Voruntersuchungen zur Aufklärung der molekularen Mechanismen, die für die wachstums-hemmende Wirkung von Vineatrol®30 bei Humantumorzelllinien verantwortlich sind, haben gezeigt, dass eine Behandlung mit Vineatrol®30 zu einem Zellzyklus-Arrest in der S-Phase bei HCT116-Zellen führt (Daten hier nicht gezeigt). Basierend auf diesen Ergebnissen wurden weitere Arbeiten sowohl mit Vineatrol®30 als auch mit Resveratrol und seinen Oligomeren in A-431- und SW480-Zellen durchgeführt. Dabei wurde festgestellt, dass Vineatrol®30, r-2-Viniferin und Hopeaphenol einen Zellzyklus-Arrest in der S-Phase sowohl bei A-431-Zellen als auch bei SW480-A-431-Zellen hervorruft. Darüber hinaus kommt es im Fall von Vineatrol®30 bei der Zelllinie SW480 nach 48 h nur zu einer gering ausgeprägten Anhäufung von Zellen in der S-Phase. trans-Resveratrol hingegen hatte bei dieser Zelllinie nach 24 h eine signifikant stärkere Wirkung bezüglich des S-Phase-Arrests. Nach 48 h konnte eine Behandlung mit trans-Resveratrol den Anteil an Sub-G1-Zellen erhöhen. Die Resveratrol-Tetramere r-2-Viniferin und Hopeaphenol führten, ähnlich wie Vineatrol®30, erst nach 48 h zu einer signifikanten Erhöhung des Anteils der Zellen in der S- und G2-Phase. Bei den A-431-Zellen konnte Vineatrol®30 eine ähnliche Wirkung auf den Zellzyklus wie trans-Resveratrol hervorrufen. Diese Wirkung war nach 24 h erkennbar und deutlich stärker als bei SW480-Zellen. Nach 48 h wurde eine Anhäufung der Zellen in der S-Phase nur bei den mit Vineatrol®30-behandelten Zellen ersichtlich. Das Tetramer r-2-Viniferin führte nach 24 h zu
Ergebnisse 52
einer signifikanten Erhöhung der Zellzahl in der S- und der G2-Phase. Hopeaphenol hingegen konnte bei dieser Zelllinie eine Anhäufung der Zellzahl in der S-Phase erst nach 48 h hervorrufen. Die Abb. 20 zeigt das Zellzyklusphasen-Histogramm von SW480-Zellen 24 h nach der Behandlung mit Vineatrol®30 und den darin enthaltenen Oligomeren.
Abb. 20. Zellzyklusphasen-Histogramm von SW480-Zellen 24 h nach Behandlung der Zellen mit Vineatrol®30, Resveratrol, r-2-Viniferin oder Hopeaphenol.
Die Abb. 21 und Abb. 22 zeigen die Verteilung von SW480-Zellen in den einzelnen Zellzyklusphasen 24 bzw. 48 h nach der Behandlung mit Vineatrol®30 und den darin enthaltenen Oligomeren.
Ergebnisse 53
Abb. 21. Verteilung der SW480-Zellen auf die einzelnen Zellzyklusphasen 24 h nach einer
Behandlung mit Vineatrol®30, Resveratrol, r2-Viniferin oder Hopeaphenol. Die Ergebnisse zeigen den Mittelwert aus vier unabhängigen Versuchen.
SW 480 48 h
Abb. 22. Verteilung der SW480-Zellen auf die einzelnen Zellzyklusphasen 48 h nach einer Behand-lung mit Vineatrol®30, Resveratrol, r-2-Viniferin oder Hopeaphenol. Die Ergebnisse zeigen den Mittelwert aus vier unabhängigen Versuchen
Die Abb. 23 zeigt das Histogramm von A-431-Zellen in den einzelnen Zellzyklusphasen 24 h nach Behandlung mit Vineatrol®30 und den darin enthaltenen Oligomeren. Die Abb. 24 und Abb. 25 zeigen die Verteilung von A-431-Zellen in den einzelnen Zellzyklusphasen 24 bzw.
48 h nach der Behandlung mit Vineatrol®30 und den darin enthaltenen Oligomeren.
Ergebnisse 54
Abb. 23. Zellzyklusphasen-Histogramm von A-431-Zellen 24 h nach Behandlung der Zellen mit Vineatrol®30, Resveratrol, r-2-Viniferin oder Hopeaphenol.
Ergebnisse 55
Abb. 24. Verteilung der A-431 Zellen auf die einzelnen Zellzyklusphasen 24 h nach einer
Behandlung mit Vineatrol®30, Resveratrol, r2-Viniferin oder Hopeaphenol. Die Ergebnisse zeigen den Mittelwert aus vier unabhängigen Versuchen.
A-431 48 h
Abb. 25. Verteilung der A-431-Zellen auf die einzelnen Zellzyklusphasen 48 h nach einer Behandlung mit Vineatrol®30, Resveratrol, r-2-Viniferin oder Hopeaphenol. Die Ergebnisse zeigen den Mittelwert aus vier unabhängigen Versuchen
Diskussion 56
5 Diskussion
Krebs ist eine der häufigsten Todesursachen weltweit. Untersuchungen zufolge könnte eine obst- und gemüsereiche Diät das Krebsrisiko deutlich vermindern (BLOCK et al. 1992;
STEINMETZ u. POTTER 1996; VAINIO u. WEIDERPASS 2006). Zusätzlich wird auch einem moderaten aber regelmäßigen Konsum von Rotwein ein krebspräventiver Effekt zugeschrieben (GRONBAEK et al. 2000; PEDERSEN et al. 2003; GUERRERO et al. 2009).
Da Ethanol an sich eine kokanzerogene Wirkung gezeigt hat (SEITZ u. SIMANOWSKI 1986; GARRO u. LIEBER 1990), liegt die Vermutung nahe, dass die positive Wirkung von Wein nicht dem Ethanol sondern anderen Komponenten im Wein zuzuschreiben ist. Da vor allem für Rotwein eine krebspräventive Wirkung beschrieben worden ist, lässt sich diese Wirkung auf die im Rotwein in größerer Menge enthaltenen Polyphpehole zurückführen.
Neben de mehrfach bezüglich seiner krebspräventiven Wirkung untersuchten Resveratrol, sind im Wein weiterhin Resveratrol-Oligomere und -Polymere enthalten, deren Wirkung noch wenig erforscht ist. Der aus Weinrebensprösslingen gewonnene Extrakt Vineatrol®30 enthält neben dem Monomer trans-Resveratrol die zuletzt erwähnten Substanzen in größerer Anzahl.
In der vorliegenden Arbeit wurde die mögliche antiproliferative Wirkung von Vineatrol®30 sowie von mehreren darin enthaltenen Resveratrol-Oligomeren mit der Wirkung trans-Resveratrol verglichen.
5.1 Die Wachstumshemmende Wirkung von Vineatrol®30, Resveratrol und ausgewählten Resveratrol- Oligomeren
Mehrere Studien haben gezeigt, dass trans-Resveratrol das Wachstum von Tumorzelllinien hemmt. In der Zwischenzeit ist festgestellt worden, dass Resveratrol-Oligomere eine ähnliche antiproliferative Wirkung wie Resveratrol besitzen (BILLARD et al. 2002; NOTAS et al.
2006; COLIN et al. 2008; MAREL et al. 2008). In einem ersten Schritt wurde nachgewiesen, dass Vineatrol®30 das Wachstum einer großen Anzahl von humanen Tumorzelllinien hemmt.
Dabei war die wachstumshemmende Wirkung des Extraktes je nach Zelllinie unterschiedlich ausgeprägt. Ein Zusammenhang zwischen dem Ursprungsorgan der Zelllinie und der Sensitivität konnte dagegen nicht festgestellt werden. Während Vineatrol®30 bei den aus der Prostata stammenden PC-3-Zellen einen schwach ausgeprägten wachstumshemmenden Effekt
Diskussion 57
aufwies, zeigte der Extrakt auf LNCaP Zellen, die ebenfalls aus der Prostata stammen, einen sehr starken wachstumshemmenden Effekt. Aus der wissenschaftlichen Literatur ist bekannt, dass Resveratrol das Wachstum von PC-3- und LNCaP-Zellen hemmen, wobei dieser Effekt in PC-3-Zellen deutlich weniger ausgeprägt war (HSIEH u. WU 1999; BENITEZ et al. 2007;
DJAVAN et al. 2007; HORVATH et al. 2007). Des Weiteren wurde auch nachgewiesen, dass trans-Reveratrol die Apoptose in PC-3- und LNCaP-Zellen auslösen kann. Allerdings waren bei den PC-3 Zellen weit höhere Resveratrol-Konzentrationen nötig, um die Apoptose auszulösen (HSIEH u. WU 1999; BENITEZ et al. 2007). In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Vineatrol®30 nur zu einem schwachen apoptotischen Effekt in PC-3-Zellen führt. Das im Rahmen dieser Studie untersuchte trans-Resveratrol führte bei den LNCaP-Zellen zu einer starken Wachstumsinhibition. Der IC50-Wert von trans-Resveratrol lag bei dieser Zelllinie im Vergleich zu den anderen Zelllinien unter 10 µM. An dieser Stelle muss darauf hingewiesen werden, dass die höchste eingesetzte Vineatrol®30-Konzentration (23 µg/ml) in etwa einer Konzentration von 20 µM Resveratrol entsprach.
In der vorliegenden Arbeit wurden auch mehrere Dickdarmtumorzelllinien untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass diese Zelllinien unterschiedlich empfindlich auf den Extrakt reagieren. Während Vineatrol®30 das Wachstum der Tumorzelllinie HT-29 um ca. 50 % hemmt, konnte bei der Zelllinie HCT116 nur eine geringe Wachstumsinhibierung festgestellt werden. In der Vergangenheit haben eine Reihe von Studien mit SW480-, HCT116-, HT-29-und Caco-2-Zellen gezeigt, dass trans-Reveratrol (meistens in einer Konzentration >10 µM) einen konzentrationsabhängigen zytostatischen bzw. zytotoxischen Effekt hervorruft (SCHNEIDER et al. 2000; MAHYAR-ROEMER et al. 2001; DELMAS et al. 2002; LEE et al. 2004; CHRISTOPHER HOPE 2008). Auch in der vorliegenden Arbeit zeigte sich trans-Resveratrol als ein potentes antiproliferatives Agens mit einem durchschnittlichen IC50-Wert von 20 µM. Im Gegensatz zu trans-Reveratrol, wurden bis jetzt nur einzelne Studien zur antiproliferativen Wirkung von Vineatrol®30 auf Darmtumorzelllinien veröffentlicht (BILLARD et al. 2002; MAREL et al. 2008; COLIN et al. 2009).
In einer vorangegangenen Studie wurde gezeigt, dass das Ausmaß der wachstumshemmenden Wirkung von Vineatrol® auf SW480-Zellen dem Ausmaß der Wirkung der
Resveratrol-Diskussion 58
Konzentration im Extrakt entsprach (MAREL et al. 2008). Darüber hinaus untersuchten COLIN et al. (2008) die Wirkung von Vineatrol® auf HepG2-Zellen und konnten zeigen, dass bei dieser Zelllinie Vineatrol® einen deutlich stärker wachstumshemmenden Effekt aufwies als trans-Resveratrol selbst. In den zwei oben genannten Arbeiten wurde ein Extrakt verwendet, der 16 % trans-Reveratrol enthielt. In der vorliegenden Arbeit konnten diese Ergebnisse zum Teil bestätigt werden. So wies Vineatrol®30 hier im direkten Vergleich mit der äquivalenten trans-Resveratrol-Konzentration von 20 µM einen ähnlichen oder sogar stärker wachstumshemmenden Effekt auf. Eine Ausnahme stellten die HepG2-Zellen dar. In dieser Zelllinie löste Resveratrol eine stärkere Hemmung des Wachstums aus als Vineatrol®30. Dieser Effekt war nach 120 h deutlich sichtbar. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die wachstumsinhibierende Wirkung des Extrakts auf Resveratrol zurückzuführen ist. Allerdings könnte die zum Teil stärkere Wirkung von Vineatrol® damit erklärt werden, dass die im Extrakt enthaltenen Resveratrol-Oligomere auch antiproliferativ wirken. Ein Grund für die Diskrepanz zwischen den von COLIN et al. (2008) und MAREL et al. (2008) erhobenen Daten auf der einen Seite und den in dieser Studie erhobenen Daten auf der anderen Seite könnte die unterschiedliche Formulierung der Extrakte sein. In den zwei erstgenannten Arbeiten machte trans-Resveratrol 16 % des Extrakts aus; dagegen enthielt der in der vorliegenden Arbeit verwendeten Extrakt ca. 8 % Resveratrol. Wenn trans-Resveratrol tatsächlich die ausschlaggebende Substanz für die antikanzerogene Wirkung des Extraktes ist, könnte die geringere Wirkung des Extraktes im Vergleich zu trans-Resveratrol hiermit erklärt werden. Allerdings konnte bei einzelnen Zelllinien gezeigt werden, dass trotz der Unterschiede in den Formulierungen der Extrakt teilweise eine höhere wachstums-hemmende Wirkung als Resveratrol selbst aufweist.
In beiden oben genannten Studien wurde auch die Wirkung des Resveratrol-Dimers ε-Viniferin untersucht. COLIN et al. (2008) berichteten, dass ε-Viniferin in Konzentrationen
< 30 µM keine signifikante Hemmung des Wachstums von Humantumorzelllinien hervorruft.
Ab einer Konzentration von 60 µM dagegen, konnte ε-Viniferin eine starke Hemmung des Wachstums auslösen. Ähnliche Ergebnisse erzielten auch MAREL et al. (2008). In der vorliegenden Arbeit konnte ebenso gezeigt werden, dass ε-Viniferin ab einer Konzentration von 60 µM eine starke wachstumsinhibierenden Wirkung bei allen untersuchten Zelllinien
Diskussion 59
entfaltet. Konzentrationen unter 20 µM konnten, im Gegensatz zu Resveratrol, keine Wachstumshemmung hervorrufen. Der IC50-Wert für ε-Viniferin lag bei ca. 50 µM und der von Resveratrol bei ca. 20 µM. Diese Ergebnisse zeigen, dass Resveratrol im Vergleich zu ε-Viniferin eine stärkere wachstumshemmende Wirkung aufweist. Die oben genannten Studien zeigen, dass die Wirkung beider Substanzen in einer äquivalenten Konzentration schwächer war als die von Vineatrol®. Diese Ergebnisse führen zu der Annahme, dass eine synergistische Wirkung beider Substanzen bestehen könnte. Dabei ist zu berücksichtigen, dass im Fall der zwei erwähnten Studien ein Extrakt verwendet wurde, der 16 % trans-Resveratrol und 20 % ε-Viniferin enthielt. Hingeben enthielt der in dieser Arbeit verwendete Extrakt nur knapp 8 % Resveratrol und 15 % ε-Viniferin. Der niedrigere Anteil der zwei Polyphenole im Extrakt könnte der Grund für die schwächere antiproliferative Wirkung sein.
In der vorliegenden Arbeit sollten neben den bereits erwähnten Einzelsubstanzen weitere im Vineatrol®30 enthaltene Resveratrol-Oligomere untersucht werden. Zwar machen trans-Resveratrol und ε-Viniferin den größten Anteil der Polyphenole im Extrakt aus. Dennoch sind zahlreiche, zum Teil noch nicht identifizierte Substanzen in Vineatrol® enthalten. So wurden hier neben einem weiteren Monomer, trans-Piceatannol, und einem weiteren Dimer, Ampelopsin A, zwei Tetramere, r-2-Viniferin und Hopeaphenol, untersucht. Im Gegensatz zu trans-Resveratrol und ε-Viniferin wurden diese Substanzen bezüglich ihrer antikanzerogenen Wirkung bisher kaum untersucht. Im Fall des Piceatannols konnte in verschiedenen Studien eine antiproliferative Wirkung bei verschiedenen Tumorzelllinien nachgewiesen werden (WOLTER et al. 2002; LARROSA et al. 2004; KUO u. HSU 2008). Dagegen zeigte Piceatannol in der vorliegenden Arbeit einen nur geringen antiproliferativen Effekt auf alle untersuchten Zelllinien und konnte seine schwache Wirkung erst ab einer hohen Konzentration (100 µM) entfalten. Eine mögliche Erklärung für diese differierenden Ergebnisse besteht in der Verwendung unterschiedlicher Lösungsmittel. Während DMSO bevorzugt verwendet wird, um Substanzen in Zellkulturmedien einzubringen, wurde im vorliegenden Fall Ethanol verwendet. Der Grund dafür war die geringe Löslichkeit einiger Substanzen in DMSO. Um nun die Effekte der einzelnen, in dieser Arbeit untersuchten Substanzen vergleichen zu können, wurden alle Substanzen in Ethanol gelöst. Dieses Lösungsmittel stellte dasjenige Mittel dar, in dem sich alle Substanzen gut lösen ließen. Da in Ethanol gelöste Substanzen ein anderes Aufnahmeverhalten in die Zelle haben könnte als in
Diskussion 60
DMSO gelöste, könnte es sein, dass Piceatannol aus diesem Grund nicht seine maximale Wirkung ausüben konnte.
Im Fall des Dimers Ampelopsin A konnten HA et al. (2009) zeigen, dass Ampelopsin A in verschiedenen Tumorzelllinien zytotoxisch wirkt und der IC50-Wert bei durchschnittlich 30 µM liegt. Eine ähnliche Wirkung konnte auch in dieser Arbeit nachgewiesen werden.
Dabei lag hier der durchschnittliche IC50-Wert bei ca. 60 µM. Allerdings muss berücksichtigt werden, dass die hier eingesetzte Substanz einen Reinheitsgrad von 92 % besaß und eventuelle Verunreinigungen einen Einfluss auf die erzielten Ergebnisse haben könnten.
Neben Ampelopsin A untersuchten HA et al (2009) auch Piceatannol und das Tetramer r-2-Viniferin. Während Ampelopsin A eine erhebliche zytotoxische Wirkung aufwies, konnten Piceatannol und r-2-Viniferin keine ähnliche zytotoxische Wirkung hervorrufen.
Während die im Rahmen der vorliegenden Studie erzielten Ergebnisse mit denen von HA et al. (2009) übereinstimmen, konnten die in der vorliegenden Arbeit mit r-2-Viniferin durchgeführten Untersuchungen die Ergebnisse von HA et al. (2009) nicht bestätigen.
r-2-Viniferin zeigte in der vorliegenden Arbeit eine sehr starke antiproliferative Wirkung in allen untersuchten Zelllinien. Mit einem IC50-Wert zwischen 1 und 4 µM war r-2-Viniferin, neben Hopeaphenol, das bezüglich der wachstumshemmenden Wirkung potenteste Resveratrol-Oligomer. Im Gegensatz zu anderen Resveratrol-Derivaten wurde r-2-Viniferin hinsichtlich seiner antiproliferativen Wirkung bisher kaum untersucht. Die hier eingesetzte Substanz war in DMSO unlöslich und musste in Ethanol gelöst werden. Der Reinheitsgrad war mit 76,5 % recht niedrig. Aufgrund der schlechten Datenlage und der hier erstmalig gezeigten starken antiproliferativen Wirkung sollte in weiteren Untersuchungen überprüft werden, ob diese Wirkung tatsächlich dem r-2-Viniferin oder einer etwaigen Verunreinigung zuzuschreiben ist. Es wurde ein weiteres Tetramer, Hopeaphenol, untersucht. Dieses zeigte eine sehr starke antiproliferative Wirkung in allen Tumorzelllinien. Dabei lag der IC50-Wert im Fall des Hopeaphenols, ähnlich wie bei r-2-Viniferin, je nach Zelllinie zwischen 1 und 5 µM.
Zusammenfassend lassen die Ergebnisse dieser Arbeit die Annahme zu, dass die Resveratrol-Tetramere in der Lage sind, eine vielfach stärkere antiproliferative Wirkung zu entfalten als
Diskussion 61
das Monomer selbst. In diesem Zusammenhang muss erwähnt werden, dass das Resveratrol-Tetramer Vaticanol C in niedrigen Konzentrationen auch in der Lage ist, eine starke Wachstumshemmung der Zellen hervorzurufen (ITO et al. 2002; ITO et al. 2003). Insgesamt zeigen diese Untersuchungen, dass Resveratrol-Tetramere eine starke Wachstumshemmung in verschiedenen Tumorzellen hervorrufen und dass diese Wirkung im Vergleich zu den kleineren Resveratrol-Oligomere viel stärker ausgeprägt ist.
5.2 Molekulare Mechanismen der wachstumshemmenden Wirkung