Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchungen zur antikanzerogenen Wirkung des Weinrebenextraktes Vineatrol®30 und der darin enthaltenen
Resveratrol-Oligomeren
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Einav Nevo-Koch
Haifa, Israel
Hannover 2010
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Pablo Steinberg
Institut für Lebensmitteltoxikologie und Chemische Analytik
1. Gutachter: Prof. Dr. Pablo Steinberg 2. Gutachter: Prof. Dr. Manfred Kietzmann
Tag der mündlichen Prüfung: 24.11.2010
Gefördert durch das Bundesministerium für Bildung und Forschung, BMBF
dedicated to my father
Inhaltsverzeichnis V
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG... 1
1.1 Rotwein-Polyphenole... 1
1.1.1 Resveratrol ... 2
1.1.2 Vineatrol®30... 2
1.1.3 Resveratrol-Oligomeren... 3
1.2 Antikanzerogene Wirkung von Rotwein-Polyphenolen ... 4
1.2.1 P-Glycoprotein und Polyphenole ... 6
1.3 Zellzyklus ... 7
1.3.1 Regulation des Zellzyklus ... 8
1.3.2 Kontrollpunkte des Zellzyklus ... 9
1.4 Apoptose... 11
1.4.1 Extrinsische Signalweg der Apoptose... 12
1.4.2 Intrinsische Signalweg der Apoptose ... 13
1.4.3 Caspasen... 15
2 ZIEL DER ARBEIT... 17
3 MATERIAL UND METHODEN... 18
3.1 Testsubstanzen... 18
3.2 Zellkultur ... 19
3.2.1 Zelllinien ... 19
3.2.2 Allgemeine Zellkultur Bedingungen ... 19
3.2.3 Bestimmung der Zellzahl ... 20
3.2.4 Einfrieren von Zellen ... 21
3.2.5 Auftauen von Zellen... 21
3.3 Sulforhodamin B-Assay ... 20
3.4 Zytotoxizität Bestimmung mittels CytoTox-OneTM-Assay... 23
Inhaltsverzeichnis VI
3.5 Bestimmung der Apoptoserate mittels CaspaseGlo® 3/7-Assay ... 24
3.6 Zelluläre Aufnahme von Vineatrol®30 und die darin enthaltenen Resveratrol-Oligomeren ... 25
3.7 Western Blotting... 26
3.7.1 Zellenaufbereitung für den Western Blotting... 27
3.7.2 SDS-Gelelektrophorese... 27
3.7.3 Proteintransfer... 28
3.7.4 Inkubation mit Anti-P-Glycoprotein-Antikörpern ... 28
3.8 Durchflusszytometrie ... 30
3.8.1 Durchflusszytometrie in der Zellzyklusanalyse ... 30
3.8.2 Probenahme für die Durchflusszytometrie... 31
3.8.3 RNA-Verdau ... 32
3.9 Statistik... 32
4 ERGEBNISSE... 33
4.1 Wachstumshemmende Wirkung von Vineatrol®30... 33
4.2 Wachstumshemmende Wirkung von Resveratrol ... 34
4.3 Wachstumshemmende Wirkung von Resveratrol-Oligomeren... 36
4.3.1 trans-Piceatannol... 36
4.3.2 Ampelopsin A ... 38
4.3.3 ε-Viniferin ... 39
4.3.4 r-2-Viniferin ... 40
4.3.5 Hopeaphenol ... 42
4.3.6 Mittlere inhibitorische Konzentration ... 44
4.4 Zytotoxischer Effekt von Vineatrol®30... 44
4.5 Apoptotischer Effekt von Vineatrol®30 ... 46
4.6 Expression von P-Glycoprotein... 48
4.7 Zelluläre Aufnahme von Vineatrol®30 und dem darin enthaltenen Resveratrol und seinen Oligomeren... 48
4.8 Zellzyklusanalyse... 51
5 DISKUSSION ... 56
Inhaltsverzeichnis VII
5.1 Die Wachstumshemmende Wirkung von Vineatrol®30, Resveratrol und ausgewählten Resveratrol-
Oligomeren... 56
5.2 Molekulare Mechanismen der wachstumshemmenden Wirkung von Vineatrol®30... 61
5.2.1 Zellzyklus... 63
5.2.2 Zelluläre Aufnahme von Vineatrol®30, trans-Resveratrol und seine Oligomere ... 65
6 ZUSAMMENFASSUNG ... 68
7 SUMMARY... 70
8 LITERATUR ... 72
9 ANHANG... 86
9.1 Abbildungsverzeichnis ... 93
9.2 Tabellenverzeichnis ... 94
9.3 Anhangsabbildungsverzeichnis ... 94
9.4 Anhangstabellenverzeichnis ... 95
Abkürzungsverzeichnis VIII
Abkürzungsverzeichnis
°C Grad Celsius
µg Mikrogramm µL Microliter µM Mikromolar Abb. Abbildung
ATP Adenosintriphosphat BSA Bovine serumalbumin
DMEM Dubecco’s Modified Eagle Medium DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) et. al. et altii (und andere)
FACS Fluorescence aktivated cell sorting
g Erdschwerebeschluenigung
h Hour, Stunde(n)
HPLC high performance liquid chromatography (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) HSP Hitzeschockprotein
M molare Masse
mg Milligramm min. Minuten mL Milliliter mm Millimeter mM Millimolar
MRI Max Rubner-Institut
n Anzahl nm Nanometer nM Nanomolar p Probability (Signifikanz Niveau)
PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Abkürzungsverzeichnis IX
PBS Phosphate buffered saline (Phosphatgepufferte Salzlösung) pH Negativer dekadischer Logarithmus der
Wasserstoffionenkonzentration
rcf relative centrifugal force (relative Zentrifugalkraft)
RNAse Ribonuklease A
rpm revolutions per minute (Umdrehungen pro Minute)
RPMI Am Roswell Park Memorial Institut entwickeltes Zellkulturmedium SDS sodium dodecyl sulfate (Natrium Dodecylsulfat)
SRB Sulforhodamin B
Tab. Tabelle
TCA Trichloracetic acid (Trichloressigsäure)
Tris Tris-hydroxymethyl-aminomethan V Volt
v/v volume per volume
w/v Weight per volume
z.B. Zum Beispiel
Einleitung 1
1 Einleitung
1.1 Rotwein-Polyphenole
Die mediterrane Ernährung wird oft als Beispiel für eine gesunde Ernährung angeführt. Viele Studien konnten zeigen, dass eine derartige Diät die Gesundheit fördern und das Auftreten einer Vielzahl von Erkrankungen wie z. B. Herzkreislaufstörungen, Krebs, Morbus Alzheimer oder Morbus Parkinson verringern kann (SOFI et al. 2008). Die mediterrane Diät ist durch eine sehr hohe Aufnahme von Obst, Gemüse, Hülsenfrüchten und Nüssen, durch die Verwendung einer großen Menge an Olivenöl und durch eine relativ geringe Aufnahme gesättigter Fettsäuren charakterisiert. Darüber hinaus nehmen Menschen in den Mittelmeerregionen eine relativ hohe Menge an Fisch- und Milchprodukten sowie eine eher geringe Menge an Fleisch- und Fleischprodukten zu sich, welche von einem moderaten, aber regelmäßigen Alkoholkonsum, vor allem in Form von Wein während den Mahlzeiten, begleitet wird. (WILLETT et al. 1995; TRICHOPOULOU et al. 2003). Bei dieser Ernährungsweise kommt dem Wein eine wichtige Rolle zu, denn ihm ist ein Großteil der positiven gesundheitlichen Effekte zuzuschreiben. In diesem Zusammenhang veröffentlichten RENAUD u. DELORGERIL 1992 eine Studie, in der sie über das „Französische Paradoxon“
und die positiven Auswirkungen von Wein auf die Entstehung und den Verlauf von Herzkreislauf-Erkrankungen berichteten. Nachdem neuere Untersuchungen gezeigt haben, dass Wein eine stärker ausgeprägte gesundheitsfördernde Wirkung besitzt als andere alkoholische Getränke (ESTRUCH 2000; DI CASTELNUOVO et al. 2002), konzentrierten sich darauffolgende Studien vor allem auf die nicht-alkoholischen Komponenten im Wein. Es konnte gezeigt werden, dass den im Rotwein enthaltenen Polyphenolen eine große Bedeutung bei der positiven Beeinflussung von Herzkreislauf- und Krebserkrankungen zuzuschreiben ist (CLIFFORD et al. 1996; AL-AWWADI et al. 2004). Dabei wirkt Rotwein am stärksten protektiv bei der Entstehung von den o. g. Krankheiten. Der Grund hierfür liegt vermutlich am höheren Polyphenol-Gehalt im Rotwein im Vergleich zu anderen Weinarten. Dieser unterschiedliche Gehalt an Polyphenolen ist wiederum durch den Herstellungsprozess bedingt. Bei der Herstellung von Weißwein werden Fruchtschale und Kerne, welche im Vergleich zum Fruchtfleisch sehr reich an antioxidativ wirkenden Substanzen (Polyphenole)
Einleitung 2
sind, schon frühzeitig entfernt. Dadurch stehen sie im Fermentierungsprozess nicht mehr zur Verfügung. Im Unterschied dazu bleiben diese Pflanzen- bzw. Fruchtbestandteile und damit auch die Polyphenole während des Prozesses der Rotweinherstellung vollständig erhalten und können so in das Endprodukt Rotwein gelangen. Da sich Polyphenole gut in Alkohol lösen, ist deren Gehalt im Rotwein höher als in rotem Traubensaft.
1.1.1 Resveratrol
Der wichtigste und am meisten untersuchte Vertreter der Weinpolyphenole ist das Resveratrol (3,5,4’-trans-Trihydroxystilben). Dieses, zur Familie der Stilbene gehörende Polyphenol ist ein Phytoalexin, ein Bestandteil eines pflanzeneigenen Abwehrsystems. Resveratrol und andere Stilbene lassen sich in einer Reihe von Nahrungspflanzen und deren Früchte wie Erdnüssen, Pistazien und Maulbeeren nachweisen. In beachtlichen Mengen ist Resveratrol aber vor allem in Weintrauben zu finden. In hohen Konzentrationen findet man es hauptsächlich in der Traubenschale, geringere Konzentrationen sind aber auch im Traubenkern und Stiel sowie in den Wurzeln des Weinstocks zu finden. Die Hauptaufgabe von Resveratrol in der Pflanze ist deren Schutz vor Pilz-, Bakterien- und Virusinfektionen sowie vor schädlichen Umwelteinflüssen wie UV-Strahlung und Toxinen (LANGCAKE u.
PRYCE 1976). Hieraus erklärt sich der zum Teil sehr unterschiedliche Gehalt an Resveratrol in verschiedenen Rotweinsorten. Hohe Konzentrationen finden sich vor allem in solchen Reben, deren Abwehrsystem stark gefordert wird. Da das Phytoalexin hauptsächlich als Fungizid wirkt, enthalten Trauben, die wechselhaften Witterungsbedingungen mit starken Feuchtigkeitsperioden ausgesetzt sind, meistens viel davon. Seit seiner Entdeckung 1976 durch LANGCAKE und PRYCE wurde Resveratrol mehrfach eine präventive bzw. positive Wirkung gegenüber einer Vielzahl unterschiedlicher Erkrankungen zugeschrieben. Wie im Fall anderer Polyphenole zeigt es antikanzerogene Wirkungen (M. JANG et al. 1997), positive Effekte bei Herzkreislauferkrankungen (BRADAMANTE et al. 2004) und kann die Lebensdauer unterschiedlicher Organismen verlängern (VALENZANO et al. 2006).
1.1.2 Vineatrol®30
Die Firma BREKO GmbH hat zusammen mit der französischen Firma Actichem den Weinrebenextrakt Vineatrol®30 entwickelt und auf den Markt gebracht. Dieser Extrakt wurde aus den jungen Trieben der Weinrebe (Vitis vinifera) aus der Weinregion Bordeaux in
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Frankreich durch Wasser/Ethanol-Extraktion hergestellt. Vineatrol®30 enthält neben dem vielfach untersuchten Monomer trans-Resveratrol einen hohen Anteil an Resveratrol- Oligomeren und -Polymeren (Tab. 1). Zu den weiteren, in sehr unterschiedlichen Konzentrationen in dem Extrakt enthaltenen Resveratrol-Oligomeren, zählen z. B. das Monomer trans-Piceatannol, die Dimere ε -Viniferin und Ampelopsin A sowie die Tetramere r-2-Viniferin und Hopeaphenol.
Tab. 1. In Vineatrol®30 enthaltene Resveratrol-Oligomere und deren prozentualer Anteil im Extrakt.
Resveratrol-Monomere und -Oligomere Anteil in Vineatrol®30
ε-Viniferin 14,6 %
trans-Resveratrol 7,7 %
Ampelopsin A 3,4 %
Miyabenol C 2,5 %
r-Viniferin (Visitin B) 2,5 %
Iso-trans-ε-Viniferin 2,4 %
Hopeaphenol 1,8 %
r-2-Viniferin (Visitin A) 1,6 %
trans-Piceatannol 0,6 %
Gesamt Resveratrol-Monomere
und -Oligomere 37,1 %
1.1.3 Resveratrol-Oligomeren
Resveratrol-Oligomere (Abb. 1) weisen auch gesundheitsfördernde Wirkungen auf. So wirkt z. B. das Dimer ε-Viniferin, ähnlich wie Resveratrol, antioxidativ (PRIVAT et al. 2002), antiinflamatorisch (ZHANG et al. 2004), antikanzerogen (KIM et al. 2002; PIVER et al.
2003a) und neuroprotektiv (YANEZ et al. 2006; RIVIERE et al. 2007). Das Dimer Ampelopsin A übt nicht nur eine antikanzerogene Wirkung (LIU et al. 2003), sondern auch einen positiven Effekt auf das Immunsystem (ZENG et al. 2006) aus. Die Tetramere r- Viniferin und r-2-Viniferin wirken antioxidativ und somit positiv auf das Herz-Kreislauf- System (Y. L. HUANG et al. 2005). Darüber hinaus besitzen sie eine neuroprotektive
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Wirkung (M. H. JANG et al. 2007). Beim Tetramer Hopeaphenol wurden sowohl Antikanzerogene (SAHIDIN et al. 2005) als auch entzündungshemmende (K. S. HUANG et al. 2001) und antimikrobielle Wirkungen (ZGODA-POLS et al. 2002) beschrieben. Als letztes soll hier noch das Monomer Piceatannol erwähnt werden, dem ebenfalls zahlreiche gesundheitsfördernde Eigenschaften zugeschrieben werden. So wirkt es antikanzerogen (LARROSA et al. 2004), antioxidativ (OVESNA et al. 2006), entzündungshemmend (RICHARD et al. 2005), vasorelaxierend (Yoo et al. 2007) und neuroprotektiv (KIM et al.
2007).
Trans-Resveratrol Trans Piceatannol ε-Viniferin
r2-Viniferin Hopeaphenol Ampelopsin A
Abb. 1. Strukturformeln von Resveratrol und ausgewählten Resveratrol-Oligomeren, die in dieser Arbeit untersucht wurden.
1.2 Antikanzerogene Wirkung von Rotwein-Polyphenolen
Krebs ist eine der häufigsten Todesursachen sowohl bei Männern als auch bei Frauen und fordert jährlich über 7 Millionen Opfer weltweit. Allein im Jahr 2008 sind laut Weltgesundheitsorganisation (WHO) rund 12 Millionen Menschen an Krebs erkrankt und 7,6 Millionen an den Folgen einer Krebserkrankung gestorben (World Cancer Report 2008).
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Darmkrebs ist sowohl bei Frauen als auch bei Männern die zweithäufigste Krebserkrankung in Deutschland. Jeweils an erster Stelle steht bei den Frauen Brustkrebs (Mammarkarzinom) und bei den Männern das Prostatakarzinom. Zu den häufigsten bösartigen Krebsarten werden auch Hauttumore gezählt (HUSMANN et al. 2010). Die Häufigkeit der Krebsneuerkrankungen nimmt trotz Weiterentwicklung neuer und vielversprechender Antikrebs-Therapien kontinuierlich zu. Die Krebsentstehung ist ein komplexer Prozess, der verschiedene molekulare und zelluläre Veränderungen mit sich bringt. Diese zellulären Veränderungen können in allen Stadien der Tumorentstehung (Initiation, Promotion und Progression) auftreten und dadurch erst nach mehreren Jahren bösartige Tumore hervorrufen.
Chemoprävention, eine relativ neue und vielversprechende Strategie der Krebsprävention, bezeichnet den Einsatz von natürlichen oder synthetischen Substanzen, welche die Kanzerogenese verzögern oder blockieren sollen. Wie bereits erwähnt, kann eine obst- und gemüsereiche Diät das Krebsrisiko vermindern (BLOCK et al. 1992; STEINMETZ u.
POTTER 1996; VAINIO u. WEIDERPASS 2006). Vor allem die Polyphenole in solchen Lebensmitteln sind vermutlich für das verminderte Risiko, an Krebs zu erkranken, verantwortlich. In mehreren In-vitro-Studien sowie in verschiedenen Tiermodellen wurde gezeigt, dass diese Substanzen eine Schutzwirkung gegenüber kanzerogenen Substanzen oder Tumorzellen entfalten können (LAMBERT et al. 2005; THOMASSET et al. 2007;
KOUNTOURI et al. 2009). So kann Resveratrol in bestimmten Fällen die Initiationsphase u.
a. durch seine antioxidative Wirkung unterbinden (SAVOURET u. QUESNE 2002). Darüber hinaus ist nachgewiesen worden, dass Resveratrol auch zu einer Hemmung der Promotion und der Progression während der Tumorentstehung führen kann (SAVOURET u. QUESNE 2002). Die Promotionsphase kann durch Hemmung der Prostaglandin-Biosynthese sowie durch Hemmung der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB unterdrückt werden (HOLMES-MCNARY u. BALDWIN 2000). Außerdem ist festgestellt worden, dass Resveratrol mit dem Zellzyklusablauf interferieren kann. Dabei kann es nicht nur zu einem Zellzyklusstopp sondern auch zur Induktion der Apoptose kommen (AHMAD et al. 2001;
POZO-GUISADO et al. 2002; NOTAS et al. 2006; BENITEZ et al. 2007).
Anders als im Fall des Resveratrols ist die Anzahl der Veröffentlichungen, die sich mit der antikanzerogenen Wirkung von Resveratrol-Oligomeren auseinandersetzen, sehr begrenzt.
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COLIN et al. (2008, 2009) sowie MAREL et al. (2008) haben festgestellt, dass das Resveratrol-Dimer ε-Viniferin, das ebenfalls in Rotwein vorkommt, das Wachstum von Dickdarm- und Lebertumorzellen hemmt. Darüber hinaus ruft das Resveratrol-Tetramer Vaticanol C eine stärkere antiproliferative Wirkung auf verschiedene Darmtumorzelllinien als Resveratrol selbst hervor und diese Wirkung scheint auf eine Induktion der Apoptose zurückzuführen sein (ITO et al. 2002, 2003). Piceatannol, ein in Rotwein vorkommender Resveratrol-Metabolit, ist auch in der Lage, das Wachstum von verschiedenen Darm-, Haut- und Harnblasentumorzelllinien zu hemmen (WOLTER et al. 2002; KUO u. HSU 2008).
Dagegen ist die antiproliferative Wirkung der in Vineatrol®30 vorkommenden Resveratrol- Oligomere Ampelopsin A, Hopeaphenol und r-2-Viniferin bis jetzt kaum untersucht worden.
1.2.1 P-Glycoprotein und Polyphenole
P-Glycoprotein gehört zu der Klasse der ABC-Transporter (ATP-Binding-Cassette), eine Membranproteinfamilie mit Transporterfunktion. Die ABC-Transporter besitzen zwei hydrophobe Transmembrandomänen, die anderen beiden sind hydrophile Domänen, welche die ATP-Kassette enthalten. P-Glycoprotein ist in die Zellmembran eingelagert und für die Aufnahme von notwendigen Nährstoffen sowie die Abgabe von zellulären Stoffwechselprodukten und toxischer Substanzen aus der Zelle verantwortlich. Wenn die Substanzen durch die ABC-Transporter gegen ein Konzentrationsgefälle transportiert werden müssen, so ist für diesen aktiven Transport Energie notwendig. Diese entsteht durch die Bindung von ATP an die ATP-Bindungseinheit der ABC-Transporter und die darauffolgende Hydrolyse von ATP (AMBUDKAR et al. 1999; DEAN et al. 2001). P-Glycoprotein, das unter Verbrauch von Energie (ATP) Substanzen aus der Zelle hinaus transportiert, zählt zu den multidrug resistance (MDR)-Transportproteinen. Charakteristisch für diese Proteingruppe ist, dass sie nicht nur körpereigene und toxische Stoffe, sondern auch Medikamente aus der Zelle heraus transportieren können. Die MDR-Proteine bekamen ihren Namen, da sich bei der Behandlung eines Krebspatienten zeigte, dass die Tumorzellen nicht nur eine Resistenz gegenüber dem Chemotherapeutikum entwickelten, mit dem der Patient behandelt worden war, sondern auch gegenüber weiteren Stoffen, mit denen der Patient bislang noch nicht therapiert worden war (EFFERTH u. VOLM 1990; SZAKACS et al. 2006). Die Wirkung von P-Glycoprotein ist vielfältig. So können z.B. Antibiotika mit Hilfe von P-Glykoportein aus Bakterienzellen hinausgeschleust werden. Dies ist eine der effektivsten Formen der
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Resistenzentwicklung von Krankheitserregern gegenüber Antibiotika. Ebenso können Tumorzellen Zytostatika aus dem Zellinnere hinauspumpen, wodurch diese resistent gegenüber der Chemotherapie werden (BORGES-WALMSLEY et al. 2003). In manchen Studien konnte Resveratrol eine hemmende Wirkung auf das P-Glycoprotein zugeschrieben werden. Somit könnte Resveratrol entweder die P-Glycoprotein-abhängige zelluläre Aufnahme oder die P-Glycoprotein-abhängige zelluläre Abgabe von verschiedenen Substanzen reduzieren oder sogar hemmen (NABEKURA et al. 2005; CHOI et al. 2009).
In mehreren Studien konnte gezeigt werden, dass Proteine aus der Familie der ABC- Transporter auch an den Transport von Polyphenolen beteiligt sind. So wurde festgestellt, dass Grünteepolyphenole durch P-Glycoprotein und multidrug resistance-associated (MRP)- Proteine aus der Zelle ausgeschleust werden können (HONG et al. 2002; VAIDYANATHAN u. WALLE 2003). Des Weiteren konnte auch gezeigt werden, dass Rotweinpolyphenole ähnlichen Mechanismen unterliegen (LANCON et al. 2004; HENRY et al. 2005).
1.3 Zellzyklus
Unter Zellzyklus versteht man den Zeitraum zwischen der Entstehung von zwei Tochterzellen aus einer Mutterzelle und ihrer erneuten Teilung in zwei weitere Tochterzellen. Diese Zeitperiode kann unterteilt werden in Mitose (auch M-Phase genannt) und die Interphase. Die Interphase wird wiederum in G1-, S- und G2-Phase unterteilt. Der Zellzyklus ist somit der sich regelmäßig wiederholende Ablauf von Mitose und Interphase. Die G1-Phase (G von engl. „gap“ = Lücke) ist das erste Stadium der Interphase. Die Interphase dient vor allem dazu, der Zelle Zeit zum Wachstum zu geben. Hier findet die RNA- und Proteinsynthese statt, die DNA-Replikation wird vorbereitet und es entscheidet sich, ob die Zelle den Zyklus ein weiteres Mal durchläuft oder ob sie in die G0-Phase (Ruhephase) übergeht. Zu diesem Zeitpunkt ist die Zelle noch diploid, d.h. es liegt ein einfacher Chromosomensatz vor. Am Ende der G1-Phase befindet sich ein Kontrollpunkt, der den Fortschritt des Zellzyklus überprüft. Erfüllt die Zelle und die darin enthaltene DNA alle Voraussetzungen für eine Zellteilung wie ausreichende Zellgroße, RNA- und Proteinsynthese, tritt sie in die nächste Phase des Zellzyklusses, die S-Phase, ein. Die S-Phase (=Synthesephase) ist das zweite Stadium der Interphase. Die Zelle wächst durch die Produktion von RNA und Proteinen an und verdoppelt ihren DNA-Gehalt durch DNA-Synthese, so dass die Zelle am Ende der S- Phase tetraploid ist. Das dritte Stadium der Interphase ist die G2-Phase (=Postsynthesephase).
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In dieser Phase wächst die Zelle weiter auf ungefähr die doppelte Größe, produziert neue Proteine und beendet die Vorbereitung für die Mitose. Zwischen G2-Phase und Mitose befindet sich ein weiterer Kontrollpunkt des Zellzyklus, der darüber entscheidet, ob die Zelle in die Mitose übergehen kann. Im letzten Schritt des Zellzyklus, der eigentlichen Zellteilungsphase, wächst die Zelle nicht weiter, sondern teilt sich in zwei Tochterzellen.
Diese können erneut den Zellzyklus durchlaufen oder in einen Differenzierungsprozess eintreten (G0-Phase). Hier befindet sich ein weiterer Kontrollpunkt des Zellzyklus, der darüber entscheidet, ob die Zelle erneut in den Zyklus eingeschleust wird oder in die Differenzierungsphase eintritt (ALBERTS 2004; MORGAN 2007).
1.3.1 Regulation des Zellzyklus
Der Verlauf einer Zelle durch den Zellzyklus wird durch verschiedene Zytoplasmaproteine kontrolliert und reguliert. Die wichtigsten Vertreter dieser Proteine sind die Cycline. Das G1- Phasen-Cyclin (Cyclin D) ist über den gesamten Zellzyklus vorhanden, seine Konzentration steigt jedoch während der G1-Phase an. Das G1/S-Phasen-Cyclin (Cyclin E) liegt am Übergang zwischen G1-Phase und S-Phase in hoher Konzentrationen vor und fällt im Laufe der S-Phase wieder ab. Das S-Phasen-Cyclin (Cyclin A) steigt am Anfang der S-Phase an, behält ein Maximum während der gesamten S-phase bis zur G2-Phase sowie während der Mitose und fällt im weiteren Verlauf wieder ab. Das G2/Mitose-Phase-Cyclin (auch Cyclin B genannt) steigt während der G2-Phase an und erreicht ein Maximum zur Beginn der Mitose.
Dieser zyklische Anstieg und Abfall der verschiedenen Cycline ist für die unterschiedlichen Zellzyklusphasen essentiell. Neben den Cyclinen sind auch Cyclin-abhängige Kinasen (engl.
cyclin dependent kinases, CDK) an der Kontrolle und Regulation des Zellzyklusses beteiligt.
Es handelt sich dabei um Proteinkinasen, die andere Enzyme durch Phosphorylierung aktivieren oder inaktivieren können. Die Menge an CDKs ist während des gesamten Zellzyklus gleichbleibend. Die CDKs bilden Komplexe mit den dazugehörigen Cyclinen und werden erst durch diese aktiviert. Die Aktivität der CDKs wird allein durch den zyklischen Anstieg und Abfall der Cycline reguliert. Es werden vier CDKs unterschieden: CDK 4 und 6, welche zusammen mit Cyclin D als G1-Cyclin-CDK-Komplex fungieren. CDK 2 bildet zum einen mit Cyclin E den G1/S-Cyclin-CDK-Komplex, zum anderen mit Cyclin A den S- Cyclin-CDK-Komplex. CDK 1 bildet jeweils mit Cyclin A und Cyclin B den M-Cyclin- CDK-Komplex.
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Das G1-Cyclin (D-Cyclin)-Level steigt an und bindet an die dazugehörigen CDKs.
Anschließend wird an die Zelle ein Signal gesendet, um die Replikation der Chromosomen vorzubereiten. Durch steigende Konzentration des S-Phasen-Cyclins (A-Cyclin) und seiner Bindung an CDK 2 entsteht der S-Phasen-promoting-Faktor (SPF). Dieser tritt in den Zellkern ein und bereitet die Zelle auf die DNA-Duplikation vor. Während des Fortschreitens der DNA-Duplikation, steigt die Konzentration des Mitose-Cyclins (Cyclin B) an. Die Bindung von Cyclin B an CDK 1 führt zur Entstehung des M-Phase-Promoting-Faktors (MPF). Dieser führt zur Chromosomenkondensation, dem Abbau der Kernhülle und zur Bildung der Mitosespindel. All diese Ereignisse führen letztendlich zur Start der Mitose (GALDERISI et al. 2003).
1.3.2 Kontrollpunkte des Zellzyklus
Eine Zelle hat verschiedene Mechanismen entwickelt, um zu verhindern, dass beispielsweise fehlerhafte DNA-Moleküle an die Tochterzellen weitergegeben werden. Mit diesen Mechanismen kann eine Zelle kontrollieren, ob sie den Zellzyklus weiter durchlaufen kann oder ob dieser angehalten werden muss, um DNA-Reparaturarbeiten durchzuführen. Diese Kontrolle kann auch dazu führen, falls die Fehler nicht mehr zu beheben sind, dass die Zelle in den programmierten Zelltod, die Apoptose, übergeht. Hierdurch kann die Aufrechterhaltung eines gesunden Organismus gewährleistet werden (ELLEDGE 1996;
PIETENPOL u. STEWART 2002). Es sind drei festgelegte Kontrollpunkte im Verlauf des Zellzyklus eingebaut. Der Erste, auch Restriktionspunkt genannt, befindet sich am Ende der G1-Phase, vor dem Eintritt in die S-Phase. Hier wird überprüft, ob DNA-Schäden (die z.B.
durch Strahlung, reaktive Sauerstoffspezies oder verschiedene Substanzen entstehen können) vorhanden sind, ob die Zelle groß genug ist und ob die Umgebungsbedingungen günstig sind.
DNA-Schäden, die vor Eintritt in die S-Phase entdeckt werden, führen über verschiedene Wege zur Hemmung des Cyclin E-CDK 2-Komplexes, was einen Zellzyklusarrest zur Folge hat. Dieser Zellzyklusstopp dient dazu, der Zelle Zeit zu geben, um den entstandenen Schaden reparieren zu können (DELSAL et al. 1996). Wenn dies allerdings nicht gelingt, kann die Zelle in die Apoptose geschickt werden. Liegen jedoch zum Zeitpunkt der Kontrolle keine DNA-Schäden vor, und sind alle o. g. anderen Kriterien erfüllt, kann die Zelle weiter im Zyklus fortschreiten und in die S-Phase übergehen. In der S-Phase ist ein weiterer Kontrollpunkt vorhanden (TERCERO et al. 2003). Der S-Phase-Kontrollpunkt koordiniert
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hauptsächlich die DNA-Replikation. Neben der DNA-Reparatur wird die Stabilisierung der DNA-Replikation nach DNA-Schäden, die Wiederaufnahme der DNA-Replikation nach Reparatur und Hemmung der Mitose kontrolliert, bis die DNA-Replikation vollständig abgeschlossen ist. Wenn eine Bedrohung für die DNA-Replikation z.B. durch DNA-Schäden oder Nukleotid-Abbau besteht, wird der S-Phase-Checkpoint aktiviert (BRANZEI u. FOIANI 2007; PAULSEN u. CIMPRICH 2007; TOURRIERE u. PASERO 2007). Während der DNA- Replikation muss die Zelle in hoher Bereitschaft sein. Hier können viele Fehler auftreten, wie z.B. DNA-Strangbrüche und die fehlerhafte Anordnung der Basen. Zwar sind entsprechende Kontrollmechanismen in allen Zellzyklusphasen vorhanden, diese sind aber nicht fehlerfrei und das Risiko, dass nicht ausreichend reparierte DNA in die Mitosephase übertragen wird, besteht immer wieder. An den Kontrollpunkten des Zellzyklusses werden Informationen über geschädigte DNA als erstes an zwei Proteine der phosphoinositide 3-kinase related kinases (PIKK)-Familie gesendet. Die Proteine ATM (ataxia-telangiectasia-mutated) und ATR (ATM- and Rad3-related) können DNA-Schäden detektieren, vor allem DNA-Doppelstrang- brüche, und dann den geregelten Zellzyklusablauf unterbrechen, falls Schäden entdeckt worden sind (ABRAHAM 2001). Während ATM bei allen Kontrollpunkten eine wichtige Rolle spielen, hat ATR vor allem bei der Überwachung und Reparatur der DNA während der S-Phase eine besondere Bedeutung (LUPARDUS et al. 2002). Das Protein P53 hat eine wichtige Funktion bei der Regulierung des Zellzyklusses nach der ATM/ATR Kontrolle, spielt jedoch bei der Kontrolle und Regulierung der DNA-Replikation während der S-Phase keine Rolle (ABRAHAM 2001). Das letzte Hindernis, das Zellen mit beschädigter DNA vor dem Eintritt in die Mitose-Phase blockieren und kontrollieren kann, ist der G2-Kontrollpunkt.
Nach erfolgreichem Ablauf der G1- und S-Phase, wird die Zelle erneut kontrolliert, um wiederholt zu überprüfen, ob Schäden an der DNA entstanden sind. Dieser Kontrollpunkt ähnelt dem G1-Kontrollpunkt, allerdings dominiert hier nicht CDK 2 sondern CDK 1 (siehe oben). Wenn die DNA nach der S-Phase beschädigt wird, wird die Bindung von Cyclin B an CDK 1 gehemmt, dementsprechend entsteht kein MPF und der Zellzyklus wird angehalten.
Ohne den MPF kann die Zelle nicht in die Mitose-Phase übergehen und die Zelle erstarrt in der G2-Phase, noch vor Übergang in die Mitose. Weitere Kontrollmechanismen sind auch für die Mitose-Phase beschrieben worden, wie z.B. die Gene der mitotic arrest deficient (MAD)-
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Gene. Falls zu diesem Zeitpunkt ein Fehler entdeckt wird, blockieren diese Gene den Eintritt in die Anaphase der Mitose.
1.4 Apoptose
Eine für Resveratrol beschriebene Wirkung ist die Induktion der Apoptose (PERVAIZ 2003;
FULDA u. DEBATIN 2006). Unter Apoptose versteht man eine Form des physiologischen Zelltodes, welcher von der Zelle, im Gegensatz zur Nekrose, aktiv durchgeführt wird. Die Apoptose, auch programmierter Zelltod genannt, ist für den Organismus notwendig, um die Zellteilung auszugleichen und somit das zelluläre Gleichgewicht aufrechtzuerhalten (COHEN 1993). Daher haben die meisten Körperzellen eine begrenzte Lebensdauer und begehen, wenn sie gealtert oder beschädigt sind, „Selbstmord“, das dem Überleben des Organismus dient.
Schon während der Embryonalentwicklung tritt der programmierte Zelltod örtlich und zeitlich begrenzt (z.B. bei der Ausbildung von Extremitäten und der Finger- und Zwischenzehenräume) auf (BRILL et al. 1999). Der programmierte Zelltod findet aber nicht nur in reifendem, sondern auch in ausdifferenzierten gesunden Geweben, wie z.B. in den Epithelien des Magen-Darm-Traktes, in lymphatischen Organen, in der Leber und hormonell regulierten Geweben wie Prostata und Ovarialfollikel, statt (HARRIS u. SAVILL 1995;
VINATIER et al. 1996). Außerdem hat der programmierte Zelltod eine Bedeutung bei der Kontrolle des Immunsystems. Autoreaktive Klone von immunkompetenten Zellen können durch diesen Mechanismus eliminiert werden (COHEN et al. 1992). Bei gestörter Regulation der Apoptose, kann es zu pathologischen Veränderungen kommen. So besteht bei Tumorzellen im Vergleich zu normalen Zellen eine geringere Sensitivität für die Auslösung der Apoptose (CALDAS et al. 2005). Durch eine verstärkte Proliferation und einen gleichzeitig verminderten Zelluntergang kann es zur Tumorentstehung kommen (DOHI et al.
2004). Bei einer antineoplastischen Behandlung ist vor allem die Induktion vom programmierten Zelltod an der Tumorregression beteiligt. Es wurde gezeigt, dass eine Reihe von chemotherapeutischen Wirkstoffen, ebenso wie die Strahlentherapie, die Apoptose auslösen kann (KAUFMANN u. EARNSHAW 2000; NIJHUIS et al. 2006; BAUER 2007;
ZHAO et al. 2010).
Die Apoptose, also das Endstadium des programmierten Zelltodes, kann in zwei Phasen unterteilt werden. Die erste Phase beginnt mit der Ablösung der sterbenden Zelle vom
Einleitung 12
Zellverband und deren Schrumpfung (KERR et al. 1972; HACKER 2000). Die Kondensation von Chromatin wird sichtbar, der Kern zerfällt in kleine Fragmente und die Plasmamembran bildet blasenartige Ausstülpungen. Diese schnüren sich vollständig ab und bilden die apoptotischen Körper, die wiederum Kernfragmente und Zellorganellen enthalten können. An der Oberfläche dieser apoptotischen Körper befindet sich nun Phosphatidylserin, das sich normalerweise im inneren Blatt des Zellmembrans befindet. Dieses Molekül signalisiert den Nachbarzellen, dass die Zerfallsfragmente phagozytiert werden sollen. Die zweite Phase der Apoptose ist die phagozytotische Aufnahme der apoptotischen Körper durch benachbarte Zellen in einem Zellverband (SAVILL u. FADOK 2000; KUROSAKA et al. 2003; ELMORE 2007). Die Mechanismen der Apoptose sind sehr komplex und anspruchsvoll. Sie bedingen eine energie-abhängige Kaskade von verschiedenen molekularen Ereignissen. Dabei sind zwei Hauptsignalwege bekannt: Der rezeptorvermittelte oder extrinsische Weg und der mitochondriale oder intrinsische Weg. Ein dritter Weg ist der durch T-Zellen vermittelte Zytotoxizitäts- und Perforin-/Granzym-abhängige Weg, auf den hier nicht näher eingegangen wird.
1.4.1 Extrinsische Signalweg der Apoptose
Der extrinsische Signalweg der Apoptose umfasst die Interaktion spezifischer Liganden mit speziellen Oberflächenrezeptoren der Zielzelle (Abb. 2). Die am besten untersuchten Rezeptoren gehören zur tumor necrosis factor (TNF)-Familie. Die Rezeptoren dieser Gengruppe besitzen eine extrazelluläre Domäne, eine sog. zytoplasmatische „Todesdomäne“, über die die apoptotische Signalkaskade eingeleitet wird. Die Todesdomäne spielt eine wichtige Rolle bei der Übertragung der Apoptose-Signale von der Zelloberfläche zu den intrazellulären Signalwegen. Beispiele für Liganden und deren Rezeptor sind Fas-Ligand (FasL)/Fas-Rezeptor (FasR) und TNF-α/TNF-Rezeptor 1 (TNFR1). Die Aktivierung durch den Ligand induziert eine Veränderung des Rezeptors und die nachfolgende Bindung weiterer Proteine an die Todesdomäne. Die Bindung von FasL an seinen Rezeptor hat eine Bindung an das Adapterprotein Fas-associated protein with death domain (FADD) zur Folge. FADD assoziiert nachfolgend mit Procaspase 8 und es entsteht der death inducing signaling complex (DISC), der wiederum Caspase 8 aktiviert. FADD kann zusätzlich Caspase 10 aktivieren.
Während einerseits gezeigt wurde, dass die durch Resveratrol induzierte Apoptose über diese Mechanismen ausgelöst werden kann (DELMAS et al. 2003), wurde andererseits festgestellt,
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dass die Wirkung von Resveratrol nicht über diese Mechanismen reguliert wird (BERNHARD et al. 2000; WANG et al. 2003). Die Bindung von TNF-Ligand an seinen Rezeptor, hat eine Bindung an das Adapterprotein TRADD zur Folge. TRADD bindet wiederum an FADD und kann somit auch die entsprechenden Caspasen aktivieren. Eine Aktivierung der Apoptose über diesen Weg wurde im Fall von Resveratrol bereits diskutiert (SHANKAR et al. 2007). Die Bindung von TNF-α an seinen Rezeptor TNFR1 kann auch direkt die Aktivierung von Caspase 2 hervorrufen. Die Aktivierung dieser Caspase führt wiederum zur Auslösung der Caspase-Kaskade in der Zelle und somit zur Auslösung des programmierten Zelltodes (ELMORE 2007).
1.4.2 Intrinsische Signalweg der Apoptose
Der intrinsische Signalweg der Apoptose umfasst unterschiedliche Rezeptor-unabhängige Stimuli, die intrazelluläre Signale auslösen können (Abb. 2). Diese Signale gehen von den Mitochondrien aus und können direkt auf verschiedene Ziele innerhalb der Zelle wirken. Die Stimuli können sowohl positiv als auch negativ auf die Apoptose wirken. Negative Stimuli wie z.B. die Abwesenheit von Wachstumsfaktoren, Hormonen und Zytokinen können die Hemmung des programmierten Zelltodes aufheben und somit zur Auslösung der Apoptose führen. Positive Stimuli, die den Apoptose-Prozess aktiv fördern können, sind neben Strahlung, Toxinen, verminderter Sauerstoffversorgung und Hyperthermie auch Virus- infektionen und freie Radikale. Alle diese Stimuli werden über das Tumor-suppressor Protein p53 kontrolliert. Es wurde gezeigt, dass Resveratrol die Apoptose über einen p53-Protein- abhängigen Signalweg auslösen kann (HUANG et al. 1999; ALKHALAF 2007). P53 kann die Transkription des Todesrezeptors Fas erhöhen und somit die Zelle für den extrinsischen Apoptoseweg sensibilisieren. Das p53 ist jedoch hauptsächlich für die Aktivierung von DNA- Reparatur-Mechanismen verantwortlich, wenn die DNA einer Zelle Schädigungen aufweist.
Das Protein p53 kann den Zellzyklus anhalten und der Zelle die Möglichkeit geben, einen vorhandenen Schaden zu reparieren. Falls der Schaden irreparabel ist und p53 in großen Mengen vorliegt, aktiviert es die Apoptose. Diese Aktivierung wird vor allem über die Proteine der Bcl-2-Familie reguliert. p53 kann die Expression pro-apoptotisch wirkender Mitglieder dieser Familie (vor allem Bax) stimulieren und somit auch Veränderungen in der inneren Mitochondrienmembran verursachen, die eine Entstehung von Poren in der Membran zur Folge haben. Diese Poren erlauben einen Austritt von pro-apoptotischen Proteinen aus
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dem Raum zwischen der inneren und der äußeren Mitochondrienmembran in das Zytosol.
Eines dieser Proteine ist das Cytochrom c, welches im programmierten Zelltod eine zentrale Rolle spielt. Während des programmierten Zelltodes wird es über die Poren ins Zytosol freigesetzt, wo es mit apoptosis-protease activating factor-1 (APAF-1), Procaspase 9 und ATP ein Apoptosom bildet. Dieses führt zur Aktivierung von Caspase 9, die ihrerseits nachfolgende Caspasen, vor allem die Caspase 3, aktiviert. Zu den Mitgliedern der Bcl-2- Proteinfamilie zählen sowohl pro- als auch anti-apoptotisch wirkende Proteine. Pro- apoptotisch wirkende Mitglieder sind unter anderem Bax, Bad und Bak. Für Resveratrol konnte auch eine Bax-assoziierte Apoptose-Auslösung beschrieben werden (MAHYAR- ROEMER et al. 2002). Zu den anti-apoptotisch wirkenden Mitgliedern zählen Bcl-2 und Bcl- xL. Bcl-2 wirkt anti-apoptotisch, indem es die Entstehung von Poren in der Mitochondrienmembran verhindert und somit die Freisetzung von pro-apoptotischen Proteinen blockiert. Dies führt dazu, dass wichtige Adapter, die für die Aktivierung der Caspasenkaskade notwendig sind, fehlen. Bax wirkt dem Bcl-2 entgegen, indem es die Porenentstehung in der Mitochondrienmembran fördert. Außerdem ist Bax in der Lage, Bcl-2 direkt zu blockieren (FLETCHERA et al. 2008). AZIZ et al. (2006) konnten zeigen, dass Resveratrol durch eine Hemmung der anti-apoptotischen Proteine und gleichzeitiger Erhöhung der pro-apoptotischen Proteine der Bcl-2-Familie die Apoptose auslösen kann.
Hsp27 ist ein weiteres anti-apoptotisch wirkendes Protein, welches zu den kleinen Hitzeschockproteinen (engl. small heat shock proteins, Hsp) gehört. Proteine der Hsp-Familie sind zum einen wichtig für die Thermotoleranz, zum anderen können sie das Apoptose- Geschehen beeinflussen. Hsp27 beeinflusst die äußere Mitochondrienmembran und behindert somit die Entstehung des Apoptosom-Komplexes sowie die Aktivierung von Caspase-9. Des Weiteren kann es den extrinsichen Apoptoseweg hemmen, indem es das Adapterprotein des Fas-Liganden hemmt und somit die Bindung von Fas an seinen Ligand verhindert (CONCANNON et al. 2003).
Einleitung 15
Abb. 2. Ein wichtiger Signalweg wird durch Death-Liganden (z.B. FasL) aktiviert (linker Teil der Abbildung). Durch Bindung des Liganden wird ein membranständiger Signalkomplex (DISC) gebildet, der aus CD95L, CD95R, dem Adapterprotein FADD und der Initiator- Caspase Procaspase-8 besteht, welche hierdurch aktiviert wird. Caspase 8 wiederum spaltet und aktiviert die Effektor-Caspase 3. Dieser Signalweg kann amplifiziert werden durch (1) Caspase 8-vermittelte Spaltung von Bid bzw. (2) durch die Caspase-6-vermittelte Spaltung von Caspase 8, die beide den Caspase 8-Signalweg mit dem mitochondrialen Apoptosom (mitochondrialer DISC) verknüpfen (DANIEL 2002)
1.4.3 Caspasen
Caspasen sind Proteasen, die in ihrem aktiven Zentrum die Aminosäure Cystein enthalten und Proteine nach der Aminosäure Aspartat schneiden (Cysteinyl-Aspartat-Proteasen). Da bestimmte Caspasen in der Lage sind, weitere Enzyme dieser Gruppe zu aktivieren, entsteht eine intrazelluläre Caspasen-Kaskade, die als Signalvermittler und -verstärker dient. Die am
Einleitung 16
programmierten Zelltod beteiligten Caspasen können in drei Gruppen unterteilt werden:
Proinflammatorische Caspasen, Initiator-Caspasen und Effektor-Caspasen. Die proinflamma- torische Caspasen (Caspasen 1, 4, 5 und 11) haben als Hauptfunktion die Prozessierung von Cytokinen und werden hier nicht weiter dargestellt. Die Initiator-Caspasen 2, 8, 9 und 10 werden auch Apoptose-auslösende Caspasen genannt und stehen am Anfang der Kaskade (Abb. 2). Sie werden durch Adapter-Moleküle wie APAF-1 und FADD aktiviert und können selbst die nachfolgenden Effektor-Caspasen aktivieren. Die Effektor-Caspasen 3, 6 und 7 werden auch Apoptose-ausführende Caspasen genannt und können durch Initiator-Caspasen aktiviert werden, woraufhin diese eine Vielzahl von verschiedenen Proteinen spalten. Die Aktivierung der Initiator-Caspasen (Caspase 8 und 9) findet im Apoptosom statt.
Ziel der Arbeit 17
2 Ziel der Arbeit
Krebserkrankungen gehören zu den häufigsten Todesursachen weltweit. Dabei steht die Tumorentstehung am Ende eines mehrstufigen Prozesses, der durch eine abnormale Zell- und Gewebsdifferenzierung gekennzeichnet ist. Der Begriff Chemoprävention bezeichnet den Einsatz bioaktiver Substanzen, die den Kanzerogenese-Prozess verzögern bzw. hemmen können. In diesem Zusammenhang sind in den letzten Jahren eine Reihe von Naturstoffen in den Mittelpunkt des wissenschaftlichen Interesses gerückt, da sie die Fähigkeit besitzen, in den Tumorentstehungsprozess frühzeitig einzugreifen und die Schädigung der DNA zu unterbinden (SPORN u. SUH 2000). Einer dieser Naturstoffe mit krebspräventiver Wirkung ist das Phytoalexin Resveratrol (JANG et al. 1997; LIN u. TSAI 1999), welches in relativ hoher Konzentration vor allem in Weintrauben vorkommt. Es kumuliert in der Schale und den Kernen der Früchte, kann aber auch in den Wurzeln und Ästen des Weinstocks nachgewiesen werden. Darüber hinaus kommen in Weinreben so genannte Resveratrol-Oligomere vor, denen man auch eine krebspräventive Wirkung zuschreibt (ITO et al. 2003; PIVER et al.
2003b; KIM et al. 2007). Vineatrol®30, ein von der französischen Firma Actichem entwickelten und von der Firma Breko GmbH auf dem Markt gebrachten Weinrebenextrakt, enthält nicht nur Resveratrol, sondern auch eine hohe Menge an Resveratrol-Oligomeren.
Einzelne Veröffentlichungen deuten darauf hin, dass Vineatrol®30 sowie einzelne Resveratrol-Oligomere teilweise eine stärkere krebspräventive Wirkung als Resveratrol selbst entfalten können (BILLARD et al. 2002; COLIN et al. 2008; MAREL et al. 2008). In der vorliegenden Arbeit soll die wachstumshemmende Wirkung des Weinrebenextraktes Vineatrol®30 und der darin enthaltenen Resveratrol-Oligomere auf Humantumorzelllinien untersucht und die molekularen Mechanismen, die der wachstumshemmenden Wirkung zugrunde liegen, charakterisiert werden.
Material und Methoden 18
3 Material und Methoden
3.1 Testsubstanzen
Vineatrol®30 wurde von der Firma Breko GmbH in Bremen zur Verfügung gestellt. trans- Resveratrol und trans-Piceatannol wurden von der Firma Sigma-Aldrich GmbH bzw. Axxora GmbH erworben. Das Dimer ε-Viniferin sowie die Tetramere r-2-Viniferin und Hopeaphenol wurden von der Firma Actichem (Montauban, Frankreich) und das Dimer Ampelopsin A von Herrn Sebastian Macke (Arbeitsgruppe Prof. Dr. P. Winterhalter, Technische Universität Braunschweig) zur Verfügung gestellt. In Tab. 2 sind die in dieser Promotionsarbeit verwendeten Substanzen sowie deren molare Masse und Reinheitsgrad aufgelistet.
Tab. 2. Die in der Arbeit verwendete Substanzen sowie deren molare Masse und Reinheitsgrad.
Substanz Molare Masse Reinheitsgrad
Vineatrol®30 Substanzgemisch -
trans-Resveratrol 228.25 g/mol >99 %
trans-Piceatannol 244.24 g/mol >99 %
r-2-Viniferin 890.8 g/mol 76,5 %
ε-Viniferin 454.5 g/mol >90 %
Hopeaphenol 906.9 g/mol >95 %
Ampelopsin A 470.5 g/mol 92 %
Die Testsubstanzen wurden eingewogen und in Ethanol gelöst (100 mM Stammlösung). Mit Hilfe dieser Stammlösungen wurden Verdünnungsreihen hergestellt deren Konzentrationen dem 1000-fachen der Endkonzentrationen, die auf die Zellen gegeben wurden, entsprachen.
Um eine Verdunstung des Ethanols zu verhindern wurden diese Schritte auf Eis unter der Sterilbank durchgeführt. Unmittelbar vor Behandlung der Zellen wurden die Lösungen mit Zellkulturmedium 1:1000 verdünnt, um die entsprechenden Endkonzentrationen zu erreichen und die Ethanolkonzentration für die Zellen möglichst gering zu halten. Dieses Behandlungs-
Material und Methoden 19
medium ersetzte das reguläre Medium über den Versuchszeitraum und enthielt alle üblichen Bestandteile. Alle Stammlösungen wurden bei -20 °C gelagert.
3.2 Zellkultur
3.2.1 Zelllinien
Alle in dieser Arbeit verwendeten Zelllinien wurden aus Humantumoren etabliert und von der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) bzw. von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ, Braunschweig) erworben.
In Tab. 3 sind die in dieser Promotionsarbeit verwendeten Zelllinien aufgelistet.
Tab. 3. Die in dieser Arbeit untersuchten Humantumorzelllinien und deren Ursprung.
Zelllinie Ursprungsgewebe
HT-29 kolorektales Adenokarzinom
Caco-2 kolorektales Adenokarzinom
HCT116 kolorektales Adenokarzinom
SW480 kolorektales Adenokarzinom
PC-3 Adenokarzinom der Prostata (Androgen-unabhängig) LNCaP Adenokarzinom der Prostata (Androgen-abhängig)
A-431 epidermoides Karzinom
MCF-7 Mammaadenokarzinom HepG2 hepatozelluläres Karzinom
3.2.2 Allgemeine Zellkultur Bedingungen
Die Zelllinien wurden in unterschiedlichen Zellkulturmedien (Tab. 4) bei 37°C, 5% CO2- Gehalt und 95% relative Luftfeuchtigkeit kultiviert und zweimal wöchentlich passagiert.
Dazu wurden die Zellen zweimal mit 5 mL warmem PBS gewaschen und mit 2 mL Trypsinlösung (Trypsin/EDTA 0.05 %/0,02 % w/v in PBS, Biochrom AG, Berlin), je nach Zelllinie 1-4 Minuten im Brutschrank bei 37 C° inkubiert. Trypsin ist eine Protease, die durch den Abbau, der für die Anhaftung der Zellen verantwortlichen Proteine, die Ablösung der Zellen von der Kulturgefäßoberfläche bewirkt. Anschließend wurden die gelösten Zellen in frischem Kulturmedium aufgenommen, um die Trypsinaktivität zu stoppen. Die im
Material und Methoden 20
Zellkulturmedium vorhandenen Proteine können die Trypsinwirkung an der Zelloberfläche kompetitiv durch einen Substratüberschuss hemmen.
.Tab. 4. Zusammensetzung der Nährmedien für die einzelnen Zelllinien.
Zelllinien Nährmedium
500 mL Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Biochrom) 50 mL fetales bovines Serum (FBS, Biochrom)
5 mL Penicillin/Streptomycin (10.000 E/10.000 µg/ml, Biochrom) A-431,
SW480, HT-29, HCT116, PC-3,
MCF-7 5 mL L-Glutamin (200 mM, Biochrom)
500 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium (Biochrom)
50 mL FBS
5 mL Penicillin/Streptomycin (10.000 E/10.000 µg/ml, Biochrom) HepG2
5 mL L-Glutamin 500 mL DMEM
50 mL FBS
5 mL Penicillin/Streptomycin (10.000 E/10.000 µg/ml, Biochrom) 5 mL L-Glutamin
Caco-2
5 mL Nicht-essentielle Aminosäurenlösung (Biochrom) 500 mL RPMI 1640 Medium
50 mL FBS
5 mL Penicillin/Streptomycin (10.000 E/10.000 µg/ml, Biochrom) 5 mL L-Glutamin
5 mL Hydroxyethylpiperazin-Ethansulfonsäure (HEPES) -Puffer (10 mM)
5 mL Natriumpyruvat (1 mM) 10 mL Natriumbicarbonat (0,15 %) LNCaP
2,25 g Glucose (4,5 g/L)
Die Zellen wurden anschließend bei 0.5 rcf für 5 min zentrifugiert (Kühlzentrifuge Eppendorf 5702 RH - Eppendorf AG, Hamburg), der Zellkulturüberstand entfernt und die Zellen erneut
Material und Methoden 21
in 10 mL Kulturmedium aufgenommen. Anschließend wurden die Zellen in 20 mL frischem Medium (je nach Zelllinie in einem bestimmten Verdünnungsverhältnis) in einer neuen Zellkulturflasche (75 cm3, Filter-Schraubkappe - TPP®, Ibbenbüren) zur Erhaltung der Zellkultur ausgesät.
3.2.3 Bestimmung der Zellzahl
Die Zellen wurden mit Hilfe von Trypsin von der Zellkulturflasche abgelöst, zentrifugiert und in einer Neubauer-Zählkammer (Hecht, Sondheim) gezählt. Dafür wurden 20 µL der Zellsuspension mit 180 µL einer Trypanblau-Lösung (0,5 % Biochrom) vermischt. Dieser Farbstoff wird von lebenden Zellen (mit einer intakten Plasmamembran) nicht aufgenommen, abgestorbene Zellen nehmen ihn dagegen auf und werden dadurch dunkelblau angefärbt.
Ausgezählt wurden nur die lebenden Zellen. Nach dem Auszählen der Zellen in vier Großfeldern wurde der Mittelwert bestimmt. Anschließend wurde der Mittelwert mit 10 (Verdünnungsfaktor durch Trypanblau) und dem Faktor 104 multipliziert. Somit wurde die Zellzahl pro mL Zellsuspension ermittelt.
3.2.4 Einfrieren von Zellen
Zellen wurden trypsiniert, in FBS aufgenommen, zentrifugiert, erneut in FBS aufgenommen und gezählt. Dimethylsulfoxid (DMSO; Roth, Karlsruhe) wurde der Zellsuspension (mindestens 1x106 Zellen pro Kryoröhrchen Cryo.sTM, Greiner Bio-One, Frickenhausen) als Frostschutzmittel hinzugefügt (Endkonzentration: 10%). Die Zellen wurden anschließend in einem auf 4 C° vorgekühlten CryoFreezing-Container „Mr. Frosty“ (Nalgene® Labware, Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Dänemark) gegeben und bei -80°C mindestens 24 h gelagert. Anschließend wurden die Kryoröhrchen mit den Zellen für die weitere Lagerung in flüssigen Stickstoff überführt.
3.2.5 Auftauen von Zellen
Die im flüssigen Stickstoff gelagerten Zellen wurden in einem Wasserbad (Typ 1086, GFL, Burgwedel) bei 37°C aufgetaut. Nach der Aufnahme in frischem Zellkulturmedium wurden die Zellen für 5 min bei 0,5 rcf und Raumtemperatur zentrifugiert (Kühlzentrifuge Eppendorf 5702 RH) und der Überstand verworfen. Der Zellpellet wurde erneut im Zellkultur-Medium aufgenommen und in einer Zellkulturflasche ausgesät
Material und Methoden 22
3.3 Sulforhodamin B-Assay
Der Sulforhodamin B (SRB)-Assay wird zur Bestimmung der Zelldichte bzw. der Zellzahl in einer Zellkultur verwendet. Diese Methode wurde ausgesucht, da sie eine sehr sensitive, einfache und kostengünstige Möglichkeit ist, große Zellzahlen verlässlich zu untersuchen. Sie kann auch als Screening-Methode bei der Untersuchung von antikanzerogen wirkenden Stoffen verwendet werden (SKEHAN et al. 1990). SRB ist ein Farbstoff, der zelluläre Proteine in Abhängigkeit vom pH-Wert anfärbt. Im sauren Milieu bindet SRB stöchiometrisch an basischen Aminosäuren und wird anschließend in einem basischen Milieu wieder extrahiert. Die optische Dichte des extrahierten Farbstoffes kann dann quantitativ mittels eines Spektrophotometers bestimmt werden, und die gemessene Proteinmenge ist direkt proportional zur Zellzahl. In der vorliegenden Arbeit wurde die wachstumshemmende Wirkung von Vineatrol®30 und die des darin enthaltenen Resveratrols und seiner Oligomere mittels des SRB-Assays untersucht. Dafür wurden je nach Zelllinie 1.500 (im Fall von MCF- 7-, HCT116 und Caco-2-Zellen) oder 2.500 Zellen pro Well in eine Mikrotiterplatte (96-Well, Flach-TPP®, Ibbenbüren) pipettiert. Nach einer Inkubationsperiode von 48 h wurden die Zellen mit steigenden Konzentrationen des Extraktes und der Einzelsubstanzen behandelt.
Nach einer weiteren Inkubationsperiode von 48 bis 120 h wurden die zellulären Proteine mit 50 µL einer 50 %-igen Trichloressigsäure (TCA)-Lösung (100 % w/v, Roth, Karlsruhe) pro Well im Kühlschrank bei +4°C 45 min lang gefällt. Nach fünf aufeinander folgenden Waschschritten wurden die Platten über Nacht in einem Trockenschrank gestellt.
Anschließend wurde je Well 70 µL SRB-Lösung (0,4 % in 1 %iger Essigsäure, w/v, Sigma- Aldrich, Taufkirchen/100 % w/v, Roth, Karlsruhe) auf die Zellen gegeben und diese 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde der Farbstoff mit 1 %-iger Essigsäure (100 %, Carl Roth, Karlsruhe) in fünf Waschschritten entfernt, und die Mikrotiterplatte erneut im Trockenschrank gestellt. Der gebundene Farbstoff wurde anschließend mit Hilfe eines 10 mM Tris-Puffers (TRIS-PUFFERAN®, pH 10,4, Carl Roth) extrahiert. Nach dem Schütteln der Platten für 30 Sekunden (Plattenschüttler Titramax x100, Heidolph, Schwalbach) wurde die Absorption mit Hilfe eines Mikroplatten-Readers (Photometer infinite® M200, Tecan Deutschland, Crailsheim) bei 540 gegen 690 nm photometrisch bestimmt. Die Intensität der Absorption ist proportional zum Gesamtproteingehalt und somit auch zur Anzahl der vorhandenen Zellen in jedem Well zu verstehen.
Material und Methoden 23
3.4 Zytotoxizität Bestimmung mittels CytoTox-OneTM-Assay
Der CytoTox-OneTM-Assay (Promega GmbH, Mannheim) ist eine fluorometrische Methode, mit deren Hilfe die Anzahl der nicht lebensfähigen Zellen in einer Multiwell-Platte bestimmt werden kann. Die Zellviabilität bzw. die Lebensfähigkeit einer Zelle ist meistens durch die Integrität der Plasmamembran definiert. Der Austritt verschiedener Moleküle wie z.B. das Enzym Laktatdehydrogenase (LDH) durch die geschädigte Plasmamembran kann zum Nachweis der Zytotoxizität herangezogen werden. Das im vorliegenden Testkit enthaltene Substrat ist das Tetrazolium-Salz Resazurin. Dieses wird in Anwesenheit von LDH, Laktat, NAD+ und dem Enzym Diaphorase zum rot fluoreszierenden Resorufin umgewandelt: LDH katalysiert die Oxidation von Laktat zu Pyruvat, und Resazurin wird unter Verbrauch des entstehenden NADH zu Resorufin umgesetzt (Abb. 3). Der Gehalt des rot fluoreszierenden Resorufins kann dann fluorometrisch bestimmt werden. Die Intensität der Fluoreszenz ist proportional zum LDH-Gehalt in den Zellkulturüberständen und somit ein Maß für die Zytotoxizität. Um den zytotoxischen Effekt von den zu prüfenden Substanzen zu ermitteln, wurden 2.500 Zellen pro Well in einer 96-Well-Platte (TPP®) ausgesät. 24 Stunden nach der Aussaat wurden die Zellen mit aufsteigenden Konzentrationen der Prüfsubstanzen behandelt.
Nach einer Inkubationszeit von 24 bis 120 h wurde der Assay entsprechend der Herstellerangaben durchgeführt. Dabei wird die aus beschädigten Zellen freiwerdende LDH- Menge durch die Zugabe von Laktat, NAD+ und Resazurin in Anwesenheit des Enzyms Diaphorase mittels eines Platten-Readers (Photometer infinite® M200) gemessen. Die Bildung von fluoreszierendem Resorufin ist proportional zum LDH-Gehalt im Medium. Nach der Lyse der in den Wells noch lebenden Zellen wurde der Gesamt-LDH-Gehalt pro Well ermittelt. Darüber hinaus wurde der LDH-Gehalt im zellfreien Zellkulturüberstand bestimmt.
Durch die Berücksichtigung beider Messungen kann der prozentuale Anteil der nicht mehr lebenden Zellen in einem Well berechnet werden.
Material und Methoden 24
Abb. 3. Prinzip des CytoTox-OneTM Assays. Die Freisetzung von LDH aus geschädigten Zellen wird durch Zugabe von Laktat, NAD+ und Resazurin in Anwesenheit des Enzyms
Diaphorase bestimmt. Die Bildung des fluoreszierenden Resorufins ist direkt proportional zur freigesetzten LDH-Menge.
3.5 Bestimmung der Apoptoserate mittels CaspaseGlo® 3/7-Assay Der CaspaseGlo® 3/7-Assay (Promega) ist ein Lumineszenz-Assay, der die Aktivität der Caspasen 3 und 7 erfasst. Der Kit enthält ein Substrat, bei dessen Spaltung Aminoluziferin freigesetzt wird. Aminoluziferin wird wiederum vom Enzym Luziferase umgesetzt, so dass ein Lumineszenzsignal entsteht (Abb. 4). Pro Well einer 96-Well-Platte (TPP®) wurden 2.500 Zellen ausgesät und 24 h im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit steigenden Konzentrationen der Prüfsubstanzen behandelt und für weitere 24 bis 120 h im Brutschrank gestellt. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden 50 µL Überstand von jedem Well entnommen und in eine weißwandige Messplatte (BRANDplates®, 96-well, lipoGrade™, Brand GmbH, Wertheim) pipettiert. Nach der Zugabe von 50 µL des Assay- Reagenz pro Well und einer 90-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurde das Lumineszenzsignal anhand eines Platten-Readers (Photometer infinite® M200) gemessen. Das Lumineszenzsignal ist direkt proportional zur Anzahl der in jedem Well vorhandenen apoptotischen Zellen.
Material und Methoden 25
Abb. 4. Prinzip des CaspaseGlo® 3/7-Assays. Die Caspasen 3 und7 führen zu einer Spaltung von Aminoluziferin, das wiederum ein Substrat des Enzyms Luziferase ist. Durch eine enzymatische Reaktion entsteht ein Lichtsignal, welches direkt proportional zur Aktivität der Caspasen im Zellkulturmedium ist.
3.6 Zelluläre Aufnahme von Vineatrol®30 und die darin enthaltenen Resveratrol-Oligomeren
SW480- und A-431-Zellen (10x105 Zellen pro Well einer 6-Well Platte) wurden ausgesät und 72 h im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurde Vineatrol®30 für 0-90 min hinzugefügt.
Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde der Zellüberstand in einem 2,0-mL Reaktionsgefäß überführt. Die Zellen wurden viermal mit je 200 µL PBS unter Zusatz von 0,1 % bovinem Serumalbumin (Albumin, Fraktion V, >98 %, Carl Roth, Karlsruhe) gewaschen, und die Waschlösung in ein 1,5-mL Reaktionsgefäß überführt. Anschließend wurden die Zellen mit 500 µL destilliertem Wasser lysiert und in einem separaten 1,5 mL Reaktionsgefäß aufgenommen. Die Wells wurden noch zweimal mit je 100 µL destilliertem Wasser gewaschen und die jeweiligen Überstände dem Zelllysat hinzugefügt. Die Waschlösung sowie das Zelllysat wurden zur Weiterverarbeitung und Analyse auf Trockeneis nach Karlsruhe an das Max Rubner-Institut (MRI) geschickt. Dem Zelllysat wurden 200 µL Methanol (HPLC Gradient Grade) hinzugegeben und zur Homogenisierung für 10 min in das Ultraschallbad gestellt. Anschließend wurden 400-500 µL des Homogenates mit Hilfe von Stickstoff bis zur Trocknung eingedampft. Die Rückstände wurden dann in 150 µL 30 %igem Acetonitril/
Material und Methoden 26
Methanol (1/1; v/v; HPLC Gradient Grade) aufgenommen, gevortext und bei 9000g und 4°C für 10 min zentrifugiert. Danach wurden die Proben mit Hilfe einer HPLC-Anlage (Elite LaChrom VWR, Darmstadt) unter Anwendung einer ProntosIL-Vorsäule (10 x 3,0 mm, 3 µM) und einer ProntoSIL C18-Säule (150 x 4,0 mm, 3 µm) (BISCHOFF Analysetechnik und -Geräte GmbH, Leonberg) analysiert. Der Gradient wurde, wie in Tab. 5 dargestellt, mit einem Fluss von 0,8 mL/min gefahren und bestand aus 0,1 % Ameisensäure (Eluent A) und Acetonitril / Methanol (1:1, v:v; HPLC Gradient Grade) (Eluent B). Zur Detektion wurde ein UV-Sprektrum von 200-400 nm aufgenommen und die Proben bei 280/307 nm ausgewertet.
Die Identifizierung von Resveratrol und ε-Viniferin erfolgte durch den Vergleich mit Standardsubstanzen und den charkteristischen UV-Absorptionssprektrum.
Tab. 5. Gradient zur Trennung der bioaktiven Komponenten des Vineatrol®30
Zeit
(Minuten) Eluent A Eluent B
0 65 35 1 65 35 11 61 39 34 39 61 36 0 100 38 0 100 40 65 35 45 65 35
3.7 Western Blotting
Das Western Blotting bezeichnet eine Methode zur Auftrennung und zum Transfer von Proteinen auf eine Trägermembran. Anschließend werden die Zielproteine über immunchemische Methoden detektiert (TOWBIN et al. 1979). Dafür werden die Zellen nach der Inkubation lysiert und das Gesamtprotein mittels einer Elektrophorese in einem Acrylamidgel aufgetrennt (LAEMMLI 1970). Danach werden die Proteine auf eine Membran überführt. Die Detektion der Proteine erfolgt mit Hilfe von spezifischen Antikörpern (BURNETTE 1981) und einem Lumineszenssystem.
Material und Methoden 27
3.7.1 Zellenaufbereitung für den Western Blotting
Nachdem die Zellen in 75-cm3 Flaschen die Konfluenz erreicht hatten, wurden die Zellen mit den zu untersuchenden Substanzen behandelt. Es erfolgte ein täglicher Zellkulturmedium- wechsel (inkl. der zu testenden Substanzen). Nach 120 h wurden die Zellen in einem Lysispuffer aufgenommen. Anschließend wurde eine Proteinbestimmung nach der Bicinchinon-Säure (BCA)-Methode durchgeführt (BCA Protein Assay Reagent, 23228, Pierce/Perbio, Bonn). Diese Methode macht sich zunutze, dass Proteine mit Cu2+-Ionen in alkalischem Milieu einen Komplex bilden können. Die Cu2+-Ionen werden dann im Komplex zu Cu+-Ionen reduziert und bilden mit BCA einen violetten Farbkomplex. Die Absorption dieses Farbkomplexes kann bei 562 nm gemessen werden. Die Zunahme der Absorption bei 562 nm ist ein Maß für die Proteinkonzentration in der Probe (SMITH et al. 1985).
25 mM Tris-Puffer (99 %, Carl Roth) 50 mM NaCl (99,5 %, Carl Roth
0,5 % Natriumdesoxycholat (Merck, Darmstadt) Lysispuffer:
0,5 % Triton x-100 (Carl Roth)
3.7.2 SDS-Gelelektrophorese
Vor dem eigentlichen Western Blotting wurden 30 µg des Proteingemisches 5 min bei 95 C°
denaturiert und anschließend mit Hilfe einer Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyl sulfate, SDS)-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgetrennt. Dabei binden sich die Proteine an das zugesetzte SDS und erhalten dadurch eine negative Ladung. Bei der anschließend verwendeten Methode nach Laemmli (1970) wurden die Proteine in einem Sammelgel mit 5 % Acrylamid konzentriert. Anschließend wurden die Proteine in einem Trenngel mit 10 % Acrylamid aufgetrennt. Die Elektrophorese erfolgte bei konstanten 50 V während des Einlaufens der Probe und bei 100 V während der Auftrennung in der mit Laufpuffer gefüllten Gelkammer (Bio-Rad, München). Die Gesamtdauer betrug ca. 120 min.
Als Marker diente ein gefärbtes Proteingemisch mit bekannten Molekulargewichtsgrößen (PageRuler™ Prestained Protein Ladder, Fermantas, St. Leon-Rot).
Material und Methoden 28
25 mM Tris-Puffer (99 %, Carl Roth) 250 mM Glycin (99 %, Carl Roth) Laufpuffer:
0,1 % SDS (Merck)
3.7.3 Proteintransfer
Nach der Elektrophorese erfolgt eine Inkubation des Gels, der Polyvinylidenfluorid (PVDF)- Membran und der 2 x 6 Blotting-Papiere (1 mm, Macherey-Nagel, Düren) im Transferpuffer für ca. 30 min. Es folgte der eigentliche Transfer, das so genannte Blotting, der Proteine auf eine Membran. Hierfür wurde eine PVDF-Membran (Roti-PVDF, Carl Roth) verwendet. Der Transfer erfolgte bei 4 mA/cm2 Membran und Raumtemperatur für ca. 90 min. Es folgte eine Voransicht der Banden. Dafür wurde die Membran zuerst mit dem roten Azofarbstoff Ponceau S (Sigma, Taufkirchen) 1 min lang gefärbt und anschließend 2 min lang mit H2O entfärbt. Nun konnte das Bandenmuster sowie der erfolgreiche Transfer anhand der vorgefärbten Marker beurteilt werden.
25 mM Tris-Puffer (99 %, Carl Roth) 192 mM Glycin (99 %, Carl Roth) Transferpuffer:
10 % Methanol (99,95 %, AE71.2, Carl Roth)
3.7.4 Inkubation mit Anti-P-Glycoprotein-Antikörpern
Nach erfolgreichem Blotting wurde die Membran bei Raumtemperatur 60 min lang mit einer Blockierlösung inkubiert. Diese diente dazu, die freien Bindungsstellen auf der Membran zu blockieren. Anschließend erfolgte die Inkubation über Nacht bei +4 C° mit den primären Antikörpern. Alle primären Antikörper (Tab. 6) wurden 1:200 in PBST/Milch (s. u.) verdünnt.
Material und Methoden 29
137 mM Natriumchlorid (Carl Roth) 2,7 mM Kaliumchlorid (Merck)
4,3 mM Dinatriumhydrogenphosphat (Merck) 1,47 mM Kaliumdihydrogenphosphat (Merck) 0,1 % Tween® 20 (Sigma-Aldrich, Taufkirchen) Blockierlösung:
(PBST/Milch, pH 7,4)
3 % Milchpulver (Carl Roth)
Tab. 6. Für das Western Blotting-Verfahren verwendeten Primärantikörper.
Antikörper Herkunft Hersteller
Anti-Glycoprotein Maus Convance, Emeryville, USA
Anti-ß-Actin Kaninchen Sigma-Aldrich
Nach drei Waschschritten mit PBST für je 10 Minuten folgte eine Inkubation der Membran für 45 min bei +4 C° mit den sekundären Antikörpern. Alle sekundären Antikörper (Tab. 7) wurden 1:1000 in PBST/Milch verdünnt.
Tab. 7. Für das Western Blotting-Verfahren verwendeten Sekundärantikörper.
Antikörper Hersteller Anti-mouse IgG-HRP Amersham, Freiburg
Anti-rabbit IgG-HRP Amersham
Zur Detektion des gebundenen Sekundärantikörpers wurde der ECL-Detektionsreagenz der Firma Amersham™ (Freiburg) eingesetzt. Das am sekundären Antikörper gekoppelte Enzym ist die Meerettichperoxidase (HRP = horseradish peroxidase). Diese Peroxidase katalysiert die Oxidation des Substrats Luminol. Überall dort, wo eine HRP-markierte Antikörper-Antigen- Reaktion stattgefunden hatte, entstand ein intensives Lumineszenzsignal. Dieses kann durch die Exposition eines Hyperfilm ECL (Amersham) mit der Membran nachgewiesen werden.
Die Expositionszeit lag bei 15 Sekunden bis 30 Minuten.
Material und Methoden 30
3.8 Durchflusszytometrie
Die Durchflusszytometrie (Fluorescence activated cell sorting = FACS) ist ein Messverfahren mit dem man u. a. Zellen charakterisieren kann. Das Messprinzip beruht auf der Emission eines optischen Signals, das von einer Zelle ausgesandt wird, nachdem diese durch einen Laserstrahl angeregt worden ist. Zellen streuen einen Teil des anfallenden Lichtes, welches mittels Detektoren nachgewiesen werden kann. Mit Hilfe eines Flüssigkeitssystems können Zellen in einem Flüssigkeitsstrahl einzeln zum Messpunkt transportiert und dort nacheinander vom Laserstrahl getroffen werden. Zum Durchflusszytometer gehören auch Detektoren für Streulicht und Fluoreszenz. Streulicht entsteht, wenn Zellen einfallendes Laserlicht beugen.
Vorwärtsstreulicht (Forward-scatter - FCS) ist proportional zur Zelloberfläche (Zellgröße) und wird entlang der Achse des einfallenden Lichtes gemessen. Seitwärtsstreulicht (Side- scatter - SSC) ist proportional zur Zellkomplexität und -granularität und wird im 90°- Winkel zum einfallenden Licht bestimmt. Zellen können anhand spezifischer Fluoreszenz-Farbstoffe (Fluorochrome) gefärbt werden, so dass nach der Färbung verschiedene zelluläre Eigenschaften analysiert werden können. Das elektronische System im Durchflusszytometer wandelt anschließend das optische Signal in elektrische Signale um und verstärkt sie. Die erzeugten elektrischen Signale sind proportional zur Intensität des einfallenden Lichtes und werden über einem Wandler in digitale Signale umgewandelt, die am Computer weiterverarbeitet werden können. Dieses System ist für die Digitalisierung und die Computer- analyse unabdingbar.
3.8.1 Durchflusszytometrie in der Zellzyklusanalyse
Von den verschiedenen, heutzutage verwendeten Methoden der Zellzyklusanalyse, basiert die am häufigsten eingesetzte Methode auf der Färbung der Zellen mit DNA-spezifischen Fluorochromen. Aus der erhaltenen Menge von Fluoreszenz/DNA kann, unter Verwendung mathematischer Modelle, der Anteil der Zellen aus einer bestimmten Probe berechnet werden, welcher sich zu einem bestimmten Zeitpunkt in den unterschiedlichen Zellzyklusphasen befindet. Der für die Analyse des Zellzyklusses am häufigsten verwendete Fluoreszenz- farbstoff ist das Propidiumiodid (PI) (KRISHAN 1975). Dieser Farbstoff kann sich in die Doppelhelix der DNA zwischen benachbarte Basenpaare einschieben und in diese interkalieren. Da in den einzelnen Zellzyklusphasen ein unterschiedlicher Gehalt an DNA
