pathogene, d.h. Oomyceten und Pilze, können daher aufgrund ihrer Lebensweise in verschiedene Gruppen unterteilt werden (Lewis 1973).

Während nekrotrophe Pathogene wie Botrytis cinerea oder Fusarium oxysporum das Wirtsgewebe in einem frühen Stadium der Infektion abtöten und sich anschließend von diesem toten Gewebe ernähren, entziehen biotrophe Pathogene wie die Rost- und Mehltaupilze lebenden Zellen über einen langen Zeitraum Nährstoffe. Pathogene wie Magnaporthe oryzae oder Colletotrichum lindemuthianum zeigen zu Beginn der Infektion eine biotrophe Lebensweise, gehen jedoch in späteren Infektionsstadien zu einer nekrotrophen Lebensweise über. Sie werden daher als hemibiotrophe Pathogene bezeichnet (Oliver und Ipcho 2004).

1.1 Charakteristika biotropher Interaktionen

Während nekrotrophe Pathogene oft über ein breites Wirtsspektrum verfügen und gekennzeichnet sind durch die Sekretion zahlreicher lytischer Enzyme und Toxine, die dem Abbau des Wirtsgewebes dienen (Oliver und Ipcho 2004), sind biotrophe Pathogene darauf angewiesen, die Erkennung durch die Wirtspflanze und die dadurch ausgelösten Abwehrreaktionen möglichst lange zu umgehen. Sie sekretieren daher nur geringe Mengen

lytischer Enzyme, verfügen über hochentwickelte Infektionsstrukturen und bilden spezialisierte Hyphen aus, die über eine Kohlenhydrat- und Protein-reiche Schicht von der pflanzlichen Plasmamembran getrennt sind und eine enge Kontaktzone zwischen Pathogen und Wirtszelle darstellen (Mendgen und Hahn 2002).

Während hemibiotrophe Pathogene nach einiger Zeit zu einer nekrotrophen Lebensweise übergehen, wachsen obligat biotrophe Pathogene in ihrem gesamten Lebenszyklus ausschließlich in lebendem Wirtsgewebe. Die größten Gruppen obligat biotropher Pathogene stellen die Falschen und Echten Mehltaupilze sowie die Rostpilze dar. Sie alle bilden Haustorien, die als zentrale Organe der biotrophen Interaktion betrachtet werden können, da es hier zum Signal- und Nährstoffaustausch zwischen Wirtpflanze und Pathogen kommt (Vögele et al. 2001). Trotz dieses engen Kontaktes zwischen den Interaktionspartnern kommt es in kompatiblen Interaktionen nicht zu einer Abwehrreaktion der Pflanze. Dies legt nahe, dass das Pathogen in der Lage ist, diese Reaktion zu unterdrücken. In inkompatiblen Interaktionen, d.h. bei Infektion einer resistenten Wirtspflanze, beobachtet man hingegen das Absterben der Wirtzellen durch die sogenannte hypersensitive Reaktion (HR), die ein gleichzeitiges Absterben des Pathogens bewirkt (Greenberg und Yao 2004). Die HR wird nach der Erkennung von Avirulenzproteinen des Pathogens durch spezifische Resistenzproteine der Pflanze ausgelöst. Die entsprechenden Gene für Avirulenzproteine und Resistenzproteine evolvieren abhängig voneinander. Diese Form der Interaktion wird als Gen- für-Gen-Erkennung bezeichnet (Flor 1955; Crute 1994). Bei biotrophen Interaktionen handelt es sich somit um sehr spezifische Interaktionen von Pathogenen und Wirtspflanzen, die in den meisten Fällen zu einer hohen Wirtsspezifität der Erreger führt (Lewis 1973).

1.2 Rostpilze

Die Uredinales (Rostpilze) stellen die größte Gruppe obligat biotropher Pflanzenpathogene dar und haben mit über 7000 Arten den größten Anteil an den bisher bekannten Basidiomyceten (Maier et al. 2003; Aime et al. 2006). Unter den Rostpilzen finden sich einige der aggressivsten Pflanzenpathogene, die weltweit enorme wirtschaftliche Schäden in der Agrarwirtschaft verursachen (Alexopoulus et al. 1996). So stellt beispielsweise die derzeitige Ausbreitung des Puccinia graminis f.sp. tritici Stammes Ug99, der Schwarzrost an Weizen auslöst, weltweit eine massive Bedrohung für den Weizenanbau dar (Stokstad 2007). Auch der Erreger des Asiatischen Sojabohnen-Rostes (ASR), Phakopsora pachyrhizi, hat in den letzten Jahren zu immensen Ernteausfällen in der Sojaproduktion geführt und breitet sich

weiter aus (Schneider et al. 2005; Göllner et al. 2010). Die schnelle weltweite Verbreitung aggressiver Rostpilzarten wird durch die Produktion enormer Sporenmengen begünstigt, die mit dem Wind auch über tausende von Kilometern zwischen Kontinenten transportiert werden können (Deising et al. 2002; Kolmer 2005).

Rostpilze umfassen mehr als 100 Gattungen in 13 Familien (Maier et al. 2003, Cummins und Hiratsuka 2003), wobei die Pucciniaceae die umfangreichste dieser Familien darstellen. Sie beinhalten die besonders artenreichen Gattungen Puccinia und Uromyces (Maier et al. 2007).

Weitere wichtige Gattungen der Rostpilze, die Pathogene bedeutender Kulturpflanzen einschließen, sind die Gattungen Phakopsora, Melampsora und Hemileia (Wingfield et al.

2004). Die meisten Rostpilze weisen eine hohe Wirtsspezifität auf. So besiedeln die meisten Arten zwar mehrere Pflanzenarten, jedoch ist die Fähigkeit zur Infektion einer bestimmten Pflanzenart meist nur auf eine bestimmte Untergruppe der Rostpilzart, eine sogenannte forma specialis beschränkt. Innerhalb dieser formae speciales gibt es wiederum Spezialisierungen auf bestimmte Sorten der Wirtspflanzen (Anikster 1984). Diese werden bestimmt durch spezifische Virulenz- bzw. Avirulenz-Gene der Pilzrasse und die Resistenzgene der Wirtspflanzensorte (Flor 1955; siehe Kapitel 1.3).

Der Lebenszyklus der Rostpilze kann mehrere Sporenformen umfassen und die Infektion verschiedener Wirtspflanzen einschließen (Vögele et al. 2009; Kolmer et al. 2009). Die komplexeste Form eines solchen Lebenszyklusses beinhaltet die Ausbildung von fünf unterschiedlichen Sporenformen auf zwei nicht-verwandten Wirtspflanzen. Roste mit einem solchen Lebenszyklus werden als makrozyklisch und heterözisch bezeichnet. Der Zyklus beginnt in diesem Fall mit dem Auskeimen der diploiden Teleutosporen, die zur Überdauerung gebildet werden. Es folgt die Meiose und die Bildung haploider, monokaryotischer Basidiosporen. Diese infizieren das Gewebe des Haplontenwirts, auf dem Pyknien verschiedenen Paarungstyps gebildet werden. Pyknosporen verschmelzen mit Empfängnishyphen des jeweils anderen Paarungstyps und es werden dikaryotische Aecidien gebildet. Aecidiosporen infizieren anschließend den Dikaryontenwirt, auf dem es zu Ausbildung von Uredosporenlagern kommt. Die dikaryotischen Uredosporen sind die für die Verbreitung des Pathogens bedeutendste Sporenform. Zur Überdauerung werden anschließend wieder Teleutosporen gebildet, wobei es zur Verschmelzung der beiden haploiden Zellkerne kommt. Nicht alle Rostpilze bilden alle fünf Sporenformen aus, einige durchlaufen nur einen verkürzten Lebenszyklus, in dem es auch nicht immer zu einem Wirtswechsel kommt. Solche Roste werden als mikrozyklische bzw. autözische Formen bezeichnet (Vögele et al. 2009).

Die Infektion von Wirtspflanzen geht nur von Basidio-, Aecidio- und Uredosporen aus, wobei der Uredosporeninfektion die größte Bedeutung zukommt. Daher ist dieses Stadium im Lebenszyklus der Rostpilze auch das am häufigsten untersuchte (Vögele 2006). Mit am besten untersucht ist die Infektion der Ackerbohne (Vicia faba) durch Uredosporen von Uromyces fabae (Mendgen et al. 1996). Gelangen Uredosporen auf die Blattoberfläche, kommt es zunächst über hydrophobe Wechselwirkungen zur Anhaftung an die pflanzliche Cuticula und nach ausreichender Hydrierung zur Ausbildung eines Adhäsionskissens aus Kohlenhydraten und glykosylierten Polypeptiden (Clement et al. 1993). Der Keimschlauch der Spore bildet, sobald er auf eine Spaltöffnung trifft, ein Appressorium aus, welches durch ein Septum vom Keimschlauch getrennt wird. Nach dem Eindringen in das pflanzliche Gewebe über eine Penetrationshyphe wird in der Atemhöhle ein wiederum durch ein Septum getrenntes substomatäres Vesikel gebildet. Von diesem Vesikel aus kommt es zur Differenzierung von Infektionshyphen im Interzellularraum des Gewebes. Trifft eine Infektionshyphe auf eine Mesophyllzelle wird die Hyphenspitze durch ein Septum abgetrennt und bildet eine Haustorienmutterzelle. Über eine Penetrationshyphe dringt der Rostpilz in die Wirtzelle ein, wo schließlich ein Haustorium entsteht (Abbildung 1-1).

Abbildung 1-1: Von Uredosporen ausgehende Infektionsstrukturen der Rostpilze. S: Uredo- spore; G: Keimschlauch; A: Appressorium; P:

Penetrationshyphe; V: substomatäres Vesikel; I:

Infektionshyphe; HM: Haustorienmutterzelle; H:

Haustorium. Abbildung aus Vögele et al. (2009).

Haustorien sind die kennzeichnende Struktur der biotrophen Interaktion. Sie können nur in planta ausgebildet werden, was darauf schließen lässt, dass auch Signale der Pflanzenzelle zur Induktion der Haustorienbildung notwendig sind (Heath 1990). Während der Ausbildung des Haustorium wird die Zellwand der Mesophyllzelle durchbrochen, die Plasmamembran der pflanzlichen Zelle jedoch nur eingestülpt, so dass es nicht zu einem direkten Kontakt mit dem Cytoplasma der Wirtszelle kommt. Die Plasmamembran des Pilzes und die Membran der Pflanzenzelle, die nun als extrahaustorielle Membran bezeichnet wird, werden durch die pilzliche Zellwand und die extrahaustorielle Matrix voneinander getrennt (Abbildung 1-2;

Szabo und Bushnell 2001). Der sogenannte Halsring trennt die extrahaustorielle Matrix vom

pflanzlichen Apoplasten, sodass diese beiden Kompartimente abgegrenzt bleiben. Die extrahaustorielle Membran zeigt Veränderungen gegenüber normalen pflanzlichen Plasmamembranen, da ihr Intramembranpartikel fehlen und der Sterol-Gehalt reduziert ist (Harder und Mendgen 1982). Zudem ist in der extrahaustoriellen Membran keine ATPase- Aktivität nachweisbar (Spencer-Phillips und Gay 1981), wodurch keine Kontrolle über den Transport von Nährstoffen besteht (Vögele et al. 2009). Die extrahaustorielle Matrix wird aus pilzlichen und hauptsächlich pflanzlichen Komponenten gebildet. Sie beinhaltet hauptsächlich Kohlenhydrate und Proteine (Harder und Chong 1991). Die Zone zwischen den Membranen der Wirtzelle und des Pathogens stellt somit ein abgegrenztes Kompartiment dar, in der die für den Nährstoff- und Signalaustausch notwendigen Bedingungen aufrecht erhalten werden können (Heath und Skalamera 1997).

Abbildung 1-2: Schematische Darstellung eines Haustoriums. HMC: Haustorienmutterzelle; HN:

Haustorienhals; R: Haustorienhalsring; HB:

Haustorienkörper; FN: pilzlicher Zellkern; M:

Mitochondrium; E: extrahaustorielle Matrix (EHM); EM: extrahaustorielle Membran; W:

pflanzliche Zellwand; P: pflanzliche Plasma- membran; VE: Vesikel; G: Golgi; ER: endo- plasmatisches Retikulum der Pflanzenzelle; N:

pflanzlicher Zellkern. Abbildung aus Kolmer et al.

(2009).

Haustorien sind die zentralen Organe der Nährstoffaufnahme durch den Rostpilz. So wurden ein haustorienspezifischer Hexosetransporter sowie mehrere Aminosäuretransporter beschrieben (Vögele et al. 2001; Struck et al. 2002; Struck et al. 2004). In der Haustorienmembran konnte eine H⁺-ATPase identifiziert werden (Struck et al. 1996), die über den Aufbau eines Protonengradienten möglicherweise die für die Transportprozesse notwendige Energie liefert (Hahn und Mendgen 1997). Die aufgenommenen Zucker werden durch Zuckeralkoholdehydrogenasen in die Speicher- und Transportstoffe Mannitol und Arabitol umgewandelt (Vögele et al. 2005; Link et al. 2005).

Eine weitere zentrale Rolle spielen die Haustorien wahrscheinlich bei der Beeinflussung des pflanzlichen Stoffwechsels und der Unterdrückung der pflanzlichen Abwehrreaktion während der biotrophen Interaktion (Mendgen et al. 2000). So wird vermutet, dass Haustorien nicht nur Proteine sekretieren, die für die Nährstoffaufnahme notwendig sind, sondern auch Proteine, die der Manipulation der Wirtzelle dienen (Vögele 2006). Eine Reihe von Untersuchungen zur stadienspezifischen Expression von sekretierten Proteinen in Rostpilzen haben einige haustoriell exprimierte Proteine identifizieren können. Für den Ackerbohnenrost U. fabae wurden einige sekretierte Vertreter der in planta induced genes (PIGs) sowie die HSPs (haustoriell sekretierte Proteine), für den Flachsrost Melampsora lini die HESPs (haustorially expressed secreted proteins) sowie für Uromyces appendiculatus einige Homologe dieser Proteine beschrieben (Hahn et al. 1997; Jakupovic et al. 2006; Catanzariti et al. 2005; Putthof et al 2008; Link et al. 2008), jedoch kann den meisten dieser Proteine noch keine Funktion zugeordnet werden und sie zeigen wenige Homologien außerhalb der von Rostpilzen bekannten Proteine. Von besonderem Interesse unter den haustoriell sekretieren Proteinen sind solche, die in das Cytoplasma der Wirtspflanze gelangen. Es wird vermutet, dass auch die Rostpilze, ähnlich wie die biotrophen Oomyceten, über eine Reihe solcher intrazellulärer Proteine, sogenannter Effektoren, verfügen, die der direkten Manipulation der Wirtszellen dienen (Mendgen et al. 2000). Einige der haustoriell sekretierten Proteine konnten tatsächlich im Cytoplasma der Wirtszellen nachgewiesen werden. So konnte ein indirekter Beweis für die cytoplasmatische Lokalisation einiger Proteine aus M. lini durch den Nachweis der Interaktion mit cytoplasmatischen Resistenzproteinen erbracht werden (Dodds et al. 2004).

Das erste haustoriell sekretierte Protein, für das ein Transfer ins pflanzliche Cytoplasma über eine Immunlokalisierung direkt gezeigt werden konnte, ist RTP1p (Rust Transferred Protein 1) aus U. fabae (Kemen et al. 2005).

1.3 Pflanzliche Resistenzmechanismen

Die Resistenz von Pflanzen gegen Pathogenbefall kann in mehrere Stufen unterteilt werden.

Der grundlegende Resistenzmechanismus ist die sogenannte Nicht-Wirts-Resistenz, die in den allermeisten Fällen eine Infektion durch ein Pathogen verhindert. Sie basiert auf physikalischen und chemischen Barrieren, die ein Eindringen des Pathogens unmöglich machen (Ellis 2006). Ist ein Pathogen jedoch in der Lage, diese Barrieren zu überwinden und die Pflanze als Wirtspflanze zu erschließen, kommt es zur Infektion. Während der Infektion werden in der Regel verschiedene Komponenten des Pathogens (PAMPs, pathogen

associated molecular patterns) oder der Wirtspflanze (DAMPs, damage associated molecular patterns) freigesetzt, die es der Pflanze ermöglichen, einen Pathogenbefall zu erkennen (Boller und Felix 2009; siehe Abbildung 1-3). Bei den PAMPs handelt es sich um Pathogen- typische Komponenten wie Flagellin oder Chitin, die durch PRRs (pathogen recognition receptors) in der Plasmamembran der Pflanzenzellen erkannt werden, wohingegen DAMPs endogene Substanzen wie beispielsweise Bruchstücke der pflanzlichen Zellwand sind, die durch mikrobielle Enzyme freigesetzt wurden (Boller und Felix 2009). Kommt es zur Erkennung eines Pathogenbefalls aufgrund von PAMP- oder DAMP-Freisetzung wird die sogenannte PTI (PAMP triggered immunity)-Antwort ausgelöst, die relativ langsam abläuft und unter anderem durch Phytoalexin-Bildung und Callose-Ablagerung an der Penetrationsstelle gekennzeichnet ist (Glazebrook 2005).

Abbildung 1-3: Pflanzliche Resistenzmechanismen. A: PTI und ETI; Abbildung aus Dodds und Rathjen (2010). Die PTI (PAMP triggered immunity) wird durch die Erkennung typischer Komponenten des Pathogens ausgelöst und kann durch Effektoren unterdrückt werden. Effektoren können wiederum erkannt werden und lösen so die ETI (effector triggered immunity) aus. PRR: Pattern Recognitions Receptor; NB-LRR: Nucleotide Binding Leucine Rich Repeat-Rezeptor, Resistenzprotein der Pflanze, das die ETI induziert. B: Das Zick-Zack- Modell der pflanzlichen Abwehr; Abbildung aus Jones und Dangl (2006). Die ETS (effector triggered susceptibility) kann durch Erkennung der Effektoren (rot) durch pflanzliche Resistenzproteine überwunden werden, wodurch die HR (hypersensitive Reaktion) ausgelöst wird. Diese kann durch weitere Effektoren (blau) verhindert werden, woraufhin neue Resistenzproteine gebildet werden, sodass der Schwellenwert zur Auslösung der ETI wieder überschritten wird. Avr-R: Bindung des Avirulenz-Proteins (Effektor, der durch die Pflanze erkannt wird) durch der R-Protein (Resistenzprotein).

Einige Pathogenrassen können diese PTI durch die Manipulation der Wirtszelle mittels sogenannter Effektorproteine umgehen, es kommt zur Effektor-vermittelten Anfälligkeit (effector triggered susceptibility, ETS) der Wirtspflanze. Diese Effektoren können nun wiederum von Resistenzproteinen einiger Wirtspflanzensorten erkannt werden, wodurch eine Effektor-vermittelte Resistenzreaktion (effector triggered immunity, ETI) hervorgerufen wird (Abbildung 1-3; siehe Kap. 1.3). Die ETI ist somit sorten- und rassenspezifisch und entspricht im Wesentlichen der Gen-für-Gen-Erkennung (Dodds und Rathjen 2010). Die Symptome der

ETI ähneln denen der PTI, typisch ist jedoch das schnelle Auftreten der hypersensitiven Reaktion (HR), die zum Absterben infizierten Zellen führt (Dodds und Rathjen 2010). Auch die ETI kann ihrerseits durch weitere Effektorproteine überwunden werden, sodass es zu einer parallelen Entwicklung von Pathogen-Effektoren und pflanzlichen Resistenzproteinen kommt, die als „molekulares Wettrüsten“ beschrieben wurde (Boller und Felix 2009).

1.4 Manipulation der Wirtspflanzen durch Pathogene

Die erfolgreiche Infektion setzt eine Manipulation der Wirtspflanze durch das Pathogen voraus. Es muss die präformierten Barrieren sowie die Resistenzreaktionen umgehen und die Verfügbarkeit von Nährstoffen sicherstellen (Hok et al. 2010). Pathogene haben hierfür viele unterschiedliche Strategien entwickelt. Eine Möglichkeit, in den Wirtsstoffwechsel einzugreifen ist die Bildung von Toxinen. So führt beispielsweise die Sekretion von Fusicoccin A aus dem Ascomyceten Fusicoccum amygdali zu einer Öffnung der pflanzlichen Stomata und ermöglicht so das Eindringen des Erregers (Würtele et al. 2003). Eine besondere Gruppe von Toxinen stellen die HSTs (host selective toxins) nekrotropher Pathogene dar (Tan et al. 2010). Sie interagieren spezifisch mit Proteinen der Wirtzelle und lösen so gezielt eine hypersensitive Reaktion aus, die zum Absterben der Wirtszellen und der Besiedelung des toten Gewebes durch das Pathogen führt. Dies konnte unter anderem für PtrToxA aus Pyrenophora tritici-repentis und SnTox3 aus Stagonospora nodorum gezeigt werden (Manning et al. 2009; Liu et al. 2009). Eine weitere Strategie zur Überwindung pflanzlicher Resistenz ist die Sekretion von Enzymen, die die Produkte der pflanzlichen Abwehrreaktion abbauen oder so modifizieren, dass es nicht zur Schädigung des Pathogens kommt. So kann beispielsweise Avenacin, das in Haferwurzeln bei Befall durch Gaeumannomyces graminis var. avenae gebildet wird, durch eine Avenacin-Hydrolase des Pathogens detoxifiziert werden (Morrissey und Osbourn 1999).

Eine besondere Form der Beeinflussung der Wirtszellen stellt die Manipulation durch Effektorproteine aus biotrophen und hemibiotrophen Pathogenen dar. Nachdem zahlreiche solcher Effektoren aus bakteriellen Pathogenen beschrieben wurden, stehen derzeit auch Effektorproteine aus Oomyceten und Pilzen im Mittelpunkt der Forschung. Bei ihnen handelt es sich um Proteine, die in die Interaktionszone zwischen Wirt und Pathogen, d.h. an der Spitze invasiver Hyphen, von Haustorien oder dem BIC (biotrophic interfacial complex) von Magnaporthe oryzae sekretiert werden (Panstruga und Dodds 2009; Khang et al. 2010). Sie werden nach ihrem Wirkungsort in extrazelluläre Effektoren, die im pflanzlichen Apoplasten

wirken, und intrazelluläre Effektoren, die weiter ins pflanzliche Cytoplasma transportiert werden, eingeteilt (de Jonge et al. 2011).

1.4.1 Extrazelluläre Effektoren

Extrazelluläre oder apoplastische Effektoren sind oft klein und Cystein-reich, wobei die Ausbildung von Disulfidbrücken zu einer Stabilisierung der Proteine im Apoplasten beitragen könnte (Kamoun 2007). Über die Funktionen dieser apoplastischen Effektoren ist bis auf einige Ausnahmen wenig bekannt. Es konnte gezeigt werden, dass Avr2 aus Cladosporium fulvum und EPIC1 sowie EPIC2B aus Phytophthora infestans eine pflanzliche Cysteinprotease hemmen, die an der Aktivierung der hypersensitiven Reaktion beteiligt ist (van Esse et al. 2008; Shabab et al. 2008; Song et al. 2009). Weitere Effektoren sind am Chitin-Abbau bzw. dem Schutz vor pflanzlichen Chitinasen beteiligt. Ecp6 aus C. fulvum baut Chitin-Oligosaccharide ab, um eine Aktivierung pflanzlicher Chitin-Rezeptoren zu vermeiden (de Jonge et al. 2010). Avr4 dagegen bindet an die pilzliche Zellwand und verhindert so die Zerstörung durch Chitinasen (van den Burg et al. 2006).

1.3.2 Intrazelluläre Effektoren

Auch intrazelluläre Effektorproteine von Oomyceten und Pilzen werden zunächst in den Apoplasten sekretiert und von dort in das Cytoplasma der Wirtszellen transportiert. Die Mechanismen dieser Translokation sind noch nicht vollständig aufgeklärt, es ist jedoch bekannt, dass die meisten der beschriebenen Effektoren konservierte Sequenzmotive besitzen, die für den Transport notwendig sind (Whisson et al. 2007; Dou et al. 2008b; Schornack et al.

2010; Rafiqi et al. 2010; Kale et al. 2010). Viele der Effektoren aus Oomyceten enthalten ein N-terminales RxLR-Motiv, das die Aufnahme in die pflanzlichen Zellen vermittelt. Es ähnelt dem Pexel-Motiv, das für den Transport von Effektorproteinen des Malaria-Erregers Plasmodium falciparum zuständig ist (Whisson et al. 2007). Der Transport erfolgt auch in Abwesenheit der Pathogene, so dass anzunehmen ist, dass Wirtskomponenten daran beteiligt sind (Dou et al. 2008b). Funktionelle Varianten des RxLR-Motivs wurden auch für einige pilzliche Effektoren beschrieben (Rafiqi et al. 2010; Kale et al. 2010). Diese Motive binden an PI3P (Phosphatidylinositol-3-Phosphat) in der pflanzliche Plasmamembran und werden möglicherweise über Vesikel-vermittelte Endocytose aufgenommen (Kale et al. 2010). Eine weitere Gruppe von cytoplasmatischen Effektoren in Oomyceten stellen die Crinkler-Protein

dar (Schornack et al. 2010). Sie verfügen ebenfalls über ein Translokationsmotiv, das sogenannte LxLFLAK-Motiv. Im Gegensatz zu den RxLR-Effektoren finden sich die Crinkler-Proteine nicht nur in Haustorien-bildenden Oomyceten, sondern sind auch in vielen anderen Oomyceten verbreitet, so dass angenommen wird, dass sie eine ursprünglichere Gruppe von Effektoren bilden (Schornack et al. 2010). Der Mechanismus ihrer Translokation ist bislang unbekannt. In einigen möglichen Effektoren aus Echten Mehltau-Pilzen und Rostpilzen wurde ein weiteres Sequenzmotiv, das Y/F/WxC-Motiv, identifiziert, das ein weiteres Transloktionssignal in biotrophen Pilzen darstellen könnte (Godfrey et al. 2010).

Beweise für eine tatsächliche Beteiligung am Transport in die Wirtszellen fehlen jedoch bislang. Die bisherigen Untersuchungen lassen den Schluss zu, dass mehrere unterschiedliche Sequenzmotive am Transport von Effektoren in das pflanzliche Cytoplasma beteiligt sind und unterschiedliche Translokationsmechnismen existieren.

Die Funktionen zahlreicher intrazellulärer Effektorproteine bakterieller Pathogene sind inzwischen beschrieben. Sie agieren als Transkriptionsfaktoren und sind an der Modifizierung und am Abbau von Wirtsproteinen beteiligt (Espinosa und Alfano 2004). Im Gegensatz dazu ist über die Funktion der cytoplasmatischen Effektoren aus Oomyceten und Pilzen kaum etwas bekannt. Für viele der bekannten Effektoren konnte eine Avirulenz-Funktion nachgewiesen werden. Sie interagieren mit pflanzlichen Resistenzproteinen und lösen so eine hypersensitive Reaktion aus (Gan et al. 2010). Hierzu gehören beispielsweise AvrP123, AvrM, AvrP4, AvrP123 aus M. lini, AvrPita aus M. oryzae, Avra1 und Avrk1 aus Blumeria graminis und einige RxLR-Effektoren aus P. infestans und P. sojae (Catanzariti et al. 2006;

Jia et al. 2000; Ridout et al. 2006; Morgan und Kamoun 2007). Nur für wenige konnte eine Funktion für die Virulenz des Pathogens nachgewiesen werden. So können ATR1 und ATR13 aus Hyaloperonospora arabidopsidis die Callose-Bildung hemmen (Sohn et al. 2007). Avr1b aus P. sojae und einige weitere RxLR-Effektoren, die ein bestimmtes W-, Y- oder L-Motiv besitzen, können den durch BAX1, ein Apoptose-auslösendes Protein aus Mäusen, vermittelten Zelltod unterdrücken (Dou et al. 2008a). Das funktionell bislang am besten charakterisierte Effektorprotein ist Avr3a aus P. infestans. Es interagiert einerseits mit dem Resistenzprotein R3a der Wirtspflanzen und löst so die hypersensitive Reaktion aus, andererseits stabilisiert es die E3-Ligase CMPG1, die eine Rolle im durch den Elicitor INF1 vermittelten Zelltod spielt und unterdrückt diesen somit (Bos et al. 2010). Nur wenige Effektoren zeigen Homologien zu bekannten und funktionell charakterisierten Proteinen.

Lediglich für AvrP123 aus M. lini, welches Homologien zu Kazal-ähnlichen Protease- Inhibitoren zeigt, und AvrPita aus M. oryzae, das Ähnlichkeiten mit Metalloproteasen

aufweist, konnten mögliche Funktionen vorhergesagt werden (Catanzariti et al. 2006; Orbach et al. 2000). Experimentelle Beweise für die Funktion fehlen jedoch bisher.

1.5 Rust Transferred Protein 1 (RTP1p)

Bei der Untersuchung sogenannter in planta induced genes (PIGs, Hahn et al. 1997) aus dem Ackerbohnenrost Uromyces fabae konnte ein Protein (RTP1p) identifiziert werden, welches haustorienspezifisch exprimiert wird und nach der Sekretion in die extrahaustorielle Matrix in das Cytoplasma der Wirtszelle transferiert wird (Kemen et al. 2005). Erstmals konnte dabei die Lokalisierung eines pilzlichen Effektorproteins im pflanzlichen Cytoplasma durch Immunfluoreszenzmarkierung direkt nachgewiesen werden (Abbildung 1-4). Homologe des Proteins konnten anschließend in U. striatus (Us-RTP1p), U. appendiculatus (Ua-RTP1p) und U. vignae (Uv-RTP1p) identifiziert werden, wobei die Sequenz von Us-RTP1 vollständig ermittelt werden konnte.

Abbildung 1-3: Lokalisation von Uf-RTP1p im Cytoplasma der pflanzlichen Wirtszelle.

Immunmarkierung des RTP1p aus Uromyces fabae in Zellen von Vicia faba. Das Cytoplasma der Wirtszellen um das Haustorium (H) und der pflanzliche Zellkern (N) sind markiert. Zellen ohne Haustorium zeigen keine Markierung.

Abbildung aus Kemen et al. (2005).

Bei Uf-RTP1p handelt es sich um ein relativ kleines Protein mit einem Molekulargewicht von ca. 25 kDa. Es besitzt eine N-terminale Sekretionssignal-Sequenz und liegt N-glykosyliert vor. Zudem gibt es Hinweise darauf, dass Uf-RTP1p weiter posttranslational prozessiert wird (Kemen 2006a). Ein Sequenzvergleich mit den homologen Proteinen konnte zeigen, dass der N-terminale Teil des Proteins stark variabel, der C-Terminus dagegen hoch konserviert ist.

Uf-RTP1p bildet Dimere und größere Multimere aus und zeigt nach heterologer Expression in Pichia pastoris ein Aggregationsverhalten, das dem amyloid-ähnlicher Proteine gleicht (Kemen 2006b). So können in Abhängigkeit von pH-Wert, Redox-Potential und Salzkonzentration amorphe Plaques oder filamentartige Strukturen nachgewiesen werden. Es gibt Hinweise darauf, dass solche Filamente des Proteins auch im pflanzlichen Cytoplasma

vorliegen. Das Aggregationsverhalten von Uf-RTP1p kann vermutlich auf einen Sequenzabschnitt im C-Terminus des Proteins zurückgeführt werden, der isoliert als synthetisches Peptid ein ähnliches Aggregationsverhalten zeigt. Die Struktur dieser Aggregationsdomäne wird vermutlich aus zwei antiparallen -Strängen gebildet, die über einen Loop verbunden sind. Die Interaktion der Protein-Monomere in den Filamenten wird wahrscheinlich über diese Struktur vermittelt. Die Funktion von Uf-RTP1p in der pflanzlichen Zelle konnte bislang noch nicht geklärt werden. Zwar existieren Hinweise auf pflanzliche Interaktionspartner, diese konnten jedoch noch nicht identifiziert werden (Kemen 2006a).

1.6 Zielsetzung

Nach der Identifizierung und Charakterisierung der RTP1p-Homologe aus mehreren Uromyces-Arten sollten im Rahmen dieser Arbeit Homologe aus weiteren Rostpilz-Arten untersucht und mit den Uromyces-Vertretern verglichen werden. Dies sollte zum einen Aufschluss über das Vorkommen von RTP1 inner- und außerhalb der Rostpilze geben, so wie auch die Identifizierung besonders konservierter Sequenzbereiche mit einer potentiellen strukturellen und funktionellen Bedeutung ermöglichen. Die weiterführende biochemische Charakterisierung von RTP1p sollte die Bedeutung der Sekundärstruktur und des Aggregationsverhaltens klären. Hierfür sollte vor allem die Rolle von Disulfidbrücken für die Proteinfaltung und -stabilität sowie die Bedeutung der möglichen -Aggregationsdomäne untersucht werden.

Einen weiteren Schwerpunkt dieser Arbeit sollte die funktionelle Charakterisierung von RTP1p auf Grundlage der Analyse konservierter Sequenzbereiche sowie der Proteinstruktur darstellen. Die Identifizierung potentieller Interaktionspartner sollte weitere Hinweise auf die Rolle von RTP1p in der biotrophen Interaktion liefern.

2. Material und Methoden

2.1 Chemikalien

Sofern nicht gesondert im Text vermerkt, wurden alle Chemikalien in analytischem Reinheitsgrad von folgenden Firmen bezogen:

Becton Dickinson GmbH, Heidelberg

Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH, Taufkirchen Merck KGaA, Darmstadt

Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg

2.2 Pflanzen- und Pilzmaterial

Die für die beschriebenen Experimente verwendeten Pflanzen und pilzlichen Erreger sind in Tabelle 2-1 aufgeführt.

Tabelle 2-1: Verwendete Wirtspflanzen und entsprechende Pathogene

Wirtspflanze Herkunft Pathogen

Vicia faba L. 'Con Amore' Nickerson-Zwaan, Edemissen Uromyces fabae (PERS.) SCHROETER (Rasse I2) Medicago truncatula GAERTN.

'Jemalong' A17

INRA- Montpellier, Montpellier, Frankreich

Uromyces striatus SCHROETER (Rasse KN1)

Vigna unguiculata 'California Black Eye'

Monsanto Company,St Louis, MO, USA

Uromyces vignae CPRI Phaseolus vulgaris 'Primel' Enza Zaden Deutschland

GmbH & Co. KG, Dannstadt- Schauernheim

Uromyces appendiculatus SWBRI

Coffea arabica ’Catuai’ Centro de Investigação das Ferrugens do Cafeeiro, Lissabon, Portugal

Hemileia vastatrix Isolat 1427

Pyrus communis L. Freiland-Probe Gymnosporangium sabinae

2.2.1 Anzucht und Inokulation von V. faba, V. unguiculata, P. vulgaris und M. truncatula

Die Samen wurden in gedämpfter Einheitserde ausgelegt und über 21 Tage bei 21 °C und einer Licht-Dunkel-Periode von 16/8 h angezogen. Die Uredosporen der entsprechenden Rostpilze wurden in einer Konzentration von 50 mg/ml in einer 0,07 %-igen Milchpulver- Suspension auf die 21 Tage alten Pflanzen aufgesprüht. Das Aufbringen der Sporen von U.

striatus erfolgte in einer Konzentration von 10 mg/ml in Kerosin. Es folgte eine 24-stündige Inkubation der Pflanzen im Dunkeln bei 100 % Luftfeuchtigkeit und die weitere Kultivierung im Gewächshaus bei einer Licht-Dunkel-Periode von 16/8 h für 7 bis 14 Tage. Die Ernte der Uredosporen erfolgte 7 bis 14 Tage nach Inokulation.

2.2.2 Anzucht und Inokulation von C. arabica

Die Anzucht der C. arabica-Pflanzen erfolgte in Einheitserde bei Tag/Nacht-Temperaturen von 28/23 °C, nach Keimung bei 25/20 °C bei einer relativen Luftfeuchte von 75 %. Zur Inokulation mit H. vastatrix wurden die Sporen in einer Konzentration von 10 mg/ml in 0,5%- iger Milchpulversuspension mit einem Pinsel auf die Unterseite noch nicht vollständig ausgewachsener Blätter aufgebracht. Die Pflanzen wurden anschließend für 24 h bei 100 % Luftfeuchtigkeit inkubiert und anschließend im Gewächshaus bei 75 % relativer Luftfeuchte und Tag/Nacht-Temperaturen von 25/20 °C weiter kultiviert. Die Probennahme erfolgte nach dem Durchbrechen der Pusteln nach ca. 4 Wochen.

2.3 Bakterienstämme

Die für Klonierungen und Plasmidvermehrung verwendeten Bakterienstämme sind in Tabelle 2-2 aufgeführt.

Tabelle 2-2: Verwendete Escherichia coli-Stämme

Stamm Genotyp Referenz

TG1 supE hsd 5 thi (lac-proAB) (rK12– mK12-), [F’traD36 pro A+B+, laclq, lacZ M15]

(Sambrook und Russell 2001)

DH5 F-, 80dlacZ M15, (lacZYA-argF)U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17(rk-, mk+), phoA, supE44, -, thi-1, gyrA96, relA1

Invitrogen

Die Kultivierung der Stämme erfolgte in LB-Flüssigmedium oder auf LB-Agar bei 37 °C.

2.4 Hefestämme

Die für die heterologe Expression von Uf-RTP1p und Us-RTP1p sowie verschiedener mutierter Proteine verwendeten Hefestämme sind in Tabelle 2-3 aufgeführt.

Tabelle 2-3: Verwendeter Pichia pastoris-Stamm

Stamm Genotyp Referenz

KM71 arg4 his4 aox1::ARG4 Invitrogen

Die Kultivierung erfolgte auf YPD-Agar bei 30 °C.

2.5 Verwendete Plasmide

Die für diese Arbeit hergestellten Plasmide sowie weitere verwendete Plasmide sind in Tabelle 2-4 aufgeführt.

Tabelle 2-4: Verwendete Plasmide

Plasmid Selektion Promotor Herkunft Verwendung

pPIC3.5 Amp^R/HIS4 AOX1 Invitrogen Expression in P. pastoris

pPIC3.5K Amp^R/HIS4 AOX1 Invitrogen Expression in P. pastoris

pAO815 Amp^R/HIS4 AOX1 Invitrogen Expression in P. pastoris

pDrive Amp^R, Kan^R T7lac Qiagen Klonierung von

Sequenzfragmenten pLUG^® Amp^R, Kan^R T7lac iNtRON Biotechnology Klonierung von

Sequenzfragmenten pPIC3.5::PIG7fullhis Amp^R/HIS4 AOX1 A. Kemen Expression in P. pastoris pPIC3.5::C44S Amp^R/HIS4 AOX1 diese Arbeit Expression in P. pastoris pPIC3.5::C104S Amp^R/HIS4 AOX1 diese Arbeit Expression in P. pastoris pPIC3.5::C117S Amp^R/HIS4 AOX1 diese Arbeit Expression in P. pastoris pPIC3.5::C147S Amp^R/HIS4 AOX1 diese Arbeit Expression in P. pastoris pPIC3.5::C179S Amp^R/HIS4 AOX1 diese Arbeit Expression in P. pastoris pPIC3.5::C104/179S Amp^R/HIS4 AOX1 diese Arbeit Expression in P. pastoris pPIC3.5::C147/179S Amp^R/HIS4 AOX1 diese Arbeit Expression in P. pastoris pPIC3.5::V142P Amp^R/HIS4 AOX1 diese Arbeit Expression in P. pastoris pPIC3.5::V142A Amp^R/HIS4 AOX1 diese Arbeit Expression in P. pastoris pPIC3.5::V150A Amp^R/HIS4 AOX1 diese Arbeit Expression in P. pastoris pPIC3.5::V142/150A Amp^R/HIS4 AOX1 diese Arbeit Expression in P. pastoris pPIC3.5::F141A Amp^R/HIS4 AOX1 diese Arbeit Expression in P. pastoris pPIC3.5::F151A Amp^R/HIS4 AOX1 diese Arbeit Expression in P. pastoris pPIC3.5::F141/151A Amp^R/HIS4 AOX1 diese Arbeit Expression in P. pastoris pPIC3.5::V134A Amp^R/HIS4 AOX1 diese Arbeit Expression in P. pastoris pPIC3.5::Y132F Amp^R/HIS4 AOX1 diese Arbeit Expression in P. pastoris pPIC3.5::T135F Amp^R/HIS4 AOX1 diese Arbeit Expression in P. pastoris pPIC3.5K:usRTP1p Amp^R/HIS4 AOX1 diese Arbeit Expression in P. pastoris pAO815::2usRTP1 Amp^R/HIS4 AOX1 diese Arbeit Expression in P. pastoris pPIC3.5:INV Amp^R/HIS4 AOX1 R. Vögele Expression in P. pastoris

2.6 Kulturmedien

2.6.1 Medien zur Kultivierung von Bakterien

Die Zusammensetzung der zur Anzucht und Selektion von Bakterienstämmen verwendeten Medien ist in den Tabellen 2-5 und 2-6 aufgeführt.

Tabelle 2-5: LB-Medium^* (Luria-Bertani-Medium; Sambrook und Russel 2001)

*Festmedien enthielten zusätzlich 1,7 % (w/v) Agar Agar. Selektivmedien wurde nach dem Autoklavieren Ampicillin (100 µg/ml) oder Kanamycin (50 µg/ml) zugeben. Das Medium zur Blau-Weiß-Selektion enthielt Ampicillin (100 µg/ml), X-Gal (4,9 mM) und IPTG (1,0 mM).

Tabelle 2-6: SOB-Medium^* ((Super Optimal Broth-Medium; Sambrook und Russel 2001)

Komponenten Konzentration

Bacto Trypton 2,0 % (w/v)

Select Yeast Extract 0,5 % (w/v)

NaCl 8,5 mM

KCl 2,5 mM

MgCl2 10,0 mM

*Der pH-Wert wurde mit NaOH auf 7,0 eingestellt. MgCl2 wurde jeweils vor Benutzung zugegeben.

2.6.2 Medien zur Kultivierung von Hefen

Die Medien wurden entsprechend den Angaben des Herstellers (Pichia Expression Kit Version L 00012625-00433, Invitrogen, Karlsruhe) angesetzt. Die jeweilige Zusammensetzung ist in den Tabellen 2-7 bis 2-11 aufgeführt.

Tabelle 2-7: YPD-Medium (Yeast Extract Peptone Dextrose-Medium)

Komponenten Konzentration

Select Yeast Extract 1 % (w/v)

Bacto Pepton 2 % (w/v)

D-Glucose 2 % (w/v)

Komponenten Konzentration

Bacto Trypton 1,0 % (w/v)

Select Yeast Extract 0,5 % (w/v)

NaCl 171,1 mM

Tabelle 2-8: RD-Medium (Regeneration Dextrose-Medium)

Komponenten Konzentration

Sorbitol 1,00 M

D-Glucose 2,00 % (w/v)

Agar Agar 2 ,00% (w/v)

Difco^TM Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and (NH4)2SO4

0,34 % (w/v)

Ammoniumsulfat 76,00 mM

Biotin 1,60 µM

L-Glutaminsäure 0,05 % (w/v)

L-Methionin 0,05 % (w/v)

L-Lysin 0,05 % (w/v)

L-Leucin 0,05 % (w/v)

L-Isoleucin 0,05 % (w/v)

Tabelle 2-9: MD-Medium (Minimal Dextrose-Medium)

Komponenten Konzentration

D-Glucose 2,00 % (w/v)

Ammoniumsulfat 76,00 mM

Difco^TM Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and (NH4)2SO4

0,34 % (w/v)

Biotin 1,64 µM

Agar Agar 1,50 % (w/v)

Tabelle 2-10: MGY-Medium (Minimal Glycerin-Medium)

Komponenten Konzentration

Kaliumphosphatpuffer pH 6 0,10 M

Glycerin 1,00 % (v/v)

Ammoniumsulfat 76,00 mM

Difco^TM Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and (NH4)2SO4

0,34 % (w/v)

Biotin 1,64 µM

Tabelle 2-11: MM-Medium (Minimal Methanol-Medium)

Komponenten Konzentration

Kaliumphosphatpuffer pH 6 0,10 M

Methanol 1,00 % (v/v)

Ammoniumsulfat 76,00 mM

Difco^TM Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and (NH4)2SO4

0,34 % (w/v)

Biotin 1,64 µM

2.7 Kultivierung von Pichia pastoris zur heterologen Proteinexpression

Die Expression der verschiedenen RTP-Konstrukte erfolgte im P. pastoris-Stamm KM71 nach einem modifizierten Protokoll nach Stratton et al. (1998). Die verschiedenen Klone wurden zunächst für 5-6 Tage auf MD-Agar bei 30 °C angezogen und anschließend mehrere Kolonien in 25 ml MGY-Medium in 300 ml-Erlenmeyerkolben überimpft. Diese Kulturen

wurden über Nacht bei 30 °C und 360 rpm in einem KS10 Rotationsschüttler (Edmund Bühler, Tübingen, Deutschland) inkubiert. Anschließend wurden die Kulturen mit MGY- Medium auf eine OD₆₀₀ von 0,25 eingestellt und je 250 ml der Kulturen in 1l-Schikane- Kolben über 12 h bei 30 °C und 360 rpm geschüttelt. Nach 5 minütiger Zentrifugation der Kulturen bei 2000 rpm in einem GSA-Rotor wurde der Überstand verworfen, das Zellpellet mit H₂O_dest gewaschen und die Zellen anschließend wie oben pelletiert. Das Pellet wurde anschließend in MM-Medium resuspendiert und die Kulturen auf eine OD₆₀₀ von 30 eingestellt. Die weitere Kultivierung erfolgte in 300 ml-Schikanekolben bei 30 °C und 360 rpm für 72 h. Nach 24 und 48 h wurde Methanol zu einer Endkonzentration von 0,5 % zugegeben, sowie die Kulturen mit 24 %iger Ammoniak-Lösung auf pH 6,0 eingestellt. Die Kulturen wurden anschließend 10 min bei 6000 rpm im GSA-Rotor zentrifugiert und der Protein-haltige Überstand abgenommen.

2.8 Molekularbiologische Methoden

2.8.1 DNA-Präparation aus Pflanzenmaterial

2.8.1.1 Extraktion mit Chelex

Gesundes oder infiziertes Blattmaterial (100-500 mg) wurden 10 min in flüssigem N₂ gemörsert und anschließend 500 µl 10 % Chelex (BioRad Laboratories GmbH, München) zugegeben. Die Proben wurden für 60 min bei 65 °C inkubiert und anschließend für 5 min auf 95 °C erhitzt. Nach 10minütiger Zentrifugation bei v_max in einer Eppendorf-Tischzentrifuge wurde der Überstand abgenommen und für die weitere Verwendung bei 4 °C gelagert.

2.8.1.2 Extraktion mit dem ZR Plant/Seed DNA Kit^TM

Gesundes oder infiziertes Pflanzenmaterial (200-400 mg) wurden entweder 10min in flüssigen N₂ gemörsert oder in einer Kugelschwingmühle (MM300, Retsch GmbH, Hahn) für 10 min bei 30 Hz und 4 °C aufgeschlossen. Die weitere DNA-Präparation erfolgte nach Angaben des Herstellers mit dem ZR Plant/Seed DNA Kit^TM (Zymo Research Corp., Orange, USA). Die DNA-Proben wurden bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C gelagert.

2.8.2 Plasmidpräparation

Plasmide für die Transformation von P. pastoris sowie für Sequenzierreaktionen wurden aus Übernachtkulturen der entsprechenden E. coli-Stämme unter Verwendung des Zyppy^TM Plasmid Miniprep Kits (Zymo Research Corp., Orange, USA) nach Herstellerangaben präpariert.

2.8.3 Reinigung von DNA aus PCR- und Restriktionsansätzen

Zur Reinigung von DNA aus PCR- und Restriktionsansätzen wurde das DNA Clean&Concentrator^TM-5 Kit (Zymo Research Corp., Orange, USA) verwendet. Die Durchführung erfolgte nach Herstellerangaben.

2.8.4 Reinigung von DNA aus Agarosegelen

Zur Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen wurden die entsprechenden Banden nach Anfärben mit Ethidiumbromid unter UV-Licht ausgeschnitten und anschließend nach Herstellerangaben mit dem Perfectprep^® Gel Cleanup Kit (Eppendorf AG, Hamburg) gereinigt.

2.8.5 DNA-Konzentrationsbestimmung

Die Bestimmung der Konzentration und Reinheit von DNA-Proben erfolgte photometrisch bei 260 und 280 nm in einem BioPhotometer (Eppendorf, Hamburg). Die Reinheit ergab sich aus dem Quotienten OD_260/280.

2.8.6 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

2.8.6.1 Standard-PCR

Zur Amplifikation bekannter DNA-Abschnitte für eine anschließende Sequenzierung oder Klonierung wurde nachfolgendes Standard-Protokoll nach Saiki et al. (1985) und Sambrook und Russell (2001) verwendet.

Tabelle 2-12: Zusammensetzung eines Standard-PCR-Ansatzes

Komponente Endkonzentration

10x Taq-Puffer (100mM (NH4)2SO4) 1x

MgCl2 2,50 mM

dNTPs 0,20 mM

5'-Primer 0,50 µM

3'-Primer 0,50 µM

Taq-DNA-Polymerase (Fermentas) 0,05 u/µl

H2O Millipore^® variabel

Template (0,1-1µg) variabel

Fragmente, die anschließend zur Klonierung eingesetzt werden sollten, wurden entsprechend dem Ansatz für eine Reaktion mit Taq-DNA-Polymerase (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot) mit dem High Fidelity PCR Enzyme Mix (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot) amplifiziert.

Tabelle 2-13: Standard-PCR-Programm

Schritt Temperatur Dauer [min]

1. Denaturierung 95 °C 3:00

2. Denaturierung 95 °C 0:30

3. Annealing 45-65 °C 0:30

4. Elongation 72 °C 0:30- 4:00

5. Wiederholung der Schritte 2-4 (34x)

6. Endelongation 72 °C 3:00

7. Kühlung 8 °C

Die Annealing-Temperatur wurde der Hybridisierungstemperatur der verwendeten Primer, die Elongationszeit an die Größe der zu amplifizierenden Fragmente (30 sec/0,5 kb) angepasst.

Alle Reaktionen wurden in einem Mastercycler gradient oder Mastercycler personal (Eppendorf AG, Hamburg) durchgeführt. Eine Übersicht über alle verwendeten Primer findet sich in den Tabellen 2-14 bis 2-16.

Tabelle 2-14: Primer zur Identifizierung und Sequenzierung von RTP1-Homologen

Name Sequenz 5’-3’ Verwendung ^*

PtPrimer0fwd ATA ACA TCC AGG TAA GTC TCC Sequenzierung Pt-RTP1 PtPrimer0,5fwd GAT TAG AAC TGA CCA CTG AGC Sequenzierung Pt-RTP1 PtPrimer1fwd GTA CAA CTG GGC TGA GTT AG Sequenzierung Pt-RTP1 PtPrimer1rev CTT TGT AGA CTA ATG ATG ACC TG Sequenzierung Pt-RTP1 PtPrimer2rev CTA ACT CAG CCC AGT TGT AC Sequenzierung Pt-RTP1 PtPrimer3rev TTT GGA GAC TTA CCT GGA TG Sequenzierung Pt-RTP1

PtRTP1-3 CTA CTT AGA CAT CTC GAT G Sequenzierung Pt-RTP1

PtRTP1-5 ATG CTG GCC TCT ATC ACA C Sequenzierung Pt-RTP1

PcPrimer1fwd CGC AAC TTT ACA ACT CAA C Sequenzierung Pc-RTP1 PcPrimer2fwd CTC ACC AGG TAC TTT TGT CAC Sequenzierung Pc-RTP1 PcPrimer3fwd TTT GTC ACT TTC TGA TTC CC Sequenzierung Pc-RTP1

PcPrimer0rev ACC CAT GTT CCT GCG AG Sequenzierung Pc-RTP1

PcPrimer0,5rev CTG CGA GGA GAT TGT TGT C Sequenzierung Pc-RTP1

PcPrimer1rev GTG ACA AAA GTA CCT GGT GAG Sequenzierung Pc-RTP1 HvRTP1pot-5 CGG GTG CCA ATA ATG TAA AAG Sequenzierung Hv-RTP1

HvPrimer1rev GGA TCA GCC GGA GTT AAA T Sequenzierung Hv-RTP1

HvPrimer0rev GTA CCA GGA TTA CAT TTC AAG C Sequenzierung Hv-RTP1 HvPrimer0.5rev TGA GGA GAT TGA AAT GTA CCT AA Sequenzierung Hv-RTP1 HvPrimerrev0-2 TGG AGA ATT GAT TTC CTG C Sequenzierung Hv-RTP1 HvPrimerfwd0-2 AAT CCT GAC TAT CAT GGC AA Sequenzierung Hv-RTP1 HvPrimerfwd05-2 AAG CGA TTA TAT TCT TAT ATT T Sequenzierung Hv-RTP1 HvPrimerrev05-2 AGC CGC TTTGAA CAA TAT CAT T Sequenzierung Hv-RTP1 HvRTP1seqrev1 AAT TAA CGA TCA CCC AAA AAT Sequenzierung Hv-RTP1

HvRTP1P1-5' CCT TAG CCC GAT CAT GGT Sequenzierung Hv-RTP1

GsPrimer1fwd GTG GTT AAG GCT CAG GTA GC Sequenzierung Gs-RTP1 GsPrimer05fwd CAA GTG AGT CAT CCG CAT TA Sequenzierung Gs-RTP1 GsPrimer0fwd ATG TTA TCA GGA AGC TAA TCA T Sequenzierung Gs-RTP1

GsPrimer1rev CGT GGC TGA GTT CCG TGT G Sequenzierung Gs-RTP1

GsPrimer05rev TCC ATA GGT CAC ATA TAC AAA TG Sequenzierung Gs-RTP1 GsPrimer0rev GAG AAT CCT GAA GGG ACA CTT Sequenzierung Gs-RTP1 GsPrimerfwd05-2 ATG TAT GCA CCT TTG CCT Sequenzierung Gs-RTP1 GsPrimerrev05-2 TAG CAG TTC TGG CAC TTT GAT Sequenzierung Gs-RTP1 GsPrimerrev0-2 AGC ATC TTC CTT CAA TCC GAG Sequenzierung Gs-RTP1 GsPrimerfwd0-2 ACC ATT ATC TGA GTT ACC ATT TCA Sequenzierung Gs-RTP1

GsRTP1-5' ATG CTA TCC CGA AAG GTT Sequenzierung Gs-RTP1

GsRTP1-3' TCA ATC CTT GGA AGA TTT CT Sequenzierung Gs-RTP1

PgtRTP4-3'-1 TCA AGG CTT AGG AGC GGC Sequenzierung Pgt-RTP4

PgtRTP4-3'-2 CCT GGC TTT TCC GAA TTT C Sequenzierung Pgt-RTP4

PgtRTP2-5' ATG TTC TTG ACT CAT CTC GCC Sequenzierung Pgt-RTP2

PgtRTP2-3'-2 TGC TGG CTT CCC TGG CTG Sequenzierung Pgt-RTP2

PgtRTP2-3'-1 CGA ATT TGC CGA CTT GTC Sequenzierung Pgt-RTP2

PgtRTP3-5' ATG TTT TTG CGT ACG GTT Sequenzierung Pgt-RTP3

PgtRTP3-3'-2 TTC TGG CTT GTC CGG CT Sequenzierung Pgt-RTP3

PgtRTP3-3'-1 TCA AGG CTT AGC AGC AGG GT Sequenzierung Pgt-RTP3 PpRTP1Primer-0-rev TCA GCA CAC TCT CGC CCT C Sequenzierung Pp-RTP1 PpRTP1Primer-05rev GAT TTA TTC CCT TGC CAA C Sequenzierung Pp-RTP1 PpRTP1Primer-0fwd AGA TGA GGA GCA GTC GAT TGG Sequenzierung Pp-RTP1 PpRTP1Primer-05fwd TCA AAG GTA TGC TGG CAC A Sequenzierung Pp-RTP1

Ua-0.5rev TGT CAG TGA AGG CGA TGA G Sequenzierung Ua-RTP1

UaPrimer0,5rev TGA GAA TCT AAT GCT CGA CAA TAG Sequenzierung Ua-RTP1

UaPrimer1rev GAT TCA TGG GCA GTC CTA AC Sequenzierung Ua-RTP1

UaPrimer0rev CCT CTT ACG GAG TTG ATG TGC Sequenzierung Ua-RTP1

UaPrimer1fwd GAT CAC AGT ATG GGC GGA AC Sequenzierung Ua-RTP1

UsPrimer1fwd ATG TTA TTC AAC CCG AAT CTC C Sequenzierung Ua-RTP1 UfPrimer1fwd CCT CTC ATT ATG TCA AAC CTT C Sequenzierung Ua-RTP1 UfPrimer1rev GTT CTC ATT CGG GTA TGA TGA Sequenzierung Ua-RTP1 UsPrimer1rev GCC ATT CTC ATT CAG GTA TGA TG Sequenzierung Ua-RTP1

M13univ GTA AAA CGA CGG CCA GT Vektorprimer

M13rev GGA AAC AGC TAT GAC CAT G Vektorprimer

Uneven1 GTG ACG TAG G Random Decamer Primer

Uneven2 AGT CAG CCA C Random Decamer Primer

Uneven3 CAA ACG TCG G Random Decamer Primer

Uneven4 AAT CGG GCT G Random Decamer Primer

Uneven5 AGG TGA CCG T Random Decamer Primer

Uneven6 GTG ATC GCA G Random Decamer Primer

Uneven7 GAA ACG GGT G Random Decamer Primer

Uneven8 CAA TCG CCG T Random Decamer Primer

Uneven9 GAC CGC TTG T Random Decamer Primer

Uneven10 TCG GCG ATA G Random Decamer Primer

SFP1 CAC GAC ACG CTA CTC AAC AC SiteFinder-PCR-Primer

SFP2 ACT CAA CAC ACC ACC TCG CAC AGC SiteFinder-PCR-Primer

SiteFinder-1 CAC GAC ACG CTA CTC AAC ACA CCA CCT CGC ACA GCG TCC TCA AGC GGC CGC NNN NNN GCC T

SiteFinder-PCR-Primer

SiteFinder-2 CAC GAC ACG CTA CTC AAC ACA CCA CCT CGC ACA GCG TCC TCA AGC GGC CGC NNN NNN GCG C

SiteFinder-PCR-Primer

* Die ersten Buchstaben der Homolog-Bezeichung beziehen sich jeweils auf die entsprechende Spezies.

Tabelle 2-15: Primer zur Klonierung und Sequenzierung von RTP1 und mutierten Sequenzen

Name Sequenz 5’-3’ Verwendung^*

PIG7-full5 CGT AGA ATT CCA TTA TGT CAA ACC TTC GCT TAC

Klonierung Uf-RTP1 Pig7-f-his3’ GCC GCC CTA GGT CAG TGG TGG TGG TGG

TGG

Klonierung Uf-RTP1 RTP1-BamHI-3' TCT GGG ATC CTC ATT CGG GTA TGA TGA Klonierung Uf-RTP1 RTP1-BamHI-5' TAT CGG ATC CAT GTC AAA CCT TCG C Klonierung Uf-RTP1 UfRTP1ClaI5' GCC TAT CGA TAT GTC AAA CCT TCG C Klonierung Uf-RTP1 UfRTP1XbaI-3' TAG TTC TAG ATC ATT CGG GTA TG Klonierung Uf-RTP1

PIG7-2 AAG TGC GAC CAA GGT AAG Sequenzierung Uf-RTP1

PIG7-1-3' GTT GAG TTG TAG AGT TGC G Sequenzierung Uf-RTP1

PIG7-3-5' CCT TCT AAT CAC ACT TCC GCA Sequenzierung Uf-RTP1

UsRTP1BamHI-5' TGT AGG ATC CAT GTT ATT CAA CCC GA Klonierung Us-RTP1 UsRTP1BamHI3' GCT CGG ATC CTC ATT CAG GTA TGA TG Klonierung Us-RTP1 UsRTP1ClaI5' GAT CAT CGA TAT GTT ATT CAA CCC Klonierung Us-RTP1 UsRTP1-BamHI3'-2 CGT GGG ATC CTC ATT CAG GTA TGA TGA

AAT CC

Klonierung Us-RTP1 UaRTP1BamHI-3' GCT CGG ATC CTC ACT CAG GTA TG Klonierung Ua-RTP1 UaRTP1ClaI-5' GCT AAT CGA TAT GTT ATT CAA CCC G Klonierung Ua-RTP1

* Die ersten Buchstaben der Homolog-Bezeichung beziehen sich jeweils auf die entsprechende Spezies.

Tabelle 2-16: Primer zur Einführung von Mutationen in Uf-RTP1

Name Sequenz 5’-3’ Verwendung

RTP1-C44S-fwd GTG TCA GCT ATT CTC GGG AGA TG Mutation C44 S RTP1-C44S-rev CAT CTC CCG AGA ATA GCT GAC AC Mutation C44 S

C104Sfwd GCT TAA TAC TGC TTC CTA CCC CGG Mutation C104 S

C104Srev CCG GGG TAG GAA GCA GTA TTA AGC Mutation C104 S

RTP1-C117S-fwd GCT AGA GGA CTC TGA AGT GGT CA Mutation C117 S RTP1-C117S-rev TGA CCA CTT CAG AGT CCT CTA GC Mutation C117 S C147Sfwd ACC TCC GCT ACT GTT TTC CAA AAT C Mutation C147 S C147Srev GAT TTT GGA AAA CAG TAG CGG AGG T Mutation C147 S RTP1-C179Sfwd GTC GCT CTC TGT TAC CTG AAG AT Mutation C179 S RTP1-C179Srev ATC TTC AGG TAA CAG AGA GCG AC Mutation C179 S RTP1-V134A-rev TCA CCT GGA GAA GCT TGA AGA CTA Mutation V134 A RTP1-V134A-fwd TAG TCT TCA AGC TTC TCC AGG TGA Mutation V134 A RTP1-V142A-fwd GTT TTC GCG TCT TAT GGA ACC TGC Mutation V142 A RTP1-V142A-rev GCA GGT TCC ATA AGA CGC GAA AAC Mutation V142 A RTP1-V150A-fwd GCT ACT GCT TTC CAA AAT CCT CA Mutation V150 A

RTP1-V150A-rev TGA GGA TTT TGG AAA GCA GTA GC Mutation V150 A RTP1-V142Pfwd CTA CGT TTT CCC GTC TTA TGG A Mutation V142 P RTP1-V142Prev TCC ATA AGA CGG GAA AAC GTA G Mutation V142 P RTP1-F141A-fwd GTG ACT ACG TTG CCG TGT CTT ATG G Mutation F141 A RTP1-F141A-rev TAC TGG TAC CAC GCA GGT ATC GTC TAG Mutation F141 A RTP1-F151A-fwd CGC TAC TGT TGC CCA AAA TCC TC Mutation F151 A RTP1-F151A-rev GAG GAT TTT GGG CAA CAG TAG CG Mutation F151 A

Y126Ffwd GCA ACT CTT CAA CTC AAC G Mutation Y126 F

Y126Frev CGT TGA GTT GAA GAG TTG C Mutation Y126 F

T129Frev GAA GAC TAC CGA ATG AGT TG Mutation T129 F

T129Ffwd CAA CTC ATT CGG TAG TCT TC Mutation T129 F

2.8.6.2 Kolonie-PCR

Zur Identifikation positiver E. coli- oder P. pastoris-Transformanten wurde eine Kolonie-PCR nach Sambrook und Russel (2001) durchgeführt. Dabei wurde in Standard-PCR-Ansätzen das Template-Volumen durch H₂O ersetzt und anschließend eine kleine Menge der zu untersuchenden Zellkolonien mithilfe eines Zahnstochers in den Ansatz übertragen. Ansätze für P. pastoris-Transformanten enthielten zusätzlich 1 % Tween20. Die PCR wurde nach Standard-Programm (Tabelle 2-13) durchgeführt.

2.8.6.3 Mutagenese-PCR

Die gezielte Mutation einzelner Basen im Uf-RTP1-Gen erfolgte in zwei PCR-Schritten, wobei zunächst zwei komplementäre, mutierte Oligonukleotide jeweils mit einem am Ende des Gens liegenden spezifischen 5'- oder 3'-Primer kombiniert wurden. Die beiden die Mutation tragenden PCR-Produkte wurden anschließend gemischt und eine Ligations-PCR mit den beiden genspezifischen Primern durchgeführt. Die mutierten DNA-Fragmente wurden für die weitere Klonierung verwendet. Die PCR erfolgte in Standard-Ansätzen mit dem High Fidelity PCR Enzyme Mix (Fermentas GmbH, St. Leon-Roth) unter untenstehendem modifizierten Programm (siehe Tabelle 2-17).

Tabelle 2-17: Programm für die Mutagenese-PCR

Schritt Temperatur Dauer [min]

1. Denaturierung 95 °C 3:00

2. Denaturierung 95 °C 0:30

3. Annealing 45-55 °C 0:30

4. Elongation 72 °C 1:00

5. Wiederholung der Schritte 2-4 (10x)

6. Denaturierung 95 °C 0:30

7. Annealing 60 °C 0:30

8. Elongation 72 °C 1:00

9. Wiederholung der Schritte 6-8 (20x)

10. Endelongation 72 °C 5:00

11. Kühlung 8 °C

2.8.6.4 Uneven-PCR

Um ausgehend von einem kurzen bekannten Sequenzabschnitt verlängerte Sequenzinformationen zu erhalten, wurde eine Uneven-PCR nach Chen und Wu (1997) durchgeführt und die PCR-Produkte anschließend kloniert und sequenziert. Die PCR erfolgte nach dem Prinzip einer Nested-PCR in zwei Schritten mit einem äußeren und einem inneren Primer auf dem bekannten Sequenzabschnitt. In der jeweiligen Gegenrichtung wurden Random Decamer Primer verwendet, die an die unbekannten Sequenzabschnitte binden sollten. Die Zusammensetzung der der PCR-Ansätze und die verwendeten Programme sind unter aufgeführt.

Tabelle 2-18: Zusammensetzung eines Uneven-PCR-Ansatzes

Komponente Endkonzentration

10x Taq-Puffer (100mM (NH4)2SO4) 1x

MgCl2 2,00 mM

dNTPs 0,20 mM

genspezifischer Primer 1 oder 2 0,25 µM

Random Decamer-Primer 1-10 0,05 µM

Taq-DNA-Polymerase (Fermentas) 0,05 u/µl

H2O Millipore^® variabel

Template (genom. DNA oder Ansatz 1.Lauf) variabel