Zellkulturtechniken

Das Auftauen von in Stickstoff gefrorenen Zellen erfolgte schnell bei 37°C, woraufhin sie sofort in 5 ml Medium suspendiert, durch niedrigtourige Zentrifugation (1000 rpm, 5 min) pelletiert und mit frischem Medium in Flaschen ausgesät wurden.

3.2.2.3 Die Präparation und Kultur primärer Leberzellkulturen der fötalen Ente Herkunft und Bebrütung der Eier

Befruchtete Pekingenteneier wurden von der Firma GEPRO GmbH – Geflügelzucht – in Molbergen-Ermke bezogen. Nach Ankunft der unbebrüteten Eier wurden diese noch für maximal weitere 3 Wochen bei 4°C unter Luftabschluss bis zur Verwendung gelagert. Zur Bebrütung wurden die Eier in einen Brutschrank mit 37°C und konstanter Luftfeuchtigkeit von 60% überführt und dort für 21 Tage inkubiert. Mithilfe einer speziellen Lampe konnten ab dem 10. Bebrütungstag durch sogenanntes „Schieren“ erste Blutgefäße sichtbar gemacht und Eier, in denen sich keine Kücken entwickelten, aussortiert werden.

Die Eier der eigenen DHBV-positiven Enten wurden genau wie die von GEPRO bezogenen behandelt, jedoch speziell gekennzeichnet.

Präparation der Entenlebern

Generell wurden Präparation und Infektion von PDLCs nach Angaben von J. Köck (Köck and Schlicht, 1993) und M. Bruns (Bruns et al., 1998) durchgeführt.

Bebrütete Enteneier wurden mit Ethanol von außen desinfiziert und die Schale mit einer kleinen Schere etwa 2 cm unterhalb des stumpfen Endes durchstochen. Anschließend konnte ein Deckel abgeschnitten werden, der das Ei weit genug öffnete, um den Entenfötus mithilfe einer Pinzette herauszuheben. Der Fetus wurde in eine sterile Petrischale verbracht und sofort dekapitiert. Austretendes Blut wurde für einen Serumtest auf DHBV-Infektion (siehe unten) eingesammelt. Dieser war notwendig, da DHBV in allen Entenpopulationen verbreitet ist und sich auch unter den von GEPRO bezogenen Eiern kongenital infizierte befanden. Dann wurden die Federn der Bauchseite entfernt und ein kleiner horizontaler Schnitt oberhalb der Kloake durch die Bauchdecke geführt. Von dieser Öffnung aus wurden zwei weitere V-förmige Schnitte rechts und links des Abdomens gesetzt, die das Hochklappen der gesamten Bauchdecke ermöglichten und die inneren Organe freilegten.

Die Leberlappen wurden herausgeschnitten und in einer separaten Petrischale mit einer Schere mechanisch zerkleinert. Die Leber wurde darauf hin sofort in Kollagenaselösung (0,5% Kollagenase in Williams’ Medium E, steril filtriert) verbracht und darin bei 30°C für 1 h mit gelegentlichem Schütteln verdaut.

Um Kontaminationen und Infektionen während der Präparation zu vermeiden, wurde jedes Ei auf einer neuen, sauberen Unterlage geöffnet, für jeden Fötus und dessen Leber eine neue, sterile Petrischale verwendet und das Sezierbesteck nach jeder Sektion durch Abflammen mit Ethanol desinfiziert.

Aufarbeitung der Entenleberzellen für die Zellkultur

Nach dem Kollagenaseverdau wurden die Leberzellen durch niedrigtourige Zentrifugation von 800 rpm in 5 min pelletiert. Das Zellpellet wurde dreimal mit jeweils 5 ml Williams’

Medium E (WE) gewaschen und anschließend in WE-komplett (100 U/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin und 1 mM Glutamin, 1 nM Insulin, 10 µM Hydrocortison, 15 mM Hepes [pH 7,2], 1,5% DMSO) aufgenommen. In der Regel wurde an diesem Punkt das Ergebnis des Serumtests abgewartet, bevor negative und positive Entenzellen mehrerer Lebern jeweils gemischt und ausgesät wurden. Auf diese Weise wurden Kulturen primärer Entenleberzellen (engl.: primary duck liver cells, PDLCs) erhalten. Da der auf 1 h beschränkte Kollagenaseverdau keine für die mikroskopische Auszählung ausreichende Vereinzelung der Zellen verursacht, ein längerer Verdau jedoch die Infektion verhindert, wurde die erforderliche Dichte der Zellaussaat anhand einer einmaligen Beispielzählung geschätzt. Wurden die Zellen einer Entenleber je nach Größe auf zwei bis drei 6-Loch-Platten verteilt, so wurde von einer Zellzahl von circa 1x10⁶ pro Loch ausgegangen. In eine 75 cm²-Zellkulturflasche wurde 2/3 einer Leber ausgesät.

Markierung von LSECs mit acetyliertem LDL

Acetyliertes Lipoprotein niedriger Dichte (engl.: acetylated low density lipoprotein, acLDL) wird spezifisch von LSECs und etwas schwächer von Makrophagen aufgenommen. Um LSECs in der Entenleberzellkultur sichtbar zu machen, wurden pro Loch einer 12-Loch-Platte 2 µl fluoreszenzmarkiertes acLDL direkt in das Medium gemischt. Die Zellen wurden dann 2 h bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Anschließend wurde der Zellrasen gewaschen, und markierte Zellen konnten unter dem Fluoreszenzmikroskop dokumentiert werden. Die Signale der acLDL-Markierung waren auch nach einer anschließenden Immunzytochemie noch sichtbar.

Einfrieren von Entenlebern und Anfertigung von Gefrierschnitten

Für die Kryokonservierung wurden die herauspräparierten Leberlappen einer fötalen Ente kurz in PBS gespült und dann in Tissue-Tek OCT-Compound eingebettet. Die

eingebetteten Lebern wurden langsam in flüssigem Stickstoff getaucht, bis das Einbettmedium vollständig weiß war, und dann bei -80°C gelagert.

Die Anfertigung der Gefrierschnitte für die Immunhistochemie erfolgte mithilfe eines Kryotoms von Leica. Die eingebetteten Lebern wurden auf eine Temperatur von -20°C erwärmt und auf dem Sockel des Kryotoms mit Tissue-Tek befestigt. Bei einer Kammertemperatur von -18°C und einer Objekttemperatur von -12°C wurden Dünnschnitte von 5 µm oder 10 µm angefertigt, die auf Objektträger aufgezogen wurden.

Die Schnitte wurden kurz luftgetrocknet und dann kurz in Aceton anfixiert. Bis zur Verwendung wurden die Schnitte bei -80°C gelagert.

3.2.2.4 Ernte von Zellen

Sollten Zellen als Pellet geerntet werden, wurde der Zellrasen zweimal mit PBS gewaschen. Dann wurden die Zellen mithilfe eines Zellschabers in etwas PBS von der Kulturschale gelöst, vereinzelt und in ein Reaktionsgefäß überführt. Durch niedrigtourige Zentrifugation bei 3000 rpm wurden die Zellen pelletiert und nochmals mit PBS gewaschen, wobei die Zellzahl eines Lochs auf mehrere Aliquots aufgeteilt werden konnte.

Nach erneutem Pelletieren wurden die Zellen entweder sofort in dem gewünschten Puffer lysiert oder bei -20°C gelagert.

3.2.2.5 Transfektion

Die Transfektion von eukaryotischen Zellen diente der Einbringung und Expression von Transgenen in Form von Plasmid-DNA.

Lipofektion

Die Lipofektion ist eine Transfektionsmethode, bei der negativ geladene DNA-Moleküle durch elektrostatische Wechselwirkung an kationische Lipide binden. Es bildet sich ein DNA-Liposomen-Komplex, welcher mit der ähnlich aufgebauten Zellmembran fusioniert.

Die DNA gelangt so ins Zellinnere und schließlich in den Zellkern, wo sie transkribiert wird. Mit dieser Methode erreicht man für viele Zelllinien eine höhere Transfektionseffizienz als mit der Kalziumphosphatpräzipitation.

Zum Einsatz kam FuGENE 6, eine Mischung aus verschiedenen Lipiden. Nach den Angaben des Herstellers wurden FuGENE 6 und die Plasmid-DNA im Verhältnis 3:1 in serumfreiem Medium gemischt und für 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Der Transfektionsansatz wurde auf die Zellen pipettiert und durch Schwenken verteilt. Ein Mediumwechsel erfolgte 16 h später.

Transfektion mithilfe kationischer Polymere

Eine Klasse von Polymertransfektionsreagenzien stellen Polyethylenimin (PEI) und seine Konjugate, lineares PEI oder auch Chitosan dar. Sie haben eine hohe, einheitliche, positive Ladungsdichte und sind fähig, die DNA zu kondensieren und in eine Vielzahl von Zellen einzubringen. Im Gegensatz zu kationischen Lipiden können gewisse synthetische Polymere die DNA im Zytoplasma schützen und sind bekannt dafür, den Eintritt in den Kern zu fördern. Als Transfektionsreagenz kam jetPEI, ein lineares Polyethylenimin, zum Einsatz. Es wurde beobachtet, dass mit diesem Reagenz vor allem bei HuH7-Zellen die Transfektionseffizienz höher war als mit kationischen Lipiden. JetPEI kompaktiert DNA in positiv geladene Partikel, die mit den anionischen Proteoglykanen der Zelloberfläche interagieren und durch Endozytose in die Zelle gelangen. Zugleich puffert jetPEI den endosomalen pH-Wert und schützt die DNA damit vor Degradation. Ein kontinuierlicher Protoneneinstrom führt schließlich zum Platzen der Endosomen und zur Freisetzung der DNA-Partikel.

Nach den Angaben des Herstellers wurden die zu transfizierenden Zellen am Vortag so angesetzt, dass zum Zeitpunkt der Transfektion eine Konfluenz von 50-60% erreicht war.

Zwei Stunden vor der Transfektion wurde ein Mediumwechsel durchgeführt. DNA und jetPEI wurden im vom Hersteller empfohlenen Verhältnis N/P = 5 separat in 150 mM NaCl verdünnt. Das N/P-Verhältnis beschreibt die Anzahl an Stickstoff-Resten des jetPEI pro DNA-Phosphat nach der folgenden Formel.

5 , 7

/ ) 3

( gDNA N P Verhältnis jetPEI

l = µ × × −

µ

Die jetPEI-Lösung wurde zur DNA-Lösung gegeben, kräftig gemischt und der Ansatz 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde der Transfektionsansatz auf die Zellen pipettiert und durch Schwenken im Medium verteilt. 16 h nach der Transfektion erfolgte wieder ein Mediumwechsel.

Es stellte sich heraus, dass die Transfektion von HuH7-Zellen mit Plasmid-DNA in einer Lösung mit linearem Polyethylenimine (PEI) allein fast ebenso effektiv ist, wie die Transfektion mit jetPEI. Hierfür wurde 1 mg/ml PEI in heißem Wasser gelöst und steril filtriert. DNA und PEI-Lösung wurden in einem Verhältnis von 1µg zu 6 µl in serumfreiem Medium gemischt, 15 min bei Raumtemperatur inkubiert und auf die Zellen gegeben. Ein Mediumwechsel erfolgte 16 h nach der Transfektion.

Produktion von Viruspartikeln durch Transfektion von HuH7-Zellen

Die Transfektion von HuH7-Zellen für die Produktion von Viruspartikeln erfolgte mit jetPEI bzw. PEI einen Tag nach der Zellaussaat. Am Tag nach der Transfektion wurde das Medium der Zellen gewechselt. Am darauf folgenden Tag wurde ein zweiter Mediumwechsel durchgeführt. Dieses Medium enthielt Glutamin, Penicillin und Streptomycin, wie das Komplettmedium, aber kein FCS. Die Zellen wurden weitere 3 Tage in diesem Medium kultiviert, bevor sowohl das Medium als auch die Zellen für weitere Analysen geerntet wurden.

Andere Transfektionsreagenzien im Einsatz

Um die Transfektionseffizienz auf primären Leberzellen der fötalen Ente zu optimieren, kamen noch folgende andere Transfektionsreagenzien nach den Angaben der Hersteller zur Anwendung: MATra-A Reagenz (Magnettransfektion), TransPass (Lipofektion) und jetPEI Gal, Man und RGD (Polymere).

3.2.2.6 Radioaktive Markierung von Zellen

Die Markierung von Zellen mit radioaktivem Phosphor dient dazu, Phosphovarianten von Proteinen (hier DHBc) nach Immunpräzipitation ohne die Verwendung von phosphospezifischen Antikörpern darstellen zu können.

HuH7-Zellen wurden 24 h nach der Transfektion mit phosphatfreiem Medium gewaschen und weiterhin in phosphatfreiem Medium kultiviert, wobei in eine 10 cm-Schale jeweils 3 mCi radioaktive Phosphorsäure (Phosphorus-32) zugegeben wurde. Nach einer Über-Nacht-Inkubation, während der der Einbau des radioaktiven Phosphats in die Phosphoproteine erfolgt, wurden die Zellen gewaschen, durch Abschaben geerntet und für die Immunpräzipitation lysiert.